張崟，熊偉，夏虎，郭思亞，張婷，唐歡，黃偉明，彭海川（成都大學(xué)肉類加工四川省重點實驗室，四川成都610106）

粉碎程度對畜禽骨蛋白消化率及骨粉的氨氮含量影響

張崟，熊偉，夏虎，郭思亞，張婷，唐歡，黃偉明，彭海川（成都大學(xué)肉類加工四川省重點實驗室，四川成都610106）

為了分析骨粉的粉碎程度對其消化率及骨粉的氨氮含量的影響，本文以豬大骨為原料，經(jīng)高壓蒸煮酶輔助水解后粉碎，制得顆粒尺寸大于 150 μm、小于 37.4 μm，以及尺寸介于 150 μm～92.9 μm、92.9 μm～75 μm、75 μm～58.9 μm、58.9 μm～48.9 μm、48.9 μm～41.8 μm、41.8 μm～37.4 μm 的骨粉，并對其氨氮含量、脂肪及水分含量，蛋白質(zhì)消化率，碎骨蛋白的形態(tài)及碎骨的外觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所得碎骨中尺寸小于37.4 μm骨粉占83.2%。粉碎的骨粉隨著顆粒尺寸減小，其中的脂肪含量增加，氨氮含量減小。粉碎骨粉中蛋白質(zhì)的消化率隨骨粉尺寸減小呈現(xiàn)增加趨勢，尺寸小于37.4 μm骨粉的消化吸收率顯著（P＜0.05）高于其他尺寸骨粉。粉碎骨粉的電泳圖顯示，粉碎骨粉中低分子量蛋白含量呈增加趨勢。骨粉的微觀結(jié)構(gòu)顯示，粉碎骨粉的表面呈圓潤光滑狀態(tài)。

碎骨；超微粉碎；酶解；消化率

我國是肉類生產(chǎn)和消費大國，畜禽屠宰產(chǎn)生的骨副產(chǎn)物的產(chǎn)量較大[1]。畜禽骨中含有豐富的氨基酸和人體所需的微量元素及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，具有很高的利用價值。但是，由于畜禽骨的天然堅硬結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其中的營養(yǎng)物質(zhì)難以被人體及其他動物完全消化吸收[2]。盡管國內(nèi)有采用高壓蒸煮及美拉德反應(yīng)制備骨素呈味物質(zhì)、酶解制備骨素肽等對畜禽骨的利用研究[3]，但均不能對畜禽骨中營養(yǎng)物質(zhì)完全利用[4]。這也成為制約畜禽骨被高附加值回收利用的技術(shù)瓶頸。

Wondra等研究了飼料顆粒大小對生豬吸收飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的效率，發(fā)現(xiàn)飼料顆粒越小，生豬利用飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的效率越高[5]。Mavromichalis等發(fā)現(xiàn)小麥粉碎程度是影響豬仔對飼糧轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵[6]。此外，底物的粒徑大小對酶水解蛋白時降解效果也有顯著影響[8]。因此，骨粉的粉碎程度可能對其中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有一定影響。但是，國內(nèi)外對畜禽骨的粉碎程度與其中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率的研究較少。為此，本文探討了粉碎程度對畜禽骨蛋白消化率及骨粉的氨氮含量的影響。這不僅將為完全利用畜禽骨中的營養(yǎng)物質(zhì)提供理論依據(jù)，而且有利于完善骨粉碎程度與其中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收理論。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮豬大骨：四川欣康綠食品有限公司；木瓜蛋白酶（酶活10萬U/g）：南寧龐博生物有限公司；胃蛋白酶（300萬 U/g）、胰蛋白酶（酶活 25萬 U/g）：如吉生物有限公司；電泳試劑丙烯酰胺、三（羥甲基）氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)R-250（均為電泳專用生化試劑BR級）：北京諾其雅盛生物科技有限公司；濃硫酸、CuSO4·5H2O、K2SO4：成都科龍化工試劑廠。

1.2 試驗設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)分樣篩：言錦絲網(wǎng)加工廠；LE104E/02分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；WP-UPT-20超純水機(jī)：四川沃特爾水處理有限公司；FW-100高速粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)有限公司；WG1822DN高壓鍋：浙江愛仕達(dá)電器股份有限公司；JMF-80膠體磨：鄭州玉祥機(jī)械設(shè)備有限公司；KDN-102C半自動凱氏定氮儀、HYP-1008消化爐：上海纖檢儀器有限公司；SXT-06索氏抽提儀：上海精密儀器儀表有限公司；PH2000型顯微鏡：鳳凰光學(xué)控股有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 骨粉制備

新鮮豬骨制備骨粉方法參考文獻(xiàn)[9]，略有修改。豬大骨剔除殘留的肉和筋腱后剁成2 cm左右的碎骨，用高速粉碎機(jī)粉碎為骨泥。每次取200 g骨泥，加入4 000 mL水，在0.15 MPa、121℃高壓蒸煮2 h。冷卻至55℃時，加入55℃純水定容至400 mL，然后加入1 073.9 U/g木瓜蛋白酶，55℃恒溫震蕩酶解2 h。

1.3.2 不同粒徑骨粉制備

酶解豬骨經(jīng)JMF-80兩級膠體磨，在刻度5、15、25分別粉碎 5 min，收集流出液，經(jīng) 100 目（150 μm）、160目（92.9 μm）、200 目（75 μm）、250 目（58.9 μm）、300 目（48.9 μm）、350 目（41.8 μm）、400 目（37.4 μm）分樣篩過濾，收集過濾物。將截留的液體與分樣篩一并在65℃恒溫干燥6 h，冷卻后稱量，計算截留率。計算式為：截留率/%=篩上骨粉質(zhì)量（g）/回收骨粉總量（g）×100

1.3.3 骨粉的粗脂肪及水分含量測定

采用國標(biāo)GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》中索氏抽提法測骨粉的粗脂肪含量，國標(biāo)GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》中干燥法測骨粉的水分含量。

1.3.4 骨粉的氨氮含量測定

采用半自動微量凱氏定氮法測定不同細(xì)度骨粉的蛋白質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱量1 g不同細(xì)度骨粉至消化管中，每管分別加入0.2 g CuSO4·5H2O和6.0 g K2SO4，然后加入 20 mL 濃硫酸后，在（200±2）℃消化 2.5 h，再在（420±2）℃繼續(xù)消化6 h，待溶液消煮至清澈藍(lán)綠色后定容，取10 mL消化液用半自動定氮儀測定溶液中的氨氮含量。

1.3.5 骨粉蛋白體外模擬消化分析

模擬消化分析方法見參考文獻(xiàn)[10]，略有改動。向錐形瓶中準(zhǔn)確稱量（0.500 0±0.000 2）g不同細(xì)度的骨粉。量取新鮮濃鹽酸4.2 mL用超純水定溶到500 mL，調(diào)節(jié)pH值至1.5，加入0.75 g胃蛋白酶混勻。在錐形瓶中加入模擬胃液50.0 mL，在37℃震蕩消化2 h。之后用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.2終止反應(yīng)。

分別量取2 mL模擬腸液[（0.750 0±0.000 2）g胰蛋白酶溶于含有0.005 mol/L NaN3的20 mL pH 8.2的磷酸鹽緩沖液]，加入到上述反應(yīng)液中，在37℃恒溫水浴震蕩酶解2 h。酶解后加入10 mL 20%TCA溶液終止反應(yīng)，靜置2 h。用中性濾紙過濾消化液，采用半自動微量凱氏定氮法測定濾液中蛋白質(zhì)含量。計算消化率公式為：消化率/%=TCA可溶性蛋白（g）/骨粉的總蛋白（g）×100。

1.3.6 凝膠電泳分析

骨粉蛋白電泳方法參考文獻(xiàn)[3]，略有改動。分別稱取不同細(xì)度骨粉2 g，加入18 mL 5%的SDS溶液。在95℃的水浴中加熱1 h后，在20℃、11 000 r/min離心5 min，取上清液重復(fù)離心兩次。取200 μL上清液加入 200 μL SDS-PAGE樣品溶解液（0.5 mol/L的Tris-HCl，pH6.8，含 4 g/100 mL 的 SDS，20 g/100 mL 甘油和10 g/100 mL的β-巰基乙醇）混合煮沸3 min。采用5%濃縮膠、15%分離膠，在30 mA恒定電流下電泳，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液。

1.3.7 骨粉微觀結(jié)構(gòu)分析

將骨粉置于載玻片上，采用PH2000型生物顯微鏡，對不同尺寸的骨粉的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每樣至少做3次平行試驗，所得數(shù)據(jù)采用SAS 9.0中的Fisher法對其顯著性進(jìn)行分析，采用Excel2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 骨粉粉碎后碎骨的尺寸分布

豬骨經(jīng)高壓蒸煮及酶輔助水解后粉碎，所得粉碎骨粉的尺寸分布見圖1。

圖1 粉碎后骨粉的尺寸分布Fig.1 Size distribution of ground bone meal

圖1中數(shù)據(jù)顯示，尺寸小于37.4 μm的骨粉總量顯著（P＜0.05）高于其他尺寸的骨粉，且截留率為83.2%，而尺寸大于37.4 μm的骨粉中，除了尺寸在41.8 μm～37.4 μm 的骨粉量顯著（P＜0.05）低于大于 150 μm 和150 μm～92.9 μm的骨粉外，其他尺寸骨粉量間無顯著（P＞0.05）差異，且隨著截留尺寸減小呈下降趨勢。這與文獻(xiàn)[9]的研究結(jié)果一致。

豬骨經(jīng)高壓蒸煮后再酶輔助水解，可以使堅硬的豬骨出現(xiàn)微孔，這樣有利于豬骨的進(jìn)一步粉碎[9]。這可能是導(dǎo)致尺寸小于37.4 μm的骨粉總量顯著高于其他尺寸骨粉的主要原因。尺寸大于37.4 μm的骨粉量隨截留尺寸減小呈下降趨勢，這可能是因為膠體磨內(nèi)的死角，導(dǎo)致部分骨粉的粉碎程度不足，出現(xiàn)了極大和極小端高于中間段的極端分布現(xiàn)象。

2.2 水分含量和脂肪含量的變化

由于骨頭中不僅含有蛋白質(zhì)，還有脂肪和水分。為了明確粉碎骨粉中脂肪和水分殘留量，對粉碎骨粉的水分和脂肪含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖2。

圖2 粉碎骨粉的水分及脂肪含量Fig.2 Moisture and fat content of ground bone meal

圖2中數(shù)據(jù)顯示，粉碎骨粉中的脂肪含量隨粉碎程度的增加呈顯著（P＜0.05）增加趨勢，尺寸小于37.4 μm和尺寸在41.8 μm～37.4 μm的骨粉的脂肪含量顯著（P＜0.05）大于其他尺寸的骨粉。尺寸小于37.4 μm的骨粉的水分含量顯著（P＜0.05）高于其他尺寸的骨粉。

豬骨在蒸煮后，盡管已經(jīng)通過去除蒸煮液上面的漂浮物去除了部分骨油，但難以全部除盡。隨著豬骨的粉碎，骨粉的表面積增加，吸附能力增加，加之骨油易于流動。這些因素可能是導(dǎo)致骨粉的油脂含量隨著骨粉尺寸減小呈顯著增加的主要原因。小于37.4 μm的骨粉的水分含量顯著高于其他尺寸的骨粉的可能原因是，小于37.4μm的骨粉較其他尺寸骨粉對水分和脂肪的吸附能力更強(qiáng)所致。

2.3 骨粉的氨氮含量

粉碎骨粉的氨氮含量結(jié)果見圖3。

圖3 粉碎骨粉的氨氮含量Fig.3 Total nitrogen content of ground bone meal

圖3中數(shù)據(jù)顯示，隨著截留尺寸減小，骨粉中氨氮含量呈顯著（P＜0.05）降低趨勢。對骨粉的氨氮含量與其中的脂肪含量進(jìn)行回歸分析，兩者呈二次相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)的平方為0.972 8。由此可見，粉碎骨粉中，脂肪含量較高，氨氮含量較低。

由于粉碎骨粉是骨頭碎渣和脂肪的混合物，在通過目篩時，脂肪的流動性優(yōu)于碎骨粉，所以更多的脂肪與碎骨粉一起通過目篩，并在較細(xì)的目篩上蓄積，因而導(dǎo)致較細(xì)骨粉的氨氮含量相對較少的。

2.4 骨粉蛋白質(zhì)消化率

為了進(jìn)一步分析粉碎程度對骨粉的營養(yǎng)成分的消化吸收影響，選擇骨粉中的蛋白質(zhì)作為指標(biāo)，對其中的蛋白質(zhì)的消化吸收率進(jìn)行了分析，所得結(jié)果見圖4。

圖4 粉碎對骨粉的消化吸收影響Fig.4 Effect of grinding on the digestion and absorption of bone meal

圖4中數(shù)據(jù)顯示，尺寸小于37.4 μm骨粉的消化吸收率顯著（P＜0.05）高于尺寸在 41.8 μm～37.4 μm 的骨粉，尺寸在41.8 μm～37.4 μm骨粉的消化吸收率顯著（P＜0.05）高于其他尺寸的骨粉。隨著骨粉尺寸減小，骨粉中蛋白質(zhì)的消化吸收率呈增加趨勢。這與飼料顆粒大小與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收結(jié)果相符[5-6]。

豬骨經(jīng)過蒸煮和酶輔助水解，加之膠體磨的粉碎，使其堅硬的天然結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞。這使得骨粉中的蛋白質(zhì)更多的裸露，易于受到蛋白酶的水解。此外，骨粉顆粒越小，其表面積越大，越有利于蛋白酶的水解。這些原因可能是導(dǎo)致尺寸小于37.4 μm和尺寸在41.8 μm～37.4 μm骨粉的消化吸收率顯著高于其他尺寸骨粉的主要原因。

2.5 電泳結(jié)果

為了分析豬骨粉碎后其中的蛋白質(zhì)形態(tài)變化，對粉碎骨粉進(jìn)行SDS-PAGE分析，所得結(jié)果見圖5。圖5A為骨粉的電泳圖，圖5B為骨粉的電泳圖O.D.值。

圖5 粉碎對骨粉的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響Fig.5 Effects of grinding on protein structure of bone meal

圖5A顯示，隨著骨粉尺寸的減小，骨粉中小分子蛋白的量呈現(xiàn)增加趨勢，這可以通過圖5B中對電泳膠的O.D.值分析證實。

高壓蒸煮和酶輔助水解，導(dǎo)致更多的骨膠原蛋白分解。這可能是出現(xiàn)圖5中碎骨的低分子蛋白含量呈現(xiàn)增加趨勢的原因。隨著骨粉顆粒的減小，骨粉中小分子蛋白量增加。由此也進(jìn)一步驗證了2.4中，尺寸越小的骨粉中蛋白質(zhì)的消化率越高的試驗結(jié)果。

2.6 骨粉的微觀結(jié)構(gòu)

對粉碎骨粉的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，所得結(jié)果見圖6。

圖6 骨粉的微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructure of ground bone meal

圖6中骨粉的結(jié)構(gòu)顯示，隨著尺寸減小，骨粉顆粒越細(xì)，而且骨粉的表面結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)圓潤光滑狀態(tài)。

骨粉經(jīng)過膠體磨粉碎過程中，需經(jīng)過膠體磨磨盤的高速剪切和摩擦。這可能是導(dǎo)致粉碎骨粉的表面呈現(xiàn)光滑狀態(tài)的原因。

3 結(jié)論

經(jīng)高壓蒸煮酶輔助水解后粉碎豬骨，所得碎骨中尺寸小于37.4 μm骨粉占83.2%。粉碎的骨粉隨著顆粒尺寸減小，其中的脂肪含量增加，氨氮含量減小。粉碎骨粉中蛋白質(zhì)的消化率隨骨粉尺寸減小呈現(xiàn)增加趨勢，尺寸小于37.4 μm骨粉的消化吸收率顯著（P<0.05）高于其他尺寸骨粉。粉碎骨粉的電泳圖顯示，粉碎骨粉中低分子量蛋白含量呈增加趨勢。骨粉的微觀結(jié)構(gòu)顯示，粉碎骨粉的表面呈現(xiàn)圓潤光滑狀態(tài)。因此，微粉碎骨粉可以提高其中的低分子蛋白含量，促進(jìn)微粉碎骨粉的消化吸收率。

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Effect of Grinding Degree on the Digestibility of Bone Protein and Ammonia Nitrogen Content of Bone Powder

ZHANG Yin，XIONG Wei，XIA Hu，GUO Si-ya，ZHANG Ting，TANG Huan，HUANG Wei-ming，PENG Hai-chuan
（Key Laboratory for Meat Processing of Sichuan Province，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China）

To analyze effect of grinding degree on the digestibility of bone protein and ammonia nitrogen content of bone powder，pig bone was taken as raw material，with the high pressure cooking and enzyme assisted hydrolysis，the bone was crushed with colloid mill into particle size larger than 150 μm，less than 37.4 μm，and sizerange of 150 μm-92.9 μm，92.9 μm-75 μm，75 μm-58.9 μm，58.9 μm-48.9 μm，48.9 μm-41.8 μm，41.8 μm-37.4 μm. Ammonia nitrogen content，fat and moisture contents，protein digestion ratio of bone meal were determined，and the protein pattern，bone morphology were analyzed. Results showed that the bone size smaller than 37.4 μm accounted for 83.2 %. With the decrease of particle size，the content of fat increased，and the content of ammonia nitrogen decreased. The digestion ratio of protein in the bone meal showed an increasing trend with the decrease of the size of the bone meal，and the digestion ratio of the bone size less than 37.4 μm was significantly（P＜0.05）higher than others. The result of SDS-PAGE of bone meal showed that the content of low molecular protein increased with the decrease of the size of the bone particle. The microstructure of bone meal showed that the surface of the crushed bone meal was smooth.

broken bone；ultrafine grinding；enzymatic hydrolysis；digestibility

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.017

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項目（2017JY0086）；四川省教育廳重點項目（17ZA0084）

張崟（1981—），男（漢），副教授，博士，主要從事畜產(chǎn)品加工與保藏研究。

2017-04-28