張洪坤

（山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，山東濟(jì)南250103）

大孔樹脂吸附純化茯苓多糖工藝研究

張洪坤

（山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，山東濟(jì)南250103）

以茯苓提取粗多糖為原料，考察7種大孔樹脂純化茯苓提取粗多糖的效果。通過靜態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂對(duì)茯苓提取粗多糖的脫色率與多糖回收率均優(yōu)于其它種類樹脂。通過動(dòng)態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)結(jié)果，得到最佳純化茯苓提取粗多糖的工藝條件為：配制5.0 mg/mL的茯苓粗多糖提取液，以2 BV/h流速上樣至柱體積為7 BV的AB-8型大孔樹脂內(nèi)吸附，隨后采用5 BV的50%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脫。通過定量分析結(jié)果表明，在最佳純化工藝條件下，茯苓提取粗多糖的脫色率達(dá)到85.2%，多糖回收率為75.4%。

大孔樹脂；茯苓；多糖；純化

茯苓（Poria cocos）是多孔菌科的臥孔菌屬真菌，因具有滲濕利尿，和胃健脾，寧心安神的功效，而被廣泛用于經(jīng)典方劑[1-2]。茯苓除可供藥用外，亦可被制成多種滋補(bǔ)保健食品，從而具有藥食兩用的特性[3-4]。茯苓主要化學(xué)成分為多糖和三萜類化合物，其中多糖比重占其干重的70%～90%，現(xiàn)代藥理學(xué)證明茯苓多糖具有降糖、降脂、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用[5]，然而茯苓提取粗多糖，通?；煊猩氐入s質(zhì)，因此前人對(duì)其粗產(chǎn)物的純化，進(jìn)行了大量的研究[6-7]，采取雙氧水氧化法、金屬絡(luò)合法脫除色素，但上述純化方法易出現(xiàn)多糖變性，且使得其它有害溶劑殘留，因此不能實(shí)際有效提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度。

大孔樹脂吸附分離技術(shù)，綜合機(jī)械篩分與化學(xué)吸附的優(yōu)點(diǎn)，具有選擇性好、穩(wěn)定性高、干擾因素少、使用周期長(zhǎng)、可重復(fù)循環(huán)利用等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離與純化[8-10]。本研究在茯苓多糖的提取工藝基礎(chǔ)上，利用大孔樹脂純化提取的粗多糖，探究最佳純化工藝，并釆用硫酸-苯酚法定量分析[11]，從而為茯苓多糖下游產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯苓：湖北恩施；AB-8、D101型大孔樹脂：陜西藍(lán)深特種樹脂有限公司；NKA-9、X-5型大孔樹脂：天津南開大學(xué)化工廠；HPD 300、HPD 600、DM 130 型大孔樹脂：滄州寶恩生化制劑廠；其余化學(xué)試劑均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為純化水。

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司；AE224型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；878-A/B型高速多功能粉碎機(jī)：常州國(guó)華電器有限公司；5804R臺(tái)式高速大容量離心機(jī)：艾本德中國(guó)有限公司；DZF-6020真空干燥箱：常州恒隆儀器有限公司；SHY-2A水浴恒溫振蕩器：常州國(guó)宇儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

茯苓粉碎，過60目篩備用。準(zhǔn)確稱取10.0 g茯苓過篩粉碎物，前后3次各加入500 mL水，煎煮過濾，合并濾液后減壓濃縮，加入95%乙醇溶液靜置過夜后，離心，分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀物，真空干燥即得茯苓提取粗多糖[12]。

1.2.2 樹脂預(yù)處理

將大孔樹脂浸泡于90%乙醇中24 h，充分溶脹后濕法裝柱，后用90%乙醇反復(fù)沖洗，直至流出液與水混合（V液∶V水=1∶5）無白色渾濁出現(xiàn)，再用水洗至無乙醇?xì)馕?，加?%HCl浸泡3 h，用水洗至中性；再用3%NaOH溶液浸泡3 h，用水洗至中性，備用[14]。

1.2.3 靜態(tài)吸附-洗脫

分別稱取2.0 g 7種大孔樹脂（D101、AB-8、NKA-9、X-5、HPD-300、HPD-600、DM 130型）于 100 mL 錐形瓶?jī)?nèi)，分別加入等濃度的茯苓多糖提取液50 mL，放置于恒溫水浴振蕩器中，靜態(tài)吸附24 h后過濾，通過下式計(jì)算不同種類樹脂對(duì)提取液中色素和多糖的靜態(tài)吸附率。

式中：A0為提取液色素吸光度；Ae為吸附后濾液中色素吸光度；Q1為色素吸附率，%；m0為提取液多糖質(zhì)量，mg；me為吸附后濾液中多糖質(zhì)量，mg；Q2為多糖吸附率，%。

將吸附后的樹脂置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入50%乙醇30 mL，繼續(xù)放置于恒溫水浴振蕩器中，洗脫24 h，過濾，通過下式計(jì)算7種大孔樹脂靜態(tài)吸附-洗脫后提取液中脫色率與多糖回收率。

式中：Ad為洗脫液色素吸光度；Dd為脫色率，%；md為洗脫液多糖質(zhì)量，mg；R為多糖回收率，%。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 提取液質(zhì)量濃度對(duì)多糖吸附率影響

分別將 0.5、1.0、5.0、10.0、15.0g/mL 提取液，以 2BV/h上樣流速，加入至5 BV樹脂柱，以多糖吸附率為考察指標(biāo)，觀察提取液質(zhì)量濃度對(duì)多糖吸附率影響。

1.2.4.2 上樣流速對(duì)多糖吸附率影響

將 5.0 g/mL 提取液，分別以 1、2、3、4、5 BV/h 上樣流速加入至5 BV樹脂柱，以多糖吸附率為考察指標(biāo)，考察上樣流速對(duì)多糖吸附率影響。

1.2.4.3 樹脂柱體積對(duì)多糖吸附率影響

將5.0 g/mL提取液，以2 BV/h上樣流速，分別加入至 1、3、5、7、9 BV 樹脂柱，以多糖吸附率為考察指標(biāo)，觀察樹脂柱體積對(duì)多糖吸附率影響。

1.2.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)脫色率影響

分別將10%、30%、50%、60%、70%的 7 BV 乙醇以2 BV/h流速對(duì)最佳吸附后的AB-8型大孔樹脂進(jìn)行洗脫，以脫色率為考察指標(biāo)，觀察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)脫色率影響。

1.2.4.5 洗脫流速對(duì)脫色率影響

將 7 BV 50%乙醇分別以 1、2、3、4、5 BV/h 流速對(duì)最佳吸附后的AB-8型大孔樹脂進(jìn)行洗脫，以脫色率為考察指標(biāo)，觀察洗脫流速對(duì)脫色率影響。

1.2.4.6 乙醇用量對(duì)脫色率影響

分別將 1、3、5、7、9 BV 的 50%乙醇分別以 2 BV/h流速對(duì)最佳吸附后的AB-8型大孔樹脂進(jìn)行洗脫，以脫色率為考察指標(biāo)，觀察乙醇用量對(duì)脫色率影響。

1.2.5 色素檢測(cè)

由于色素物質(zhì)成分復(fù)雜，表征較為困難，難以確定色素的種類，因此采取可見光區(qū)平均脫色率法[13]，對(duì)茯苓提取粗多糖溶液于200 nm～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，分別取 250、300、350、400、450、500、550、600 nm 處吸光度，計(jì)算平均吸光度值，作為茯苓提取粗多糖溶液中色素的檢測(cè)值，平行測(cè)定3次。

1.2.6 多糖含量檢測(cè)

顯色液配制：將50 mL濃硫酸與10 mL水配制成硫酸溶液后，加入0.6 g苯酚，攪拌均勻。

含量測(cè)定：以不同濃度含有顯色劑的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)，490 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A490=0.052 1C+0.037 4（r=0.999 9），準(zhǔn)確稱取1 g提取物完全溶于50 mL純化水中，加入顯色劑后，振蕩混勻，移取1 mL樣品溶液，以純化水為空白對(duì)照，于490 nm處測(cè)定溶液中多糖的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到提取粗產(chǎn)物中多糖的含量，平行測(cè)定3次[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗產(chǎn)物含量

利用1.2.2與1.2.3所述檢測(cè)方法，分別測(cè)定茯苓提取粗多糖中色素與多糖含量，結(jié)果見表1所示。

表1 茯苓提取粗產(chǎn)物中色素與多糖含量Table 1 The contention of polysaccharide and pigment of Poria cocos extract

2.2 不同樹脂吸附-洗脫性能比較

不同種類樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫性能比較見表2。

表2 不同種類樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫性能比較Table 2 Comparison of static adsorption and desorption performance of different macroporous resins

從表2中可見，AB-8型大孔樹脂的脫色率及多糖回收率均高于其它6種樹脂，分別為71.1%和65.3%，這源于茯苓提取粗多糖中色素雜質(zhì)多為弱極性化合物，易與AB-8型大孔樹脂特殊的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較強(qiáng)物理吸附作用，因此本研究選取AB-8型大孔樹脂純化茯苓提取粗多糖。

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)研究

根據(jù)2.2.2中靜態(tài)吸附試驗(yàn)條件，在不同時(shí)間下測(cè)定靜態(tài)下AB-8型大孔樹脂的色素與多糖吸附率，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線，見圖1。

圖1 AB-8型大孔樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線Fig.1 Static adsorption curve of AB-8 resin

吸附起始階段，色素與多糖的吸附速率均較大，10 h左右多糖吸附趨于平緩，12 h后色素吸附趨于平衡，表明AB-8型大孔樹脂靜態(tài)飽和吸附茯苓提取粗產(chǎn)物中色素與多糖耗時(shí)較為合理。

2.4 吸附工藝研究

2.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

表3為吸附工藝研究單因素試驗(yàn)結(jié)果，提取液質(zhì)量濃度為5.0 g/mL，上樣流速3 BV/h，樹脂柱體積為5 BV時(shí)，多糖吸附率達(dá)到各單因素變化最佳。

表3 單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of single factor experiment

2.4.2 正交試驗(yàn)

采用L9（34）正交試驗(yàn)法，以多糖吸附率為衡量指標(biāo)，考察提取液質(zhì)量濃度、上樣流速和樹脂柱體積對(duì)吸附效果的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，相關(guān)因素水平見表4所示。按照表5試驗(yàn)條件，配制3種等體積不同質(zhì)量濃度的茯苓多糖提取液，分別上樣至預(yù)處理后的樹脂柱中吸附，收集流出液，按照1.2.3所述方法測(cè)定流出液中多糖含量，照式（2）計(jì)算多糖吸附率，相關(guān)方差分析見表6所示。

表4 正交試驗(yàn)因素水平Table 4 Table of the factorial experiment

表5 多糖吸附正交試驗(yàn)Table 5 Results of the orthogonal-test method of polysaccharide adsorption

表6 多糖吸附工藝方差分析Table 6 Analysis of variance for the polysaccharide adsorption factors

從表5與表6中結(jié)果可知，各因素對(duì)AB-8型大孔樹脂吸附提取物中多糖效果的影響順序?yàn)锽>C>A，提取液上樣流速對(duì)吸附效果影響顯著，最佳吸附工藝條件為A2B2C3。降低上樣流速有利于增長(zhǎng)提取液與樹脂的接觸時(shí)間，同時(shí)樹脂柱體積增大有助于避免多糖的飽和吸附提前，充分發(fā)揮其吸附性能，因此選擇配制5.0 mg/mL的茯苓多糖提取液，以2 BV/h流速，上樣至柱體積為7 BV的AB-8型大孔樹脂內(nèi)。

2.5 洗脫工藝研究

2.5.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

表7為吸附工藝研究單因素試驗(yàn)結(jié)果，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50 g/mL，洗脫流速2 BV/h，乙醇用量為5 BV時(shí)，脫色率達(dá)到各單因素變化最佳。

表7 單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of single factor experiment

2.5.2 正交試驗(yàn)

吸附后的樹脂需洗脫，以脫除色素雜質(zhì)，達(dá)到純化粗多糖的目的，因此以脫色率為衡量指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法，考察洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)、流速與用量對(duì)洗脫效果的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，相關(guān)因素水平見表8所示。依照表9所述試驗(yàn)條件進(jìn)行洗脫，收集9份洗脫液，利用1.2.2所述方法測(cè)定洗脫液色素吸光度，照式（3）計(jì)算脫色率，相關(guān)方差分析見表10所示。

表8 正交試驗(yàn)因素水平Table 8 Table of the factorial experiment

表9 洗脫工藝正交試驗(yàn)Table 9 Results of the orthogonal-test method of desorption factors

表10 洗脫工藝方差分析Table 10 Analysis of variance for the desorption factors

樹脂表面吸附的多糖與色素均有可能被洗脫，二者在洗脫過程呈競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從表9和表10的結(jié)果分析可知，各因素對(duì)脫色率影響的順序?yàn)锳>C>B，最佳洗脫工藝條件為A2B2C1，乙醇濃度對(duì)洗脫效果影響最為顯著，這因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)越大，則洗脫劑極性愈小，愈不容易將色素從樹脂表面洗脫，且減小洗脫劑體積有利于多糖被優(yōu)先洗脫，從而確定洗脫工藝為：采用5 BV的50%乙醇溶液，以2 BV/h流速對(duì)吸附后的AB-8型大孔樹脂進(jìn)行洗脫。

2.6 最佳純化工藝驗(yàn)證

采取正交試驗(yàn)法得到的最佳工藝純化茯苓提取粗多糖，純化前后的結(jié)果見表11所示。

表11 最佳純化工藝驗(yàn)證Table 11 The results of optimum conditions verification

動(dòng)態(tài)吸附-洗脫后，粗多糖的脫色率為85.2%，多糖回收率為75.4%，兩項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其它條件組合。純化后產(chǎn)物的多糖含量提高至1.33 mg/g，為純化前的3.17倍。

3 結(jié)論

本研究探討大孔樹脂純化茯苓粗多糖的最佳工藝條件，通過比較7種大孔樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫效果，并結(jié)合樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)，確定采用AB-8型大孔樹脂純化提取的粗多糖。采用正交試驗(yàn)獲得最佳純化工藝為：配制5.0 mg/mL的茯苓多糖提取液，以2 BV/h流速上樣至柱體積為7 BV的AB-8型大孔樹脂內(nèi)吸附，隨后采用5 BV的50%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脫。通過定量分析結(jié)果表明，在最佳純化工藝條件下，茯苓粗多糖的脫色率達(dá)到85.2%，多糖回收率為75.4%，所得多糖含量為純化前的3.17倍，從而明顯改善目標(biāo)產(chǎn)物純度，為茯苓多糖下游產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供基礎(chǔ)，但采用該純化工藝后多糖回收率仍偏低，因此在后續(xù)工藝優(yōu)化中將會(huì)進(jìn)一步研究。

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Purification of Polysaccharides Extract from Poria cocos Using Macroporous Resin

ZHANG Hong-kun
（Institute of Food and Pharmacy，Shandong Institute of Commerce&Technology，Jinan 250103，Shandong China）

The seven types of macroporousresins were studied in order that observe effects of decolorizationand retention of polysaccharides in poria cocos extract.Through static adsorption and desorption experiment，AB-8 resin was found to be suitable for the purification of polysaccharides from poria cocos extract.By using dynamic adsorption and desorption experiments，the optimum purification conditions were obtained as follows：5.0 mg/mL poria cocos extract was loaded on the resin column which the volume was 7 BV at flow rate of 2 BV/h and eluted with 5 BV of 50%ethanol at flow rate of 2 BV/h.Under the optimum conditions，the resulting decolorization and polysaccharides retention rates of poria cocos extract was 85.2%and 75.4%，respectively.

macroporousresin；Poria cocos；polysaccharide；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.012

張洪坤（1974—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)。

2017-05-26