朱林，蒲婧哲，張亞中,，程旺興，金斌

·藥物與臨床·

PCR-RFLP法對(duì)蛇膽川貝散中川貝母的鑒別研究

朱林1，蒲婧哲2，張亞中1,2，程旺興1，金斌2

目的：研究聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性方法(PCR-RFLP法)對(duì)蛇膽川貝散(膠囊)中川貝母鑒定的可行性。方法本實(shí)驗(yàn)選取8個(gè)廠家的蛇膽川貝散(膠囊)作為研究對(duì)象，對(duì)模板DNA的預(yù)處理方法進(jìn)行考察，通過(guò)PCR-RFLP法對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增和酶切。結(jié)果自提樣本中只有川貝母自提樣本的PCR產(chǎn)物可被酶切，8個(gè)廠家成藥樣本的PCR產(chǎn)物均不能被Sma I酶切。結(jié)論P(yáng)CR-RFLP法對(duì)蛇膽川貝散(膠囊)中川貝母的鑒別具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，對(duì)市場(chǎng)上成藥中川貝母的真?zhèn)舞b別提供了較好的依據(jù)。

蛇膽川貝散； 川貝母； PCR-RFLP法； 鑒別； 可行性

蛇膽川貝散(膠囊)處方均由蛇膽汁和川貝母二味藥材組成，制法為川貝母粉碎成細(xì)粉，與蛇膽汁按6∶1的比例混勻，干燥，粉碎。具有祛風(fēng)止咳，除痰散結(jié)的功效，適用于風(fēng)熱咳嗽，痰多氣喘，胸悶，咳痰不爽或久咳不止等癥[1]。由于川貝母市場(chǎng)價(jià)格較高，且貝母屬的一些貝母與川貝母形態(tài)相似、價(jià)格較低，因此市售川貝母替代使用現(xiàn)象嚴(yán)重[2]，常見(jiàn)替代品有以下幾種：浙貝母、湖北貝母、伊犁貝母、新疆貝母、平貝母等。目前，川貝母常用的鑒別方法以性狀鑒別和色譜鑒別為主，但由于貝母屬的一些貝母與川貝母化學(xué)成分較為相似，因此常用的鑒別方法都存在一定的局限性[3-13]。尤其當(dāng)川貝母以原料藥投入至成藥中，鑒別難度加大。近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性方法(以下簡(jiǎn)稱PCR-RFLP法)的研究突飛猛進(jìn)，并廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，提供了一種新的分析方法[14-18]?！吨袊?guó)藥典》2010年版一部增補(bǔ)本中新增了川貝母PCR-RFLP法鑒別，該方法從DNA角度對(duì)貝母進(jìn)行分析鑒別，具有靈敏度高和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)[19]。但目前本方法僅限于藥材鑒定，本研究將此方法應(yīng)用到蛇膽川貝散(膠囊)的成藥當(dāng)中，以考察成藥中川貝母的真?zhèn)吻闆r。本次研究選取8個(gè)廠家的四十余批蛇膽川貝散(膠囊)作為實(shí)驗(yàn)樣本，同時(shí)模擬生產(chǎn)工藝，自提樣本。通過(guò)此方法的研究，首次將PCR-RFLP法應(yīng)用到成藥中，為完善成藥中的川貝母真?zhèn)舞b定方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 PCR儀(ABI)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，分析天平(MettlerAB135-S)，純水儀(Millipore公司)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Syngene Gene Genius)，球磨儀(M400，Retsch)。

1.2 試劑 新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)(天根生化科技(北京)有限公司)，川貝母-R、川貝母- F引物(華大基因)，TaKaRa EX Taq酶(RR01AM；TaKaRa)，Sma I限制性內(nèi)切酶(1085A；TaKaRa)，核酸染料Genegreen(天根)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)。

2 方法

2.1 樣本

2.1.1 實(shí)驗(yàn)中所用成藥來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)所用的樣本，來(lái)自于8個(gè)廠家生產(chǎn)的蛇膽川貝散(膠囊)成藥。陽(yáng)性對(duì)照選取川貝母中的暗紫貝母(批號(hào)121000-201007)。見(jiàn)表1。

表1 樣本信息及來(lái)源

2.1.2 自提樣本 本實(shí)驗(yàn)?zāi)M蛇膽川貝散(膠囊)的生產(chǎn)工藝，分別取川貝母、平貝母、浙貝母、伊貝母、湖北貝母的對(duì)照藥材與蛇膽汁按蛇膽川貝散(膠囊)組成比例(6∶1)混合，混勻后在80 ℃烘箱中烘30 min，作為自提樣本。見(jiàn)表2。

表2 自提樣本中貝母信息

2.2 模板DNA預(yù)處理方法考察 方法一：將自提樣本及成藥加50%乙醇超聲10 min，離心，棄去上清液，沉淀分別加水30 mL，混勻，離心3次，棄去水液，將沉淀置80℃烘箱中烘30min，取出，研細(xì)，即得。方法二：取自提樣本及成藥粉末，研細(xì)，即得。經(jīng)考察，方法一與方法二結(jié)果一致，不經(jīng)預(yù)處理結(jié)果無(wú)干擾，故樣本直接進(jìn)行DNA提取。成藥經(jīng)不同預(yù)處理方法的PCR結(jié)果，見(jiàn)圖1。

1:DNA分子標(biāo)記(DNA molecular marker)(100bp、250bp、500bp); 2: 陰性; 3～4: 陽(yáng)性對(duì)照;5: Z1(方法一); 6: Z2(方法一); 7: Z3(方法一); 8: Z4(方法一); 9: Z1(方法二); 10: Z2(方法二); 11: Z3(方法二); 12: Z4(方法二);

圖1 成藥預(yù)處理方法考察PCR擴(kuò)增凝膠成像圖

2.3 DNA提取 取粉末20 mg，按照新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)(天根生化科技(北京)有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，得供試品溶液，置零下20℃冰箱備用。另取川貝母陽(yáng)性對(duì)照20 mg，精密稱定，同法制成陽(yáng)性對(duì)照模板DNA溶液。

3 PCR反應(yīng)條件

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了2個(gè)不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行條件優(yōu)化：

體系一：總體積為30 μL，反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液3 μL，dNTP(10 mmol/L)0.4 μL，二氯化鎂(25 mmol/L)2 μL，鑒別引物(30 μmol/L)各0.5 μL，DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板2 μL，滅菌超純水21.4 μL；體系二：總體積為30 μL，反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液3 μL，dNTP(10mmol/L)0.4 μL，二氯化鎂(25 mmol/L)2 μL，鑒別引物(30 μmol/L)各0.3 μL，DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板2 μL，滅菌超純水21.8 μL。對(duì)2種體系進(jìn)行比較，使用反應(yīng)體系一的擴(kuò)增結(jié)果較好，故本次實(shí)驗(yàn)選擇體系一作為PCR反應(yīng)體系。循環(huán)次數(shù)的考察：本實(shí)驗(yàn)對(duì)循環(huán)次數(shù)設(shè)計(jì)了4個(gè)不同的梯度進(jìn)行比較，以優(yōu)化擴(kuò)增程序，次數(shù)為25次、30次、35次、40次。結(jié)果循環(huán)次數(shù)為30次的擴(kuò)增效果最佳，故本次實(shí)驗(yàn)選擇30次為循環(huán)次數(shù)。退火溫度的考察：本實(shí)驗(yàn)對(duì)退火溫度設(shè)計(jì)了5個(gè)不同的梯度進(jìn)行比較，以優(yōu)化擴(kuò)增程序，溫度為55 ℃,58 ℃,60 ℃,62 ℃,65 ℃。結(jié)果退火溫度為62 ℃的條帶最清晰，故本次實(shí)驗(yàn)選擇62 ℃為退火溫度。

3.1 鑒別引物 上游：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3’；下游：5’-GCTACGTTCTTCATCGAT-3’。

3.2 酶切反應(yīng)體系 取PCR反應(yīng)液，在200 μL離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體系為20 μL，反應(yīng)體系包括10×酶切緩沖液2 μL，PCR反應(yīng)液6 μL，Sma I(10 U/μL)0.5 μL，BSA 2 μL，滅菌超純水9.5 μL。酶切反應(yīng)參數(shù)：30℃，2 h。

3.3 瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像 使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓150 V，約30 min，電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上檢視。

4 結(jié)果

4.1 PCR-RFLP法實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在自提樣本中，只有川貝母的自提樣本PCR產(chǎn)物能夠被限制性內(nèi)切酶Sma I切成2個(gè)片段，大小在100～250 bp，其它貝母自提樣本，均不能被Sma I酶切。見(jiàn)圖2自提樣本PCR-RFLP凝膠成像結(jié)果圖；8個(gè)廠家成藥樣本的PCR產(chǎn)物均不能被Sma I酶切，見(jiàn)圖3成藥PCR-RFLP凝膠成像結(jié)果圖。

1-2:川貝母陽(yáng)性對(duì)照;3:PBZT;4:ZBZT;5:HBZI;6:YBZT;7:青貝;8:松貝;9:太白貝母;10:瓦布貝母;11:陰性;12:DNA分子標(biāo)記(100bp、250bp、500bp)

圖2 自提樣本PCR-RFLP結(jié)果圖

1-2:川貝母陽(yáng)性對(duì)照;3:Z1;4:Z2;5:Z3;6:Z4;7:Z5;8:Z6;9:Z7;10:Z8;11:陰性;12:DNA分子標(biāo)記(100bp、250bp、500bp)

圖3 成藥PCR-RFLP結(jié)果圖

4.2 方法檢出限考察 本研究為考察成藥中川貝母的檢出限，選取國(guó)藥集團(tuán)馮了性(佛山)藥業(yè)的蛇膽川貝散為樣本，分別按照5%,25%,50%,75%,100%比例摻入川貝母陽(yáng)性對(duì)照(批號(hào)121000-201007)，制備檢出限實(shí)驗(yàn)樣本。檢出限樣本信息，見(jiàn)表3。每份取20 mg，按照上述PCR-RFLP法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：當(dāng)成藥中含有川貝母的限度為5 %時(shí)，此方法即可適用，PCR-RFLP法檢出限結(jié)果，見(jiàn)圖4。

表3 檢出限樣本的信息

2-3:J1;4-5:J2;6-7:J3;8-9:J4;10-11:J5;12:DNA分子標(biāo)記(100bp，250bp，500bp)

圖4 方法檢出限PCR-RFLP結(jié)果圖

5 討論

成藥中鑒定川貝母的真?zhèn)螁?wèn)題一直是一個(gè)難點(diǎn)。由于蛇膽川貝散(膠囊)成分僅為川貝母與蛇膽汁，且蛇膽汁所占比例較小，故干擾較小，且川貝母為原粉入藥。這也是我們能夠把PCR-RFLP法應(yīng)用到此成藥的前提條件。

通過(guò)8個(gè)廠家的蛇膽川貝散(膠囊)和4批自提樣品，研究PCR-RFLP法對(duì)成藥中川貝母鑒別的可行性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個(gè)廠家蛇膽川貝散(膠囊)的PCR產(chǎn)物均不能被Sma I酶切，只有川貝母自提樣本有酶切條帶。廠家生產(chǎn)的蛇膽川貝散(膠囊)中存在使用貝母屬其它貝母替代川貝母投料使用的可能性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種反應(yīng)體系進(jìn)行了考察，對(duì)循環(huán)次數(shù)和退火溫度進(jìn)行了梯度實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體條件。

雖然PCR-RFLP法對(duì)于川貝母的藥材的鑒別已經(jīng)有不少研究[20-26]，但缺少對(duì)成藥中川貝母摻偽的鑒別，這也增加了本研究的難度。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)的探索與研究，得出了PCR-RFLP法對(duì)成藥中川貝母摻偽的鑒別有著很高的準(zhǔn)確度和靈敏度，為PCR-RFLP法的完善和優(yōu)化作出一定的理論依據(jù)，尤其對(duì)市售蛇膽川貝散(膠囊)及其他成藥中川貝母摻偽的鑒別提供理論依據(jù)，對(duì)市售含川貝母藥品的質(zhì)量有著強(qiáng)有力的督促。

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安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(1501041174)

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，安徽 合肥 230031；2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院 中藥室，安徽 合肥 230051

朱林(1993-)，男，在讀研究生。

程旺興(1971-)，男，教授，博士，E-mail:chengwangxing@gmail.com。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.06.038

R 282.5

A

1008-7044(2017)06-0719-04

2017-05-17)