龔夢鵑， 巫圣乾，岳 賀，王淑美，梁生旺，鄒忠杰

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 2. 國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點(diǎn)研究室， 3.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006)

代謝組學(xué)是上世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，它是通過考察生物體系受刺激或干擾后(如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后)其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的代謝途徑的一種技術(shù)[2]。代謝組學(xué)技術(shù)為中醫(yī)藥的整體評價和研究提供了可能，已廣泛用于中藥及其復(fù)方的研究[3-4]。

本文采用1H-NMR技術(shù)分析CCl4急性肝損傷模型大鼠、正常大鼠、護(hù)肝片給藥組大鼠的尿液和糞便成分譜變化，結(jié)合模式識別方法分類，尋找并解釋標(biāo)記物歸屬，聯(lián)系機(jī)體代謝通路和代謝網(wǎng)絡(luò)，闡述CCl4致大鼠急性肝損傷的尿液和糞便代謝輪廓變化及護(hù)肝片對相關(guān)代謝通路和潛在生物標(biāo)志物的干預(yù)作用，為護(hù)肝片的保肝作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1動物Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，體質(zhì)量180～200 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SPF級，合格證號SCXK(粵)2013-0034。飼養(yǎng)環(huán)境光照每天12 h，溫度(22±2)℃，濕度 45%～55% 。

1.2藥物與試劑護(hù)肝片(黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司，批號：201609128)；四氯化碳(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20170102)； 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase, ALP)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)和乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為：20170412、20170331、20170411和20170408)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Sigma公司，批號：K40104)；氘水(D2O，美國Sigma公司，批號：1001484275)。

1.3儀器Bruker AVANCE III 500 MHz 全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀(瑞士 Bruker公司)；AMS18全自動生化儀(北京奧普森公司)；1-14型低溫離心機(jī)(德國Sigma公司)。

2 方法

2.1分組與給藥參考文獻(xiàn)方法[1]，將36只♂ SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成正常組、模型組和護(hù)肝片組。護(hù)肝片組灌胃護(hù)肝片混懸液(0.5% CMC-Na溶解)，劑量為1.7 g·kg-1，正常組和模型組灌胃給予等體積的溶劑，每天1次，連續(xù)9 d。末次給藥后1 h，模型組及護(hù)肝片組大鼠腹腔注射50% CCl4花生油溶液1 mL·kg-1，正常組腹腔注射等體積的花生油溶液。每組一半動物用于測量血清生化指標(biāo)水平，另一半動物用于尿液和糞便代謝組學(xué)分析。

2.3尿液采集及預(yù)處理參考文獻(xiàn)方法[5]，腹腔注射CCl4后，大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液。尿液收集時，代謝籠集尿器置于冰上，加入0.5 mL 2% NaN3溶液做防腐劑。400 μL尿液中加入200 μL磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4, pH 7.4)，靜置20 min后離心(4 000 r·min-1, 15 min, 4℃)，取上清液500 μL加至5 mm NMR測試管中，再加入50 μL D2O(含有0.05% W/V TSP-d4)，振蕩混勻，待測。

在城市軌道交通系統(tǒng)中，不僅列車消耗電能，而且由于接觸網(wǎng)和導(dǎo)軌有電阻的存在，同樣會消耗能量[9]。尤其在線路運(yùn)行高峰期，由于負(fù)荷較大，供電電流較大，則線損亦比較大。因此，多列車運(yùn)行的能耗目標(biāo)要綜合考慮線路的損耗和列車的能量消耗。以所有牽引變電所發(fā)出的能量總額為目標(biāo)，設(shè)全線牽引變電所的編號為P=[P1,P2，P3,…，Pi,…,PN]，Pi站的電壓和電流分別為UPi和IPi，對應(yīng)的能耗為EPi，則列車全天的能耗量為：

2.4糞便提取及預(yù)處理參考文獻(xiàn)方法[6]，100 mg糞便加入800 μL磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4, pH 7.4)和200 μL D2O(含有0.05% W/V TSP-d4)勻漿，勻漿液室溫超聲提取30 min后離心(12 000 r·min-1，10 min，4℃)，取上清液550 μL加至5 mm NMR測試管中，待測。

2.51H-NMR測定實(shí)驗(yàn)溫度為298K，尿液和糞便樣本均采用預(yù)飽和的1D NOESY脈沖序列壓制水峰。尿液樣本弛豫延遲時間3 s，采集時間3.28 s。糞便樣本弛豫延遲時間2 s，采樣時間1.64 s。尿液和糞便樣本譜寬10 kHz，采樣點(diǎn)數(shù)64 K，采集次數(shù)128次。

2.61H-NMR圖譜處理及多變量數(shù)據(jù)分析采用線寬為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行傅立葉變換。運(yùn)用軟件MestReNova 6.1(西班牙Mestrelab Research公司)對所獲譜圖進(jìn)行手動相位和基線校正后，參照TSP(δ 0.0)對1H-NMR譜的化學(xué)位移進(jìn)行定標(biāo)。在δ 0.5～9.5區(qū)域按δ0.01等間隔分段積分，然后將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ASCⅡ文件輸出到Excel 2010中進(jìn)行下一步處理。對于尿液和糞便樣本，分別將區(qū)域δ 4.49～5.98和δ 4.70～5.15設(shè)為0積分段，在進(jìn)行多變量數(shù)據(jù)分析之前對各分段積分值進(jìn)行歸一化處理，所得數(shù)據(jù)乘以10 000后導(dǎo)入SIMCA-P 12.0 (Umetrics AB, Ume?/Malm?, Sweden)，經(jīng)Pareto標(biāo)度化預(yù)處理后，進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

3 結(jié)果

3.1護(hù)肝片對CCl4致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST、ALP、LDH水平的影響與正常組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP、LDH水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，護(hù)肝片組大鼠血清中AST、ALT、ALP、LDH水平均明顯降低(P<0.05)，表明護(hù)肝片能明顯回調(diào)CCl4致急性肝損傷大鼠血清中升高的AST、ALT、ALP、LDH水平，提示護(hù)肝片能有效預(yù)防急性肝損傷(Tab 1)。

3.2尿液和糞便代謝輪廓分析大鼠尿液和糞便的1H-NMR譜圖如Fig 1、2所示。代謝物譜峰的歸屬主要依據(jù)化學(xué)位移值、峰的裂分情況、偶合常數(shù)及參考文獻(xiàn)報道[7-8]。

Fig 1 1H-NMR spectra of rat urine

A:Control group; B: Model group; C: Hugan Tablets group

Fig 2 1H-NMR spectra of rat feces

A:Control group;B:Model group;C:Hugan Tablets group

3.3OPLS-DA分析結(jié)果如Fig 3A、3B所示，正常組和模型組的尿液和糞便樣本點(diǎn)在PC1維可以完全區(qū)分開，說明CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷后大鼠機(jī)體生理及物質(zhì)代謝狀況發(fā)生了明顯的改變。本研究采用7倍交叉驗(yàn)證法對OPLS-DA模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，得到了OPLS-DA 模型的主要參數(shù)，尿液：R2X(cum)=0.86，R2Y(cum)=0.99，Q2(cum)=0.89；糞便：R2X(cum)=0.84，R2Y(cum)=0.97，Q2(cum)=0.84。從上述參數(shù)可以看出本研究建立的模型具有較高的可靠性。

Tab 1 Effect of HGT on level of ALT, AST, ALP and LDH in serum of rats with CCl4-induced acute hepatic injury(±s, n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 3 OPLS-DA score plots derived from 1H-NMR spectra of rat urine(A, C) and feces(B, D)

▲: Control group; ●: Model group; ◆: Hugan Tablets group

3.4與CCl4致急性肝損傷相關(guān)潛在生物標(biāo)志物的鑒定本研究使用OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來評價內(nèi)源性代謝物相對峰面積在正常組和模型組間的差異。只有同時滿足VIP>1和P<0.05的代謝物才被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物。按照上述原則，最終在大鼠尿液和糞便中分別篩選得到7種和3種與急性肝損傷相關(guān)生物標(biāo)志物(Tab 2、3)。

3.5護(hù)肝片對CCl4致急性肝損傷大鼠尿液和糞便代謝指紋譜和相關(guān)標(biāo)志物的干預(yù)作用護(hù)肝片組樣本點(diǎn)與模型組樣本點(diǎn)可以完全分離，且與正常組樣本點(diǎn)接近，表明護(hù)肝片能有效干預(yù)急性肝損傷(Fig 3C、3D)。同時，護(hù)肝片能分別使急性肝損傷大鼠尿液和糞便中5種和3種潛在生物標(biāo)志物明顯回調(diào)(Tab 2、3)。從上述結(jié)果可以看出，護(hù)肝片對CCl4致急性肝損傷大鼠尿液和糞便代謝紊亂能產(chǎn)生有效的干預(yù)作用。

Tab 2 Potential biomarkers related to CCl4-induced acute hepatic injury in rat urine(±s,n=6)

s, singlet; d, doublet; t, triplet; m, multiplet.*P<0.05vsmodel group

Tab 3 Potential biomarkers related to CCl4-induced acute hepatic injury in rat feces(±s,n=6)

s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet, m, multiplet.*P<0.05vsmodel group

4 討論

CCl4是經(jīng)典的化學(xué)性肝毒劑，腹腔注射致大鼠肝損傷模型重現(xiàn)性好，既可以造成肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)性損傷，又可以引起肝功能異常。自由基的形成及引發(fā)的鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)是CCl4所致肝損傷主要機(jī)制[9]，肝細(xì)胞受到自由基攻擊，細(xì)胞膜通透性升高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶釋放，引起血清酶升高。

本實(shí)驗(yàn)通過CCl4誘導(dǎo)復(fù)制了SD大鼠急性肝損傷模型，AST、ALT、ALP、LDH存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)血清中上述指標(biāo)升高時提示肝臟損傷。模型組較正常組大鼠血清中AST、ALT、ALP、LDH 水平升高，而護(hù)肝片降酶保肝能力明顯。

與前期報道相一致[10]，本研究通過尿液代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CCl4可引起機(jī)體三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)紊亂。TCA是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)和檸檬酸(Citrate)是三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物。在三羧酸循環(huán)第一步反應(yīng)中，檸檬酸合成酶(citrate synthase，CSY)可催化乙酰輔酶A的乙基與草酰乙酸的酮基結(jié)合生成檸檬酰輔酶A，以便后續(xù)高能硫酸鍵水解，釋放出輔酶A，得到檸檬酸。而異檸檬酸轉(zhuǎn)變成α-酮戊二酸時需要異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)的參與。上述反應(yīng)均為不可逆反應(yīng)，CSY與IDH均為反應(yīng)中的限速酶[10]。在CCl4致大鼠急性肝損傷的情況下，α-酮戊二酸和檸檬酸水平明顯降低，表明CCl4肝損傷引起三羧酸循環(huán)被破壞，這可能與大鼠接觸CCl4后抑制CSY與IDH活性有關(guān)。而給予護(hù)肝片可以使α-酮戊二酸和檸檬酸水平明顯升高，說明護(hù)肝片可調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)，其機(jī)制可能與提高CSY與IDH活性有關(guān)。

此外，馬尿酸(hippurate)是由甘氨酸和苯甲酸在肝臟中結(jié)合生成，而苯甲酸主要是由腸道微生物代謝膳食中的芳香酸或多酚生成。腸道厭氧菌代謝苯丙胺生成苯乙酸，在肝臟中苯乙酸與甘氨酸結(jié)合生成苯乙酰甘氨酸(phenylacetylglycine)。膽堿在腸道菌群的作用下生成三甲胺，進(jìn)而被肝臟黃素單加氧酶代謝成氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide)[11]。因此，模型組大鼠尿液中馬尿酸水平降低，氧化三甲胺和苯乙酰甘氨酸水平升高，表明大鼠體內(nèi)腸道菌群平衡被破壞。而護(hù)肝片能提高馬尿酸水平和降低氧化三甲胺水平，說明其能通過調(diào)節(jié)腸道菌群代謝產(chǎn)生保肝作用。

糞便提取液中的代謝物作為腸道菌群和宿主共代謝的產(chǎn)物，不僅可以反映機(jī)體內(nèi)腸道菌群的狀態(tài)，而且具有豐富的代謝物信息，同時在共棲菌與宿主之間起著紐帶作用。不易消化的碳水化合物是結(jié)腸微生物重要的能量來源，菌種如多形擬桿菌及卵形擬桿菌所含的糖苷酶和裂解酶基因是人的2倍多，它們能利用幾乎所有的植物及宿主的聚糖(如黏蛋白相關(guān)的糖蛋白)，腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸中丁酸(butyrate)最為重要，其在結(jié)腸上皮細(xì)胞中常作為細(xì)胞代謝的能量底物[12]。CCl4肝損傷模型大鼠糞便中葡萄糖(glucose)和丁酸水平降低，說明CCl4可能引起了腸道菌群結(jié)構(gòu)與組成的變化，護(hù)肝片能逆轉(zhuǎn)葡萄糖和丁酸的變化，表明護(hù)肝片可減輕腸道菌群紊亂。

綜上所述，本研究采用1H-NMR檢測灌服護(hù)肝片的CCl4急性肝損傷大鼠的尿液和糞便中內(nèi)源性代謝物變化，對護(hù)肝片在體內(nèi)的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。護(hù)肝片能調(diào)節(jié)機(jī)體三羧酸循環(huán)和腸道菌群代謝，達(dá)到干預(yù)CCl4致急性肝損傷時代謝組學(xué)變化的作用，進(jìn)而改善肝功能，減輕肝損傷。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心、國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點(diǎn)研究室、廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心完成，特別感謝實(shí)驗(yàn)中心吳霞老師的幫助。)

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