胡海巖,王華民,林英姿,楊 文,王永霞△

(海南醫(yī)學(xué)院：1.臨床學(xué)院；2.熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)院，?？?571109)

·論著·

紅樹(shù)林淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)小鼠DCs吞噬功能的影響*

胡海巖1,王華民2,林英姿2,楊 文2,王永霞2△

(海南醫(yī)學(xué)院：1.臨床學(xué)院；2.熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)院，海口 571109)

胞外多糖；淡紫擬青霉；樹(shù)突細(xì)胞；成熟；免疫功能

樹(shù)突細(xì)胞(DCs)作為體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞，不僅是介導(dǎo)固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，也是唯一能活化初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞[1-3]。未成熟DCs由于高表達(dá)Toll樣受體(TLR)等[4]，獲取抗原的能力較強(qiáng)，但刺激T細(xì)胞活化的能力弱；病原體等抗原刺激可活化DCs，促使其分化成熟，成熟DCs識(shí)別抗原能力減弱，但由于高表達(dá)主要組合相容性復(fù)合體(MHC Ⅱ)類(lèi)分子、CD86、CD80等分子，提呈抗原的能力及活化T細(xì)胞的能力增強(qiáng)[5-6]。因此，通過(guò)調(diào)控體內(nèi)DCs的成熟狀態(tài)，可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，達(dá)到預(yù)防或治療疾病的目的。

課題組前期從海南沿海紅樹(shù)林中分離獲得一株真菌，鑒定為淡紫擬青霉，體外試驗(yàn)證實(shí)其產(chǎn)生的胞外多糖有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬功能并刺激T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[7]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討該多糖對(duì)小鼠骨髓源性DCs成熟及功能的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供6～8周齡BALB/c小鼠，雄性。

1.2試劑及藥物 胞外多糖用ddH2O配成20 g/L母液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后分裝，-20 ℃凍存。APC標(biāo)記的抗小鼠CD11c單克隆抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠MHC Ⅱ單克隆抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠CD80單克隆抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD86單克隆抗體及FITC-dextran購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。

1.3儀器 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，TC-512型PCR儀(英國(guó)Techne公司)，DYY-12C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，凝膠圖像分析儀(英國(guó)Syngene公司)，生物安全柜(SG403A-HE，美國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(NU-4750E，美國(guó))，倒置顯微鏡(深圳拓天儀器設(shè)備有限公司)，電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)等。

1.4方法

1.4.1小鼠骨髓源性DCs誘導(dǎo) 取6～8周齡雄性BALB/c小鼠40只，SPF級(jí)，頸椎脫臼處死， 浸泡于75%乙醇中，10 min后無(wú)菌手術(shù)取股骨和脛骨，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗骨髓腔以獲取骨髓細(xì)胞，細(xì)胞懸液離心后重懸細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，PBS洗3次，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含10 ng/mL rmGM-CSF和10 ng/mL rmIL-4)調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，加入6孔板，每孔3 mL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附3 h后除掉未貼壁細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)液，隔日半量換液，培養(yǎng)至第6天收集誘導(dǎo)的未成熟DCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2多糖對(duì)DCs表面分子表達(dá)的影響 將獲得的小鼠骨髓細(xì)胞用RPMI-1640維持液稀釋成1×106/mL，接種于12孔板，每孔2 mL。用5個(gè)不同濃度梯度的多糖干預(yù)，即用終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/mL的多糖處理細(xì)胞，每一濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照孔加等量的RPMI-1640維持液，隔天觀察細(xì)胞形態(tài)，48 h后收獲細(xì)胞，PBS洗滌3次，其中每一濃度中4復(fù)孔細(xì)胞用于TLR2 mRNA 和TLR4 mRNA表達(dá)的檢測(cè)，其余細(xì)胞調(diào)整濃度為1×106/mL，于細(xì)胞懸液中分別加入PE-CD80、FITC-CD86和 APC-CD11c、PE-MHC Ⅱ，4 ℃染色標(biāo)記 30 min，洗滌3次，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3多糖對(duì)未成熟DCs吞噬功能的影響 將小鼠骨髓細(xì)胞配制成1×106/mL，加入12孔板中，每孔2 mL，分別加入不同濃度多糖，使終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/mL，每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集各孔細(xì)胞置37 ℃孵育30 min，加入終濃度為1 mg/mL的葡聚糖(FITC-dextran)，置37 ℃孵育4 h，再于4 ℃作用1 h后流式檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表達(dá)的影響 總RNA抽提及cDNA制備：取1.2.2中收獲的細(xì)胞，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲得cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

常規(guī)PCR：按下表配制PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,TLR2、TLR4和β-action反應(yīng)體系均為(引物序列見(jiàn)表1,由上海Sangon公司合成)：10×buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，2.5 U/μL TaqDNA聚合酶 0.3 μL，ddH2O 12.6 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)各條帶光密度值，分析目的基因條帶與內(nèi)參條帶光密度值的比值。

表1 TLR2、TLR4和β-action引物序列

2 結(jié) 果

2.1小鼠骨髓源性DCs誘導(dǎo) 小鼠貼壁的骨髓細(xì)胞經(jīng)rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)24 h 后，可見(jiàn)圓形、大小均勻的懸浮細(xì)胞。培養(yǎng)至第3天，可見(jiàn)疏松黏附與貼壁的細(xì)胞集落產(chǎn)生，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。培養(yǎng)至第5天，部分細(xì)胞呈不規(guī)則狀，見(jiàn)圖1。

圖1 倒置顯微鏡下不同時(shí)間DCs形態(tài)變化

2.2多糖對(duì)DCs表面分子表達(dá)的影響 未成熟DCs經(jīng)不同濃度多糖干預(yù)48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所用濃度多糖均可刺激DCs 對(duì)CD11c、MHC-Ⅱ類(lèi)分子、CD80和CD86的表達(dá)，且刺激效果呈劑量依賴性。經(jīng)終濃度為50、100、200 μg/mL的多糖刺激后，CD11c、MHC Ⅱ雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(27.5±1.0)%、(29.7±1.1)%、(35.9±2.1)%，與空白對(duì)照組(25.5±0.9)%相比無(wú)明顯差異(P>0.05)，當(dāng)多糖終濃度達(dá)300、400 μg/mL時(shí)CD11c、MHC Ⅱ雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率達(dá)(45.8±1.6)%和(54.4±1.3)%，明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)；該多糖亦可刺激DCs CD80和CD86的表達(dá)，糖終濃度為50、100、200、300、400 μg/mL時(shí)CD80、CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(29.6±1.2)%、(33.1±1.7)%、(42.3±1.5)%、(53.6±1.4)%、(60.8±0.5)%，其中50、100 μg/mL終濃度多糖作用下CD80、CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率與空白對(duì)照組[(25.9±1.2)%]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；200 μg/mL多糖作用下CD80、CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，300、400 μg/mL多糖作用下CD80、CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明終濃度為200、300、400 μg/mL多糖對(duì)DCs分化成熟的刺激作用較好，結(jié)果見(jiàn)圖2。

#：P>0.05,*:P<0.05,△：P<0.01,與空白對(duì)照組比較

圖2淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs表達(dá)CD11c、 MHC-Ⅱ、CD80和CD86分子的影響

圖3 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs吞噬能力影響的部分流式圖

2.3多糖對(duì)未成熟DCs吞噬功能的影響 小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)不同濃度多糖處理48 h后，吞噬FITC-dextran的能力逐漸下降， 50、100、200 μg/mL糖濃度時(shí)陽(yáng)性吞噬細(xì)胞百分率分別為(31.5±1.3)%、(28.9±1.4)%和(26.0±1.4)%，與空白對(duì)照組[(34.6±1.1)%]相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)糖濃度達(dá)300、400 μg/mL時(shí)陽(yáng)性吞噬細(xì)胞百分率明顯降低，分別為(20.6±1.0)%、(17.8±1.5)%，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明終濃度300 μg/mL和400 μg/mL的多糖對(duì)DCs成熟的刺激作用較強(qiáng)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

*：P>0.05;#：P<0.05，與空白對(duì)照組比較

圖4淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs吞噬能力的影響

2.4淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表達(dá)的影響 將不同濃度多糖作用于未成熟DCs 48 h后RT-PCR檢測(cè)TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)終濃度為50～400 μg/mL多糖作用的DCs TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)逐漸降低，50 μg/mL多糖作用下DCs TLR2、TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.818±0.112、0.644±0.083，與空白對(duì)照組相比(0.864±0.071、0.685±0.002)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，100、200、300、400 μg/mL多糖作用下TLR2、TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.757±0.062、0.533±0.096，0.663±0.053、0.508±0.023，0.425±0.081、0.482±0.041、0.386±0.121、0.425±0.078，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5、6。

#：P>0.05;*：P<0.05，與空白對(duì)照組比較

圖5淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表達(dá)的影響

泳道1：空白對(duì)照組，泳道2～6：50、100、200、300、400 μg/mL多糖處理組

圖6 DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA RT-PCR電泳圖

3 討 論

多糖類(lèi)化合物含有豐富的生物信息，被認(rèn)為是除肽鏈、核苷酸鏈之外具有重大意義的第3鏈，幾乎參與了細(xì)胞所有生命活動(dòng)。作為紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)中的第二大微生物資源，紅樹(shù)林真菌長(zhǎng)期生活在強(qiáng)酸、寡營(yíng)養(yǎng)、高鹽的海洋環(huán)境中，必然有其獨(dú)特的分子適應(yīng)機(jī)制，具備產(chǎn)生不同于陸生微生物的獨(dú)特新穎代謝產(chǎn)物的潛能，成為活性多糖的新來(lái)源[8-10]。本研究用紅樹(shù)林來(lái)源的淡紫擬青霉胞外多糖刺激小鼠骨髓源性DCs，觀察其對(duì)DCs成熟的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)多糖在所用濃度范圍內(nèi)均可刺激DCs 分化成熟，具體表現(xiàn)為促進(jìn)DCs 表面分子CD11c、MHC Ⅱ類(lèi)分子及協(xié)同刺激分子CD80、CD86的表達(dá)，終濃度300 μg/mL和400 μg/mL的多糖刺激作用最強(qiáng)，CD11c、MHC Ⅱ雙陽(yáng)性細(xì)胞和CD80、CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD11c 為DCs特征性標(biāo)志，MHC Ⅱ類(lèi)分子參與抗原肽的提呈并誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生，CD80、CD86作為協(xié)同刺激分子，是T細(xì)胞活化的第二信號(hào)，DCs成熟時(shí)顯著上調(diào)MHC Ⅱ類(lèi)分子、CD80、CD86等表面分子的表達(dá)，說(shuō)明多糖對(duì)DCs的成熟具有刺激作用[11-12]。隨著DCs成熟其吞噬異物的能力大大降低，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)該多糖處理的DCs吞噬FITC-dextran的能力降低，尤其經(jīng)300、400 μg/mL多糖作用的DCs陽(yáng)性吞噬細(xì)胞百分率與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明300、400 μg/mL的多糖可顯著促進(jìn)DCs成熟。該多糖還可下調(diào)DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表達(dá)，尤其100～400 μg/mL多糖作用效果明顯，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而TLR2和TLR4作為T(mén)LRs家族的成員，為重要的模式識(shí)別受體，部分多糖刺激的非特異性免疫反應(yīng)可能通過(guò)TLR2和/或TLR4介導(dǎo)[13-14]。另外，課題組還發(fā)現(xiàn)該多糖可刺激IL-12分泌，IL-12可誘導(dǎo)Th0分化為T(mén)h1，參與Th1反應(yīng)[15]，進(jìn)一步說(shuō)明該多糖能刺激DCs成熟。

總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)紅樹(shù)林淡紫擬青霉胞外多糖具有刺激小鼠骨髓源性DCs分化成熟的作用，不僅可刺激DCs 表面分子CD11c 、MHC Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)，還可刺激協(xié)同刺激分子CD80和CD86分子的表達(dá)，抑制其對(duì)異物的吞噬作用，下調(diào)TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表達(dá)，但作用機(jī)制不明，仍需進(jìn)一步研究。

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EffectsofextracellularpolysaccharidesfromPaecilomycesLilacinusononphagocytosisfunctionofmousebonemarrow-deriveddendriticcells*

HuHaiyan1,WangHuamin2,LinYingzi2,YangWen2,WangYongxia2△

(1.ClinicalMedicalCollege;2.SchoolofTropicalMedicineandLaboratoryMedicine,HainanMedicalUniversity,Haikou,Hainan571109,China)

extracellular polysaccharides;Paecilomyces Lilacinuson;murine dendritic cells;maturation;immunologic function

目的探討紅樹(shù)林來(lái)源的淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)小鼠骨髓源性樹(shù)突細(xì)胞(DCs)功能成熟的影響。方法從小鼠骨髓腔中分離獲得骨髓細(xì)胞，加入重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重組小鼠白細(xì)胞介素-4(rmIL-4)誘導(dǎo)分化為未成熟DCs，用不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖干預(yù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs的表面標(biāo)志CD11c、主要組合相容性復(fù)合體(MHCⅡ) 類(lèi)分子、CD80、CD86的表達(dá)情況及吞噬葡聚糖(FITC-dextran)的能力，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)該多糖對(duì)DCs Toll樣受體(TLR)2 mRNA和TLR4 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果經(jīng)300、400 μg/mL多糖作用48 h后DCs 表面分子CD11c、MHC Ⅱ類(lèi)分子、CD80、CD86的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.01)；經(jīng)多糖作用的DCs吞噬FITC-dextran能力下降，尤其是300、400 μg/mL的多糖與空白對(duì)照組相比作用效果明顯(P<0.05)；另外，該多糖還可下調(diào)DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表達(dá)，尤其經(jīng)100～400 μg/mL多糖處理的DCs下調(diào)作用顯著，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論淡紫擬青霉胞外多糖可上調(diào)小鼠骨髓源性未成熟DCs表面 CD11c、MHC Ⅱ類(lèi)分子、CD80和CD86的表達(dá)，降低其吞噬能力，下調(diào)TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表達(dá)，初步表明該多糖可刺激DCs分化成熟。

R392.9

A

1671-8348(2017)31-4321-04

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.001

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31260225)；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(813248)；海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金資助項(xiàng)目(HY2014-015)。

胡海巖(1979-)，講師，本科，主要從事感染免疫及免疫調(diào)節(jié)研究?！?/p>

,E-mai:492608405@qq.com。

ObjectiveTo investigate the effects of Paecilomyces Lilacinuson extracellular polysaccharides on the phenotypic and function maturity of mouse dendritic cells.MethodsMononuclear cells were isolated from the mouse bone marrow cavity and added with cytokines for obtaining the recombinant mouse granulocyte-macrophagocyte colony stimulating factor(rmGM-CSF),recombinant mouse interleukin 4(rmIL-4) was induced to differentiated to immature DCs.Then different concentrations of extracellular polysaccharides were used to conduct the intervention.The mature DCs surface marker CD11c,major histocompatibility complex Ⅱ(MHCⅡ),CD80,CD86 molecular expression and phagocytosing FITC-dextran ability was detected by the flow cytometry.The effect of the polysaccharides on DCs Toll-like receptor(TLR)2 mRNA and TLR4 mRNA expression was detected by RT-PCR.ResultsAfter 400 μg/mL polysaccharides action for 48 h, the expression of DCs surface molecules such as CD11c,MHCⅡ,CD80 and CD86 was significantly up-regulated compared with the blank control group (P<0.05);after the polysaccharides action,the ability of DCs phagocytosing FITC-dextran was decreased,especially the effects of 300,400 μg/mL of polysaccharides were more significant compared with the control group (P<0.05).In addition, the polysaccharides could down-regulate the expression of TLR2 mRNA and TLR4 mRNA in DCs, the DCs down-regulation effect after 100-400 μg/mL polysaccharides treatment, the difference compared with the blank control group was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe extracellular polysaccharides can up-regulate the expression of DCs surface CD11c,MHCⅡ,CD80 and CD 86 molecules,decreases the phagocytosis ability and down-regulates the expression of TLR2 mRNA and TLR4 mRNA,which preliminarily indicates that the polysaccharides could stimulate the differentiation and maturation of murine DCs.

2017-03-18

2017-06-06)