李人宇，黃金狀，李詠梅，周家宏

（1.連云港師范高等?？茖W(xué)校，江蘇連云港222006；2.淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇連云港222005；3.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210023）

健那綠B褪色光度法測(cè)定啤酒酵母中鉻含量

李人宇1，黃金狀1，李詠梅2，周家宏3

（1.連云港師范高等專科學(xué)校，江蘇連云港222006；2.淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇連云港222005；3.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210023）

采用微波消解樣品，堿性條件下用高錳酸鉀氧化鉻（Ⅲ）為鉻（VI），鉻（VI）在磷酸介質(zhì)中與碘化鉀和健那綠B反應(yīng)，使健那綠B褪色，據(jù)此建立褪色光度法測(cè)定鉻含量的新方法。結(jié)果表明：最大褪色波長(zhǎng)為618 nm，吸光度減小值與鉻（VI）質(zhì)量濃度在0～0.24 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為2.95 μg/L。新建方法用于測(cè)定啤酒酵母中鉻含量，結(jié)果與原子吸收光譜法一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.86%～1.29%（n=5），樣品加標(biāo)回收率為98.7%～101.0%。

褪色光度法；鉻；健那綠B；啤酒酵母

鉻（Ⅲ）是人體必需微量元素之一，參與糖、脂類和蛋白質(zhì)的代謝，具有維持耐糖量于正常水平、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的功能。人體內(nèi)缺鉻（Ⅲ）會(huì)引發(fā)糖尿病、冠心病、兒童發(fā)育不良等疾?。坏t（Ⅲ）過(guò)量則會(huì)危害人體健康[1-3]。啤酒酵母富含三價(jià)有機(jī)鉻，人體吸收利用率高，是天然鉻（Ⅲ）的良好來(lái)源[4]，因品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量大、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)勢(shì)應(yīng)用于食品工業(yè)中[5-6]。故準(zhǔn)確測(cè)定啤酒酵母中鉻含量具有重要意義。

據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，目前鉻的測(cè)定方法主要有原子吸收光譜法[7-9]、分光光度法[10-13]、化學(xué)發(fā)光法[14-15]、電化學(xué)法[16-17]、色譜法[18-19]、質(zhì)譜法[20-22]等。原子吸收光譜法、化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)法操作相對(duì)復(fù)雜，有的還存在較多干擾。色譜法和質(zhì)譜法靈敏、準(zhǔn)確、干擾少，但儀器昂貴，運(yùn)行成本較高，需技術(shù)人員熟練操作，難以推廣應(yīng)用。分光光度法儀器廉價(jià)，操作簡(jiǎn)便，靈敏度較高，準(zhǔn)確可靠，易于推廣普及。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鉻（VI）能氧化碘化鉀生成I3-，I3-與健那綠B反應(yīng)形成穩(wěn)定的離子締合物，使健那綠B褪色，本文詳細(xì)研究了鉻（VI）-碘化鉀-健那綠B反應(yīng)條件，采用微波消解樣品，堿性條件下用高錳酸鉀氧化鉻（Ⅲ）為鉻（VI），建立了褪色光度法測(cè)定啤酒酵母中鉻的新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；SYC-15C超級(jí)恒溫水?。耗暇┥Ａ﹄娮釉O(shè)備廠；pHS-3C型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ETHOS E微波消解儀：意大利Milestone公司；SYZ-B石英亞沸高純水蒸餾器：宜興新建石英玻璃器廠。

所用試劑重鉻酸鉀、磷酸、碘化鉀和那綠B（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

鉻（VI）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：100 μg/mL，稱取 0.283 0 g經(jīng)105℃烘至恒重的重鉻酸鉀，用水溶解，移入1 000 mL容量瓶中，稀釋至刻度，冰箱中4℃保存。使用時(shí)稀釋成2 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；磷酸溶液：5 mol/L；碘化鉀溶液：0.1 mol/L，用前新配；健那綠 B 溶液：5×10-4mol/L。

1.2 方法

取2支25 mL具塞比色管，其中一支依次加入3.0 mL 5 mol/L磷酸溶液，一定量鉻（VI）標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)試液，3.0 mL 0.1 mol/L碘化鉀溶液和3.0 mL 5×10-4mol/L健那綠B溶液，用水定容至25 mL，搖勻；另一支不含鉻（VI）為試劑空白。避光反應(yīng)10min。用1 cm比色皿，以水作參比，在分光光度計(jì)上618 nm處測(cè)量離子締合物體系的吸光度A和試劑空白的吸光度A0，計(jì)算△A=A0-A。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

按1.2方法，以水為參比，分別掃描試劑空白、離子締合物溶液，吸收光譜見(jiàn)圖1。

圖1 吸收光譜Fig.1 Absorption spectra

試劑空白的最大吸收峰位于618 nm，較大吸收峰位于406 nm（曲線1）；鉻（VI）在磷酸介質(zhì)中與碘化鉀和健那綠B反應(yīng)形成穩(wěn)定的離子締合物，健那綠B褪色，618 nm處吸光度顯著減?。ㄇ€2）。試驗(yàn)選擇測(cè)定波長(zhǎng)為618 nm。

2.2 試驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 反應(yīng)介質(zhì)

分別試驗(yàn)了鹽酸、硫酸和磷酸介質(zhì)對(duì)反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，磷酸介質(zhì)的靈敏度最高。但若磷酸濃度過(guò)大，體系不穩(wěn)定；若磷酸濃度過(guò)小，△A值較小。選用5 mol/L磷酸溶液，用量為3.0 mL時(shí)（見(jiàn)圖2），△A值最大。試驗(yàn)選用3.0 mL 5 mol/L磷酸溶液。

圖2 磷酸用量的影響Fig.2 Effect of phosphoric acid amount

2.2.2 碘化鉀用量

在離子締合反應(yīng)過(guò)程中，部分碘化鉀未參加反應(yīng)就已被空氣氧化。為了保證鉻（VI）反應(yīng)完全，碘化鉀的加入量應(yīng)遠(yuǎn)大于理論量。結(jié)果表明：選用0.1 mol/L碘化鉀溶液，用量為3.0 mL時(shí)，即可保證鉻（VI）完全反應(yīng)，△A值最大（見(jiàn)圖3）。試驗(yàn)選用3.0 mL 0.1 mol/L碘化鉀溶液。

圖3 碘化鉀用量的影響Fig.3 Effect of potassium iodide amount

2.2.3 健那綠B用量

當(dāng)5×10-4mol/L健那綠B溶液用量為3.0 mL時(shí)，△A值最大（見(jiàn)圖4）。試驗(yàn)選用3.0 mL 5×10-4mol/L健那綠B溶液。

2.2.4 表面活性劑

試驗(yàn)考察了常見(jiàn)表面活性劑對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 健那綠B用量的影響Fig.4 Effect of janus green B amount

表1 表面活性劑的影響Table 1 Effect of surfactants

由表1可知，不加表面活性劑ΔA值更大，反應(yīng)效果更好，故試驗(yàn)無(wú)需加表面活性劑。

2.2.5 反應(yīng)溫度

當(dāng)溫度在0～90℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)離子締合反應(yīng)影響不大，△A值變化幅度較?。蛔罴逊磻?yīng)溫度為15℃～30℃（見(jiàn)圖5）。試驗(yàn)選擇在室溫條件下反應(yīng)。

圖5 反應(yīng)溫度的影響Fig.5 Effect of reaction temperature

2.2.6 反應(yīng)時(shí)間

室溫避光反應(yīng)10min時(shí)，△A值達(dá)到最大（見(jiàn)圖6）。試驗(yàn)選擇避光條件下反應(yīng)10 min。

圖6 反應(yīng)時(shí)間的影響Fig.6 Effect of reaction time

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確移取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 鉻（VI）標(biāo)準(zhǔn)溶液，各置25 mL比色管中，按1.2方法操作并測(cè)量吸光度減小值△A，以△A為縱坐標(biāo)，鉻（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖7）。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve

結(jié)果表明：△A與鉻（VI）質(zhì)量濃度在 0～0.24 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔA=2.630 4ρ（μg/mL）+0.009 9，r=0.999 6，表觀摩爾吸光系數(shù) ε=1.37×105L/（mol·cm）。平行測(cè)定11次試劑空白，得A0的標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.59×10-3，計(jì)算方法的檢出限（3s/k）為2.95 μg/L。

2.4 共存離子的影響

在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，考察了常見(jiàn)離子對(duì)0.24μg/mL鉻（VI）標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的影響，在相對(duì)誤差±5%以內(nèi)，共存離子的允許量（以 μg計(jì)）如下：Na+、K+、Zn2+、Co2+、Cl-、Br-、OH-（1000），Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、NO3-、CO32-、Ac-、F-、PO43-、SiO32-（500），NH4+、Al3+、SO32-（100），Cr3+、Pb2+、Se（IV）（50）。結(jié)果表明：選擇性良好，常見(jiàn)金屬離子有較高允許量，一般樣品可直接測(cè)定。

3 樣品分析

將啤酒酵母樣品粉碎，過(guò)60目篩，充分混勻。稱取0.2 g（精確到0.000 1 g）酵母樣品于微波消解罐中，加入6 mL硝酸和2 mL雙氧水，置于微波消解儀中按設(shè)置程序消解。在5 min內(nèi)由室溫升至120℃并恒溫5 min，再在5 min內(nèi)升溫至160℃并恒溫10 min，然后在5 min內(nèi)升溫至180℃并恒溫10 min，消解完畢得透明溶液。冷卻后取出消解罐，在電熱板上于140℃～160℃趕酸至剩余0.5 mL～1.0 mL。消解罐放冷后，將消化液轉(zhuǎn)移至三角瓶中，用熱水洗滌坩鍋3次，洗滌液并入三角瓶中，加入40 mL水，加入2 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH12，滴加2%高錳酸鉀溶液，搖勻，溶液呈紫紅色，在電爐上加熱煮沸20 min，煮沸過(guò)程中溶液應(yīng)保持紫紅色。若紫紅色褪去，需及時(shí)滴加高錳酸鉀溶液。加熱完畢取下后立即滴加95%乙醇使紫紅色褪去，搖勻，用1 mol/L硝酸溶液調(diào)節(jié)pH近中性，趁熱過(guò)濾，濾液置于50 mL容量瓶中，并用少量熱水洗滌3次，洗滌液并入容量瓶中，定容至刻度，待測(cè)。取2.0 mL試樣溶液按1.2試驗(yàn)方法測(cè)定，并與原子吸收光譜法[10]對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表2。同時(shí)做加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 樣品中鉻含量測(cè)定結(jié)果（n=5）Table 2 Results for the determination of chromium in samples（n=5）

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 3 Results of spiked recovery test（n=5）

4 結(jié)論

本文采用微波消解樣品，堿性條件下用高錳酸鉀氧化鉻（Ⅲ）為鉻（VI），優(yōu)化鉻（VI）-碘化鉀-健那綠 B體系反應(yīng)條件，建立了健那綠B褪色光度法測(cè)定啤酒酵母中鉻含量，在室溫下反應(yīng)，測(cè)定速度快，儀器操作簡(jiǎn)便，方法準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，所建新方法可用于啤酒酵母中鉻含量的測(cè)定。

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Fading Spectrophotometric Determination of Chromium Content in Beer Yeast with Janus Green B

LI Ren-yu1，HUANG Jin-zhuang1，LI Yong-mei2，ZHOU Jia-hong3
（1.Lianyungang Teachers College，Lianyungang 222006，Jiangsu，China；2.School of Chemical Engineering，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China；3.College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210023，Jiangsu，China）

A new fading spectrophotometric method for determination of chromium content was developed.Cr（VI）reacted with potassium iodide and janus green B in H3PO4medium，leading to the fading of janus green B after microwave digestion sample and oxidation of Cr（III）to Cr（VI）with potassium permanganate under alkaline conditions.The results showed that the maximum fading wavelength locates at 618 nm，reducing absorbance value was linear with the concentration of Cr（VI）in the range of 0-0.24 μg/mL，and the limit of detection was 2.95 μg/L.The method had been applied to the determination of Cr（Ⅲ）in beer yeast.The results obtained by this method agree well with those obtained by atomic absorption spectrometry.RSD was in the range of 0.86%-1.29%（n=5），and recovery was in the range of 98.7%-101.0%.

fading spectrophotometry；chromium；janus green B；beer yeast

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.025

2015年度國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21571105）；2014年江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”資助項(xiàng)目；2015年度連云港市第五期“521工程”科研項(xiàng)目（201529）；2015年江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201511585003Y）

李人宇（1972—），男（漢），教授，博士，主要從事應(yīng)用化學(xué)研究。

2017-04-20