吳星星（新疆烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心 830063）

一起鴿新城疫感染快速診斷

吳星星（新疆烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心 830063）

為查找引起新疆某養(yǎng)鴿場鴿群突然發(fā)病大量死亡病原，控制疫情蔓延。通過流行病學(xué)和病理解剖觀察，然后采集病死鴿子肝臟、肺臟、喉頭和氣管等臟器組織，提取RNA，分別對其進行禽流感熒光RT-PCR檢測和新城疫RT-PCR檢測。診斷出該鴿場疫情由鴿新城疫病毒感染引起。建議預(yù)防控制好鴿場新城疫的發(fā)生，除日常免疫接種外，全面做好鴿場生物安全防護及研制鴿新城疫專用疫苗更是今后的一個努力方向。

鴿新城疫；RT-PCR；熒光RT-PCR

鴿新城疫俗稱鴿瘟，是流行于鴿群中的一種高度接觸性、敗血性、急性傳染病，由新城疫病毒的一種變異株鴿I型副病毒（Pigeon Paramyx-Ovirus Type I， PPMV-1)引起[1]。該病臨床特征與雞新城疫相似，但主要以腹瀉和神經(jīng)癥狀為主[2-3]，自我國于1985年在進口鴿中首次檢出后，全國各地均有發(fā)生，其中包括新疆[4-5]。該病一年四季以秋冬、冬春多發(fā)，不同品種、年齡的鴿子均可感染，通過塵埃、污染的器具、飼料和飲水等因素迅速傳播，發(fā)病率為80～90%以上，給養(yǎng)鴿業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，目前已成為養(yǎng)鴿業(yè)重點防控的傳染病。一般通過臨床癥狀和剖檢病變可對該病作出初步診斷，但要確診還需借助實驗室診斷。用傳統(tǒng)方法診斷鴿I型副病毒感染需要作病原分離鑒定，其過程需經(jīng)多次雞胚傳代，費時費力，常耽誤疫情控制的寶貴時機，給養(yǎng)鴿業(yè)造成慘重的經(jīng)濟損失[6]，而近年來發(fā)展起來的RT-PCR檢測技術(shù)操作方便結(jié)時、檢測特性敏感、特異可實現(xiàn)該病的快速診斷，非常適宜基層推廣使用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料

新疆某養(yǎng)鴿場病死鴿子的肝臟、肺臟、喉頭和氣管等臟器組織。

1.1.2 設(shè)備及試劑

熒光PCR儀，梯度PCR儀均購自美國ABI公司、組織研磨儀購自法國Bertin公司、高速冷凍離心機購自德國Sigma公司、禽流感熒光RT-PCR檢測試劑盒購自深圳凱杰生物技術(shù)有限公司，新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀(jì)元亨生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)病情況及流行病學(xué)調(diào)查

該鴿場共飼養(yǎng)鴿子7000羽，冬季11月份經(jīng)本地引進一批乳鴿，隨后鴿群出現(xiàn)大批量死亡，達3500羽。病鴿臨床癥狀表現(xiàn)為精神萎靡，采食減少，飲水增多，排黃綠色稀薄糞便，部分病鴿出現(xiàn)兩翅下垂、頭頸歪斜、站立不穩(wěn)或臥地不起等一系列神經(jīng)癥狀。

1.2.2 病理剖檢變化

病死鴿肛門周圍及腹部后驅(qū)羽毛粘黃綠色稀糞，胸、頸部皮下出血，腺胃乳頭出血，腸道彌漫性出血，腸系膜淋巴結(jié)出血水腫，喉頭、氣管內(nèi)有漿液物質(zhì)滲出，肺、氣管充血、出血，肝臟腫大，出血、瘀血嚴重。

1.2.3 實驗室診斷

根據(jù)鴿群疫病流行特征，結(jié)合臨床癥狀及病理解剖變化，采集病變明顯的臟器組織，同時進行禽流感與新城疫病毒的分子生物學(xué)檢測。

（1）病毒總RNA的提取

將采集的病死鴿肝臟、脾臟、肺臟等組織與PBS稀釋液(pH=7.2)按1∶8比例混合，用研磨器將組織徹底研磨，放于高速冷凍離心機中，8000rpm/h，離心8min后取出，吸取離心上清液，按照商品化試劑盒操作說明，提取病毒總RNA備用。

（2）禽流感病毒熒光RT-PCR擴增

取一滅菌離心管，根據(jù)反應(yīng)配置體系，分別加入反應(yīng)液，熒光探針、酶以及核酸，混合均勻成25ul體系，置于熒光PCR反應(yīng)儀中，反應(yīng)作用90min，結(jié)果判定：CT值為none的樣本為陰性。CT值≤30.0的樣本為陽性，CT值＞30.0的樣品建議重做，重做結(jié)果CT值為none為陰性，否則為陽性。

（3）新城疫RT-PCR擴增

取滅菌的離心管，根據(jù)反應(yīng)配置體系，分別加入反應(yīng)液，DNA聚合酶及反轉(zhuǎn)錄酶以及核酸，混合均勻成25ul體系，置于熒光PCR反應(yīng)儀中，反應(yīng)作用2h，讀取的結(jié)果如圖2所示。結(jié)果判定：出現(xiàn)362bp大小條帶的樣本為陽性，未出現(xiàn)362bp大小條帶的樣本為陰性。

1.3 結(jié)果

對4份鴿內(nèi)臟組織進行禽流感病毒熒光RT-PCR擴增，結(jié)果如圖1顯示：陽性對照成立（CT值=22.14），并出現(xiàn)明顯的S型曲線，而4份組織樣品與陰性對照樣品一致未出現(xiàn)S型擴增曲線，表明4份樣品均不存在禽流感感染。

圖1 禽流感熒光RT-PCR檢測結(jié)果

對4份雞內(nèi)臟組織進行新城疫RT-PCR擴增，結(jié)果如圖2顯示：新城疫陽性對照成立：出現(xiàn)362bp擴增條帶，4份樣品與陽性對照一致也出現(xiàn)362bp擴增條帶，表明4份組織樣品均為新城疫病毒感染。

圖2 新城疫RT-PCR檢測結(jié)果

1.4 處理措施

立即將發(fā)病鴿與健康鴿隔離、撲殺，同時徹底清除病死鴿糞便等排泄物以及污染的飼料、墊料等進行無害化處理，對污染的器具、鴿舍墻面、地面環(huán)境等連續(xù)消毒一周，全場鴿群進行新城疫疫苗緊急免疫接種，同時用多維與黃芪多糖飲水，連用7d。

2 結(jié)果與分析

通過實驗室檢診斷，結(jié)合鴿場流行病學(xué)調(diào)查、臨床表現(xiàn)、病理解剖變化得出，該鴿場不存在禽流感感染，發(fā)生的疫情由鴿新城疫與鴿沙門氏菌混合感染引起。分析具體成因如下。

2.1 乳鴿母源抗體水平低

母源抗體對鴿新城疫免疫應(yīng)答具有很大影響，種鴿經(jīng)過新城疫疫苗接種后，可將其抗體通過卵黃傳遞給乳鴿，乳鴿在3日齡抗體滴度最高，以后逐漸下降，具有母源抗體的乳鴿具有一定的抵抗力，為此推測引進乳鴿的種鴿可能未接種過新城疫疫苗或者雖然接種過疫苗，但由于免疫失敗或引進的乳鴿其母源抗體剛好處于最低水平或消失階段，加上乳鴿自身抵抗力差，可能通過野禽和不良的飼養(yǎng)環(huán)境及方式等一系列內(nèi)外因素導(dǎo)致感染鴿新城疫毒株，再作為傳染源傳染給健康鴿群。

2.2 鴿場缺乏畜禽調(diào)運檢疫知識

引進前未向來源地索取相關(guān)疫病檢疫證明，且未做好自主性本地抽樣檢疫的疫病防范工作，其次生物安全措施不到位，將引進的外觀健康病鴿與原有鴿群做上下樓同樓飼養(yǎng)，未進行完全的隔離飼養(yǎng)觀察，使病原通過空氣、污染的飼料、飲水、用具、病鴿分泌物、排泄物等途徑傳播，這是導(dǎo)致疫情發(fā)生的直接原因。

3 討論

鴿新城疫感染的快速診斷是鴿病防治實踐中的一道難題。而RT-PCR技術(shù)克服了傳統(tǒng)檢測方法費時費力的特性，以其快速、敏感、特異的優(yōu)點為有效進行鴿新城疫的臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查及分子生物學(xué)研究工作開展提供了快速的手段。國內(nèi)王林川等對3個中國廣東鴿新城疫病毒分離株進行了RT-PCR目的條帶的擴增，與預(yù)期擴增結(jié)果一致；劉小銀等從疑似鴿瘟的6例臨床病例中分離到5株鴿新城疫病毒，用RT-PCR方法擴增F蛋白裂解位點的基因片段，并進行克隆、序列測定，分析表明，鴿新城疫的F蛋白的基因片段裂解位點處的3個序列與新城疫強毒在這一區(qū)域序列相符；2008年張兆敏等對成都某鴿場大批死亡，出現(xiàn)下痢和歪頭縮頸等明顯神經(jīng)癥狀臨及剖檢變化有全身性的黏膜和漿膜出血的病死鴿子進行細菌分離鑒定及新城疫RT-PCR檢測，確診為鴿新城疫。閻玉河等根據(jù)NDV基因結(jié)構(gòu)特點及強、弱毒株裂解位點的序列差異設(shè)計2對引物，建立了快速診斷RT-PCR技術(shù)，該方法具有快速、特異、操作簡便等特點，不僅適用于雞胚的檢測，也適用于對病雞組織勻漿液的檢測。該技術(shù)可幫助廣大養(yǎng)鴿業(yè)者迅速準(zhǔn)確的查明病原，及時實施防疫措施控制疫情的發(fā)生蔓延，將經(jīng)濟損失降到最低[6-9]。

目前，在鴿新城疫疫病預(yù)防中，由于專用鴿新城疫疫苗還未見上市，主要使用雞新城疫疫苗進行預(yù)防，但在實際應(yīng)用中，免疫保護效果往往不理想，免疫失敗現(xiàn)象時有發(fā)生，造成鴿場嚴重的經(jīng)濟損失[10]。為此，在預(yù)防鴿新城疫工作中應(yīng)進行科學(xué)飼養(yǎng)管理，堅持全進全出飼養(yǎng)方式，不斷完善防疫設(shè)施設(shè)備與防疫措施，保持舍飼良好的通風(fēng)環(huán)境，定期做好日常防疫消毒工作，其次快速研究出鴿新城疫專用疫苗預(yù)防鴿新城疫也是今后發(fā)展的一個重點方向。

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吳星星（1986-），女，研究生，獸醫(yī)師，研究方向：動物疫病預(yù)防與控制。