陳 寧，郝 軍，朱桂云，安曉穎，康麗菲，李曉霞，楊永輝

(1. 河北省胸科醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050041；2. 河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目前普遍認為腎小管間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病發(fā)展為終末期腎功能衰竭(end-stage renal disease, ESRD)的病理基礎(chǔ)，而腎小管上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)以及導(dǎo)致的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過度積聚是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生的前提[1]。新近研究揭示PI3K/Akt信號通路的異常激活與糖尿病腎病ECM沉積相關(guān)[2]。而硫酯酶超家族成員4(thioesterase superfamily member 4, THEM4)作為Akt的內(nèi)源性負向調(diào)控因子[3]是否參與了糖尿病腎病ECM沉積的發(fā)生，目前尚未見報道。因此，本研究通過構(gòu)建THEM4過表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至人腎小管上皮細胞(human renal proximal tubular epithelial cell, HKC)內(nèi)，觀察高糖刺激下PI3K/Akt/THEM4的表達與膠原分泌的關(guān)系(膠原是ECM的主要組成成分)，以及過表達THEM4能否起到干預(yù)作用，為糖尿病腎病ECM沉積的防治提供新的思路。

1 材料

1.1細胞株人腎小管上皮細胞株HKC來自河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實驗室凍存。

1.2試劑pYr-ads-4-THEM4 vector、pYr-adshuttle-4 empty vector均購自長沙贏潤生物有限公司；人Collagen Ⅰ ELISA試劑盒、人Collagen Ⅲ ELISA試劑盒均購自BlueGene Biotech；TRITC-羊抗兔IgG、兔抗THEM4單克隆抗體(14692-1-AP)、兔抗β-actin單克隆抗體(20536-1-AP)、兔抗α-SMA單克隆抗體(14295-1-AP)，均購自美國Protein Tech公司；兔抗phospho-Akt (Ser 473)單克隆抗體(#4060)、兔抗Akt單克隆抗體，均購自美國Cell Signaling公司；兔抗TGF-β1單克隆抗體(#AP12348a) 購自ABGENT。

1.3儀器熒光顯微鏡、相差倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)；高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1HKC細胞實驗分組用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人腎小管上皮細胞，采用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染pYr-ads-4-THEM4表達質(zhì)粒及pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后的細胞進行G418(800 mg·L-1)抗性篩選，將篩選出的陽性克隆細胞進行傳代培養(yǎng)。經(jīng)同步化后，將細胞隨機分為正常對照組(5.5 mmol·L-1,Control)、高糖組(30 mmol·L-1, HG)、高糖+pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(HG+THEM4)、高糖+pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒對照組(HG+V)。后3組經(jīng)高糖刺激48 h后終止培養(yǎng)，收集細胞進行免疫熒光化學(xué)染色和細胞總蛋白提取。

2.2免疫熒光細胞化學(xué)檢測采用6孔板細胞爬片，培養(yǎng)終止后，細胞用0.01 mol·L-1PBS沖洗數(shù)次，4%多聚甲醛固定30 min；0.5% Triton X-100 37℃打孔10 min，PBS沖洗，5 min×3次；正常山羊血清封閉，37℃孵育1 h；棄封閉液，滴加1 ∶200稀釋的THEM4一抗，4℃過夜；PBS沖洗，5 min×3次;滴加TRITC-羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBS沖洗，5 min×3次；滴加 DAPI(1：100配制)，37℃孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；熒光顯微鏡下觀察并攝取圖像。

2.3Westernblot檢測蛋白表達收集各組細胞并加入冰冷的裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.4、150 mmol·L-1NaCl、1 mmol·L-1EDTA、aprotinin 2 mg·L-1、PMSF 100 mg·L-1)200 μL，提取總蛋白。采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，分裝后-80℃保存。每個樣品取50 μg總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5% BSA 37℃封閉1 h，一抗[THEM4、Akt、phospho-Akt(Ser 473)、α-SMA、TGF-β1、β-actin，1 ∶1 000稀釋] 4℃過夜。TBST洗膜后，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1 ∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h；TBST洗膜，滴加ECL增強化學(xué)發(fā)光試劑，Odyssey FC成像系統(tǒng)顯影。用美國UVP公司LabWorks 4.5軟件對條帶進行定量分析，讀取積分光密度值(IOD)，目的蛋白條帶的IOD值除以內(nèi)參條帶的IOD值作為最終結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2.4ELISA法檢測細胞上清液中ColⅠ、ColⅢ的含量先后加入稀釋后的標準品50 μL、待測樣品50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)，立即加入50 μL生物素標記的一抗，輕輕振蕩混勻，37℃孵育45 min。甩去孔內(nèi)液體，震蕩洗滌4次，每次30 s。每孔加入100 μL辣根酶標記的二抗，輕輕振蕩混勻，37℃孵育30 min。甩去孔內(nèi)液體，震蕩洗滌4次，每次30 s。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃孵育5 min，避免光照。取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，立即測定結(jié)果。在450nm波長處測定各孔的OD值。以標準品的吸光度OD值為縱坐標，相應(yīng)標準品濃度為橫坐標，做出標準曲線，樣品含量根據(jù)其OD值，由標準曲線換算出相應(yīng)濃度。

3 結(jié)果

3.1pYr-ads-4-THEM4表達質(zhì)粒抑制高糖刺激下人腎小管上皮細胞內(nèi)phospho-Akt蛋白的活化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Western blot法檢測THEM4蛋白的表達，F(xiàn)ig 1結(jié)果顯示，pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功逆轉(zhuǎn)了高糖刺激下人腎小管上皮細胞內(nèi)THEM4的低表達，與pYr-adshuttle-4 空質(zhì)粒組相比，THEM4的表達上調(diào)了1.98倍。同時，F(xiàn)ig 2免疫熒光結(jié)果顯示，THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與高糖組及pYr-adshuttle-4 空質(zhì)粒組相比，THEM4表達明顯增加，主要定位于人腎小管上皮細胞的胞質(zhì)。與THEM4的表達恰好相反，高糖可誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞phospho-Akt (Ser 473)的活化，而經(jīng)pYr-ads-4-THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，phospho-Akt (Ser 473)的表達明顯降低，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比下調(diào)了35.11%，而總Akt的表達在各組間未見明顯差異 (Fig 1)。

3.2pYr-ads-4-THEM4表達質(zhì)粒抑制高糖刺激下人腎小管上皮細胞α-SMA及TGF-β1蛋白的表達Western blot法進一步檢測了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并給予高糖刺激后，人腎小管上皮細胞內(nèi)α-SMA及TGF-β1的表達情況。Fig 3結(jié)果顯示，高糖刺激時人腎小管上皮細胞內(nèi)α-SMA、TGF-β1的表達明顯增強，而經(jīng)THEM4表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，二者的表達均被明顯抑制，與空質(zhì)粒對照組相比，二者分別下調(diào)了51.59%、76.53%。

Fig 1 THEM4, phospho-Akt (Ser 473) and Akt in HKC cells by Western blot

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG+V group

Fig 2 Immunofluorescence staining for THEM4 protein (indicated in red) with DAPI counterstaining in HKC cells

White arrows show positive signal. Scale bar: 50 μm. A: Control group; B: HG group; C: HG+THEM4 group; D: HG+V group

Fig 3 Expression of α-SMA and TGF-β1 protein in HKC cells by Western blot

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG+V group

3.3pYr-ads-4-THEM4表達質(zhì)粒抑制高糖刺激下人腎小管上皮細胞ColⅠ、ColⅢ的分泌ELISA法檢測了各組細胞上清液中ColⅠ、ColⅢ的分泌情況。如Fig 4所示，高糖刺激后48 h，ColⅠ、ColⅢ的分泌較正常對照組明顯增加(P<0.05)，而經(jīng)pYr-ads-4- THEM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，ColⅠ、ColⅢ的分泌較空質(zhì)粒對照組分別下調(diào)了32.31%、51.83%。

4 討論

Fig 4 Secretion of Co lⅠ and Col Ⅲ in HKC cells by ELISA

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG+V group

新近研究報道，高糖可誘導(dǎo)PI3K/Akt/mTORC1通路的活化，上調(diào)人腎小管上皮細胞骨橋蛋白(osteopontin，OPN) 的表達，而應(yīng)用LY294002(PI3K特異性抑制劑)以及雷帕霉素(mTORC1特異性抑制劑)后，OPN表達明顯降低?？梢?，通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活將為糖尿病腎病的防治提供新的干預(yù)靶點[4]。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，高糖可誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞內(nèi)膽固醇蓄積，進而引起細胞脂質(zhì)代謝異常[5]。那么，PI3K/Akt/THEM4通路是否參與高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞ECM的分泌呢？因此，本研究通過編碼THEM4的表達質(zhì)粒pYr-ads-4-THEM4并轉(zhuǎn)染至人腎小管上皮細胞內(nèi)，觀察過表達THEM4對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞膠原分泌的影響。

THEM4又稱C末端調(diào)節(jié)蛋白，在多種組織及細胞中被揭示，可抑制Akt的磷酸化活性，是Akt的一種內(nèi)源性抑制因子[3]。近年來，對THEM4基因?qū)W的研究越來越多[6-7]，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)THEM4是一種與人體代謝相關(guān)的基因之一，可能與慢性腎臟疾病、糖尿病以及心血管疾病的發(fā)生相關(guān)[8]。Mondal等[9]發(fā)現(xiàn)THEM4基因可能是位于1號染色體長臂21-24區(qū)的一種易感基因，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)糖平衡狀態(tài)而增加2型糖尿病的易感性。Shin等[10]發(fā)現(xiàn)，在H-ras12V肝癌小鼠模型中，THEM4通過抑制Akt1磷酸化，抑制腫瘤細胞的增殖和血管生成，具有一定的抗腫瘤效應(yīng)。新近研究報道，維生素D具有上調(diào)THEM4的功能，進而通過抑制巨噬細胞Akt/NF-κB信號通路介導(dǎo)的COX-2釋放，在一些炎癥性疾病甚至腫瘤的治療中具有輔助效果[11]。

本研究結(jié)果證實了高糖介導(dǎo)的人腎小管上皮細胞THEM4的低表達及phospho-Akt(Ser 473)的活化是引起α-SMA、TGF-β1表達上調(diào)，進而導(dǎo)致膠原分泌的重要發(fā)病機制。而THEM4作為Akt的內(nèi)源性抑制因子，過表達THEM4通過抑制phospho-Akt(Ser 473)的活化，下調(diào)α-SMA以及TGF-β1表達，從而減少高糖刺激的人腎小管上皮細胞膠原分泌?？梢姡琍I3K/Akt/THEM4信號通路是糖尿病腎臟ECM沉積的重要通路，而通過應(yīng)用Akt的內(nèi)源性抑制劑THEM4后能夠抑制高糖誘導(dǎo)的膠原分泌，減輕ECM積聚。

我們下一步的研究將在體外實驗的基礎(chǔ)上，通過尾靜脈注射將THEM4表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至糖尿病小鼠體內(nèi)，進一步觀察THEM4在糖尿病小鼠體內(nèi)的表達及影響，從整體水平上探討糖尿病腎病ECM沉積的發(fā)生機制，為其防治提供理論依據(jù)。

(致謝：本實驗于河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實驗室完成，感謝實驗室全體老師的幫助。)

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