王金鑫，楊 爽，張?chǎng)析?，張炬紅，席景會(huì)，王 軍

吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062

西花薊馬蛋白的提取及雙向電泳體系的建立

王金鑫，楊 爽，張?chǎng)析危瑥埦婕t，席景會(huì)，王 軍?

吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062

【目的】蛋白樣品的制備是獲得良好雙向凝膠電泳(2-DE)圖譜的前提，建立合理的西花薊馬蛋白的雙向電泳體系，獲得分辨率較高、重復(fù)性較好的圖譜，能夠?yàn)楹罄m(xù)的研究提供有力支撐。【方法】實(shí)驗(yàn)以西花薊馬成蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)比了飽和酚法、TCA/丙酮法和直接裂解法3種蛋白提取方法，從中選出最適宜雙向電泳分析的一種蛋白提取方法?！窘Y(jié)果】3種方法蛋白提取率差異顯著，直接裂解法蛋白提取率最高，飽和酚法的蛋白提取率最低；3種方法的SDS-PAGE條帶數(shù)差異不明顯；TCA/丙酮法的雙向凝膠圖譜效果最好，蛋白點(diǎn)最多?！窘Y(jié)論】TCA/丙酮法能夠有效去除西花薊馬蛋白中的干擾物質(zhì)，是最適合西花薊馬雙向凝膠電泳的蛋白提取方法，為后續(xù)西花薊馬在蛋白組學(xué)方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

西花薊馬；雙向凝膠電泳；蛋白質(zhì)組學(xué)；蛋白提取

蛋白質(zhì)組學(xué)分析是后基因組時(shí)代的重要技術(shù)手段(黎飛，2010)，蛋白質(zhì)雙向電泳(two-di-mensional electrophoresis，2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)之一(Wang et al.，2008)。盡管蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)進(jìn)展比較迅速，2-DE仍然是進(jìn)行復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品分離的核心技術(shù)，蛋白質(zhì)樣品的制備是2-DE的關(guān)鍵，也是進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提(劉倩等，2010)。

西花薊馬Frankliniella occidentalis(Pergande)又稱苜蓿薊馬，屬纓翅目 Thysanoptera薊馬科Thripidae，是一種危害性嚴(yán)重的外來(lái)入侵物種，寄主種類多(張安盛等，2012；周衛(wèi)川等，2006)。隨著國(guó)際貿(mào)易往來(lái)的日趨頻繁，該蟲(chóng)隨花卉和蔬菜的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸迅速向世界各地?cái)U(kuò)散(張桂芬，2014)。為從蛋白層面上揭示西花薊馬的入侵機(jī)制，建立適用于蛋白質(zhì)雙向電泳分析的薊馬全蛋白提取方法十分必要。薊馬蛋白質(zhì)含量相對(duì)較低，成份復(fù)雜，富含核酸、脂類及多糖等干擾物質(zhì)，這些物質(zhì)給蛋白質(zhì)的定量和分析帶來(lái)了困難。加之一些幾丁質(zhì)、肌動(dòng)蛋白、骨骼蛋白等不易溶解，使得薊馬的蛋白提取比較困難。本實(shí)驗(yàn)以西花薊馬成蟲(chóng)為材料，對(duì)不同的蛋白質(zhì)提取方法進(jìn)行了比較研究，為薊馬蛋白質(zhì)樣品的制備提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

西花薊馬采于吉林大學(xué)校園的萬(wàn)壽菊中，將其飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲(chóng)室自然條件下生長(zhǎng)的地被菊上，溫度控制在(25±2)℃、相對(duì)濕度40%～50%、光周期L∶D＝16 h∶8 h。收集成蟲(chóng)作為試蟲(chóng)，采集后分裝于離心管中，凍于-80℃冰箱中備用。

1.2 蛋白的提取

1.2.1 飽和酚法 參考Faurobert et al.(2007)的方法，取-80℃凍存的成蟲(chóng)樣品，置于液氮中充分研磨，分別加入1 mL-20℃預(yù)冷的10%TCA/丙酮溶液、甲醇和80%的丙酮溶液，充分懸浮后，于4℃、15000 r·min-1的條件下各自離心洗滌5 min，棄上清，得到的沉淀于室溫下干燥2 min；加入等體積的飽和酚溶液和dense SDS buffer(0.1 mol·L-1pH 8.0 Tris-HCl、2%SDS、2%β-巰基乙醇、30%蔗糖)，充分混勻震蕩，于 4 ℃、15000 r·min-1離心5 min，取酚層加入5倍體積的0.1 mol·L-1乙酸銨溶液，于-20 ℃ 下沉淀 2 h；4 ℃、15000 r·min-1離心15 min，沉淀用80%丙酮洗滌2～3次，將沉淀于室溫下干燥后，置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TCA/丙酮法 參考Méchin et al.(2007)的方法，取-80℃凍存的成蟲(chóng)樣品，置于液氮中充分研磨，加入1 mL-20℃預(yù)冷的10%TCA/丙酮，充分震蕩混勻，于-20℃冷藏 2 h以上；4℃、15000 r·min-1離心 15 min，棄上清；沉淀用 1 mL冷丙酮充分懸浮，-20℃冷藏 30 min；4℃、15000 r·min-1離心 5 min，棄上清；沉淀用 1 mL 80%冷丙酮充分懸浮，-20℃冷藏30 min；4℃、15000 r·min-1離心 5 min，棄上清；將沉淀干燥2 min，蛋白沉淀置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 直接裂解法 參考Nguyen et al.(2007)的方法，取-80℃凍存的成蟲(chóng)樣品，置于液氮中充分研磨，加入適量4℃預(yù)冷的裂解液，充分震蕩混勻，4℃、12000 r·min-1離心 15 min，取上清，4 ℃、15000 r·min-1離心 40 min，取上清，樣品凍于-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白濃度的測(cè)定

取-80℃凍存的蛋白樣品，根據(jù)樣品的量加入適量的 lysis buffer充分渦旋，30℃孵育 1.5 h，20℃、13000 r·min-1離心30 min，取上清進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

參照Bradford(1976)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4 SDS-PAGE凝膠電泳

分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%。采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行染色。染色后的凝膠用Epson Expression 10000XL掃描儀掃描。利用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.5 雙向凝膠電泳

取300μg蛋白溶液于離心管中，加入6.8μL IPG buffer，加入lysis buffer至340μL充分震蕩混勻，將18 cm pH 3～10的IPG膠條覆蓋于該溶液上方，在水化槽中水化16 h以上。在等電聚焦儀中進(jìn)行第一向等電聚焦。在膠條平衡緩沖液(6 mol·L-1尿素、2%SDS、30%甘油、50 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.8、0.002%溴酚藍(lán))中分別加入1%DTT和2.5%碘乙酰胺溶液，使用搖床震蕩15 min進(jìn)行膠條平衡后將膠條轉(zhuǎn)移至聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行第二向垂直電泳。使用銀染方法進(jìn)行凝膠染色(Yan et al.，2000)。染色后用Epson Expression 10000 XL掃描儀掃描，利用ImageMasterTM 2D Platinum 7.0軟件進(jìn)行圖像分析，每種提取方法重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白產(chǎn)率分析

3種方法提取的蛋白產(chǎn)率利用Sigma軟件制作圖，結(jié)果如圖1所示，直接裂解法的平均蛋白提取率最高，為57.9 μg·mg-1，TCA/丙酮法為 46.2 μg·mg-1，飽和酚法為22.6μg·mg-1。通過(guò)instat軟件對(duì)其進(jìn)行顯著性差異分析，其中TCA/丙酮法與飽和酚法和直接裂解法差異性不顯著(p＞0.05)，飽和酚法與直接裂解法具有顯著性差異(p＜0.05)。

2.2 SDS-PAGE圖譜分析

將3種方法提取的蛋白以相同的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，3種方法的條帶數(shù)目差異不明顯。直接裂解法條帶最多，為31條，但蛋白條帶不明顯；飽和酚法30條，TCA/丙酮法28條，條帶最為清晰明顯。蛋白分布差異不大，主要集中于25.0 ku以上和14.4～18.4 ku之間(圖2)。

圖1 3種方法提取蛋白質(zhì)的產(chǎn)率Fig.1 The rate of protein extraction from the three methods

圖2 3種方法提取西花薊馬總蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE analysis of F.occidentalis using three protein extraction methods

2.3 雙向電泳圖譜分析

TCA/丙酮法、飽和酚法和直接裂解法提取總蛋白的雙向圖譜如圖3所示。相對(duì)于直接裂解法，飽和酚法和TCA/丙酮法得到的蛋白純度較高，雜質(zhì)較少，能夠得到背景相對(duì)清晰的圖譜。直接裂解法由于蛋白純度較低，雜質(zhì)較多，得到的圖譜整體背景不清晰，蛋白點(diǎn)最少且形狀不規(guī)則，在45.0 ku和25.0 ku處有明顯彌散現(xiàn)象。

TCA/丙酮法、飽和酚法和直接裂解法分別得到平均429、330和235個(gè)蛋白點(diǎn)。TCA/丙酮法蛋白點(diǎn)最多，蛋白點(diǎn)顏色層次分明，蛋白點(diǎn)形狀規(guī)則；飽和酚法圖譜背景較清晰，蛋白點(diǎn)形狀規(guī)整，但蛋白點(diǎn)顏色普遍較淺，蛋白點(diǎn)較TCA/丙酮法少。3種方法提取的蛋白點(diǎn)分子質(zhì)量大小主要集中在40 ku以下，酸性蛋白點(diǎn)略比堿性蛋白點(diǎn)多(圖4)。

3 討論

蛋白質(zhì)樣品的制備是進(jìn)行2-DE的關(guān)鍵步驟，也是進(jìn)行昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提(Gygi et al.，2000)。由于昆蟲(chóng)組織中所含有的色素、幾丁質(zhì)、醌類及其他多種代謝產(chǎn)物的干擾，獲得重復(fù)性好的2-DE圖譜相對(duì)比較困難(Liao et al.，2016)。本研究比較了3種不同蛋白提取方法對(duì)西花薊馬2-DE結(jié)果的影響，以尋找一種適用于西花薊馬等薊馬類成蟲(chóng)的雙向電泳方法，為后續(xù)薊馬類蛋白質(zhì)組分析奠定一定的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用的3種蛋白提取方法，在蛋白提取率上存在明顯差異，直接加入lysis buffer的直接裂解法步驟簡(jiǎn)單，可以避免沉淀造成的蛋白損失(Carpentier et al.，2005； Laville et al.，2009)。 它的原理是將可溶性蛋白溶解在裂解液中，能夠有效減少蛋白的降解。由于lysis buffer中含有高濃度的尿素和硫脲，二者聯(lián)合發(fā)揮協(xié)同作用，可以增強(qiáng)溶解疏水性蛋白效應(yīng)，因此蛋白產(chǎn)率較高。直接裂解法得到的SDS-PAGE圖譜上的條帶較為模糊，蛋白樣品中含有雜質(zhì)較多。樣品中鹽離子的濃度也會(huì)影響2-DE的效果。鹽離子增加膠條的導(dǎo)電性并引起電內(nèi)滲，進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)的等電聚焦，導(dǎo)致聚焦不完全，從而在雙向電泳圖譜產(chǎn)生水平條紋(劉倩等，2010)。直接裂解法沒(méi)有洗滌樣品的步驟，雜質(zhì)和鹽分含量較高，更多的脂質(zhì)和核酸會(huì)干擾蛋白質(zhì)的聚焦和分離(Canas，2007； Lee，2010)。 直接裂解法制備的蛋白在等點(diǎn)聚焦過(guò)程中，電壓上升慢，耗時(shí)長(zhǎng)，2-DE圖譜背景不清晰，蛋白點(diǎn)少，出現(xiàn)多處橫條紋。

圖3 不同蛋白提取方法的2-DE凝膠圖譜Fig.3 2-DE analyses of proteins from the three extraction methods

圖4 不同蛋白提取方法分析Fig.4 Analysis of different protein extraction methods

酚是強(qiáng)的蛋白變性劑，可以使細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)變性析出。在提取時(shí)，蛋白能很好地溶于酚層，而核酸和一些小分子物質(zhì)溶于水相而被清除(付涵予等，2011)。飽和酚法得到的圖譜背景清晰，在等點(diǎn)聚焦過(guò)程中電壓升得快，耗時(shí)短，但該方法的蛋白提取率較低，操作相對(duì)繁瑣，出現(xiàn)少量橫條紋。

大部分蛋白可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)可溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中(楊爽等，2016)。TCA/丙酮法能有效去除蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)，是一種廣泛應(yīng)用的蛋白提取方法(Hao et al.，2015)。丙酮通過(guò)有機(jī)溶劑破壞蛋白質(zhì)的水化層，降低介電常數(shù)，增強(qiáng)帶電蛋白質(zhì)分子的相互作用，促進(jìn)蛋白的聚集沉淀；同時(shí)作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團(tuán)，使之聚集沉淀(G?rg et al.，2004)。TCA/丙酮法可以很好地去除西花薊馬成蟲(chóng)蛋白中的干擾物質(zhì)，其2-DE圖譜背景清晰，蛋白點(diǎn)較多且清晰，形狀規(guī)則。無(wú)論從圖譜清晰度還是從蛋白分布情況來(lái)看，TCA/丙酮法都是適合西花薊馬蛋白提取的方法。

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Protein extraction of Frankliniella occidentalis and establishment of two-dimensional electrophoresis system

WANG Jinxin， YANG Shuang， ZHANG Xinxin， ZHANG Juhong， XI Jinghui， WANG Jun?
College of Plant Science， Jilin University， Changchun， Jilin 130062， China

【Aim】Protein sample preparation is the prerequisite to obtain an optimal two-dimensional electrophoresis(2-DE)gel map.Establishing a suitable 2-DE system can provide a strong support for the subsequent research.【Method】 This study used Frankliniella occidentalis adults as experimental materials， and compared three protein extraction methods:Tris-phenol， TCA/acetone precipitation，and direct decomposition extraction.The most suitable method of 2-DE system was defined through the analysis of 2-DE protein images.【Result】 Experimental results revealed that the three methods showed significant differences in protein extraction rate，among which the direct decomposition method was the highest while Tris-phenol method was the lowest.The three methods got similar SDS-PAGE results.TCA/acetone method had the best quality of 2-DE gel map，with the highest number of protein spots.【Conclusion】 The results suggest that TCA/acetone method could remove interfering substance effectively and was optimal for protein extraction of F.Occidentalis.It laid foundation of further study on the proteomics of F.occidentalis.

Frankliniella occidentalis； 2-DE； proteomics； protein extraction

10.3969/j.issn.2095-1787.2017.04.004

2017-06-21 接受日期(Accepted):2017-08-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201576)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150309006NY、20160520035JH)

王金鑫，女，碩士研究生。研究方向:昆蟲(chóng)分子生物學(xué)。E-mail:jxwang16＠m(xù)ails.jlu.edu.cn

?通信作者(Author for correspondence)， E-mail:wang＿jun＠jlu.edu.cn

(責(zé)任編輯:郭瑩)