周曉楠，宋雪蘭，李 艷，宋 波，楊建光，何芳雁

(云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，云南 昆明 650500)

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是由于腦血流的突然中斷導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡和神經(jīng)缺陷的一類疾病，是全世界主要的健康危機(jī)[1]。腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI)是導(dǎo)致IS進(jìn)一步惡化的重要原因。課題組前期研究表明，天麻乙酸乙酯提取物具有明顯的抗CIRI的作用，其作用機(jī)制與抗神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)[2]。對(duì)羥基苯甲醛(4-hydroxybenzaldehyde，4-HBd，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)Fig 1)是天麻主要活性成分之一[3]，前期課題組已證實(shí)，4-HBd具有抗炎[4]、抗血小板聚集作用[5]，同時(shí)有明顯的血管平滑肌松弛[6]等作用。本研究采用線栓法復(fù)制大鼠腦缺血/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)損傷模型，Longa 5分法對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評(píng)分、TTC染色法檢測(cè)腦梗死體積，以評(píng)價(jià)4-HBd對(duì)CIRI的保護(hù)作用；培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元，復(fù)制缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/Rep)損傷模型，檢測(cè)細(xì)胞存活率、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放量，以及Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白的表達(dá)水平，以探討4-HBd對(duì)CIRI的保護(hù)作用機(jī)制是否與抗神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

1 材料

Fig 1 Chemical structure of 4-hydroxybenzaldehyde

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量250～300 g，SPF級(jí)，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2008-24，合格證號(hào)：0002777。

1.2試劑Na2S2O4(汕頭市西隴化工有限公司，批號(hào)：110902)；SOD試劑盒(批號(hào)：20131204) 、MDA試劑盒(批號(hào)：20131126)、NO試劑盒(批號(hào)：20131119)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Bax抗體 (貨號(hào)：50599-2-lg)、caspase-3 抗體(貨號(hào)：19677-1-AP)，均購(gòu)自Proteintech；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG(H+L) (Beyotime公司，批號(hào)：AO192)；β-actin抗體(北京博奧森生物科技有限公司，批號(hào)：bs-0061R)；細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20130307)；SABC(兔IgG)-POD Kit(Solarbio公司，批號(hào)：SA0021)；神經(jīng)元特異性烯醇酶(2-phospho-D-glycerate hydrolase，NSE)，購(gòu)自武漢博士德公司，批號(hào)：BA0535。

1.3儀器酶標(biāo)儀(Infinite M200 PRO)，瑞士Tecan；生物安全柜(BSC-1300ⅡA2)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(3111)，美國(guó)Thermo Scientific公司；超純水系統(tǒng)(ZMQS 50F01)，美國(guó)Millipore公司；真空安全吸液系統(tǒng)(VACUSAFE)，瑞士Integra-biosciences公司。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、4-HBd高劑量組(20 mg·kg-1)、4-HBd低劑量組(10 mg·kg-1)。高、低劑量組在復(fù)制模型前用4-HBd預(yù)處理5 d；假手術(shù)組與模型組給予同體積溶媒。

采用線栓法復(fù)制大鼠(MCAO/R)模型[7-9]：大鼠10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，翻正反射消失后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，手術(shù)過(guò)程中用智能恒溫控制儀維持大鼠肛溫37℃，頸部剃毛并進(jìn)行常規(guī)消毒，在頸正中偏左0.5 cm處縱切口長(zhǎng)約1.5 cm，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，栓線經(jīng)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈插入大腦中動(dòng)脈，微遇阻力時(shí)停止，栓線插入深度約為18～20 mm，記錄大鼠腦缺血開(kāi)始時(shí)間，缺血2 h后，將栓線緩慢拔出以恢復(fù)缺血區(qū)供血造成再灌注，在缺血及再灌注期間保持室溫在(25～30)℃。

各組大鼠缺血2 h，再灌注24 h時(shí)，檢測(cè)神經(jīng)病學(xué)評(píng)分[10-11]：無(wú)明顯神經(jīng)功能障礙者為0分；提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪、有運(yùn)動(dòng)障礙者為1分；行動(dòng)不協(xié)調(diào)，行走時(shí)向左側(cè)傾斜、劃圈為2分；行走困難，并向左側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)水平下降為4分。納入標(biāo)準(zhǔn)：考慮實(shí)驗(yàn)為預(yù)防性給藥，故將中途死亡的動(dòng)物排除，其余動(dòng)物全部納入實(shí)驗(yàn)。

各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，斷頭取腦并沿腦橋上界面切斷，去除嗅球后稱全腦重，放入-20℃冰箱5 min后取出。由前向后連續(xù)做冠狀切片5片，再將腦切片置入0.2% TTC溶液中，放入恒溫振蕩器37℃避光染色10 min。取出腦切片放入4%中性多聚甲醛中固定24 h后用數(shù)碼相機(jī)拍攝腦片，梗死面積用Image J顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)算。

2.2原代皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定取妊娠19 d大鼠的胚胎，放入含75%乙醇的燒杯中浸泡3 min，再將胎鼠放入裝有預(yù)冷D-Hank’s的培養(yǎng)皿中解剖，分離胎鼠腦皮層并用剪刀剪碎，用0.125%胰酶消化，過(guò)濾，離心，計(jì)數(shù)，加入神經(jīng)元培養(yǎng)基，調(diào)整濃度，接種于提前包被好的培養(yǎng)板中，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

NSE染色方法：取出培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細(xì)胞，吸出培養(yǎng)基， PBS洗2遍，用4%的多聚甲醛室溫固定1 h；PBS漂洗，滴加 0.1% TitonX-100室溫孵育20 min，使細(xì)胞的通透性增加； PBS漂洗，滴加3%的H2O2，室溫孵育20 min，PBS漂洗，滴加5% BSA封閉液，室溫條件下孵育30 min，吸去多余液體；滴加一抗NSE，用稀釋液按1 ∶100 稀釋，37℃孵育1 h；PBS漂洗，滴加二抗(Bio-羊抗兔IgG，1 ∶100 稀釋)，室溫條件下孵育30 min；PBS漂洗，滴加SABC(兔IgG)-POD Kit (1 ∶100稀釋)，37℃避光孵育30 min，PBS漂洗，滴加顯色液，蒸餾水漂洗終止顯色，蘇木精輕度復(fù)染1～3 min，蒸餾水洗，染核成藍(lán)色，顯微鏡下觀察 NSE 表達(dá)：取上、 下、 中、左、右5個(gè)視野，計(jì)算NSE表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。

微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein-2，MAP-2)染色方法：取出培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細(xì)胞，吸走培養(yǎng)基，PBS漂洗，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞1 h，PBS洗后，每孔加入200 μL 0.5% TritonX-100，室溫通透30 min，PBS漂洗，10%山羊血清室溫封閉1 h，除陰性對(duì)照外，每孔加入MAP-2多克隆抗體稀釋液，室溫孵育1 h后4℃冰箱過(guò)夜，PBS漂洗。避光環(huán)境下，加FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體稀釋液，室溫孵育3 h，PBS洗3次，每次5 min。加入DAPI 稀釋液，室溫靜置10 min，PBS漂洗，將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，拍照。

將皮層神經(jīng)細(xì)胞按3×102·L-1的密度接種于96孔板，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度，分為6組復(fù)制模型，Na2S2O4的濃度依次為40、20、10、5、2.5、0 mmol·L-1，用 Na2S2O4無(wú)糖Earle’s液繼續(xù)培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2、95%空氣及飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中缺糖缺氧損傷2 h后，替換為神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度(OD)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

2.3細(xì)胞MDA含量、SOD的活性及NO釋放量檢測(cè)原代皮層神經(jīng)元按1×103·L-1接種于明膠包被的6孔板中培養(yǎng)7 d，分為正常組、模型組、給藥組(0.82、4.09、8.18、25.6 mol·L-1)，正常組和模型組每孔加入等量的神經(jīng)培養(yǎng)液，給藥組設(shè)3個(gè)平行孔，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后復(fù)制OGD/Rep損傷模型。造模結(jié)束后收集培養(yǎng)液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)以硝酸還原酶法檢測(cè)計(jì)算NO釋放量；每孔加1 mL雙蒸水，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，觀察有無(wú)完整細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)MDA及SOD的含量。

2.4Westernblot檢測(cè)Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)造模結(jié)束后，棄上清液，加入100 μL細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞，冰浴裂解5 min，收集細(xì)胞裂解液，4℃ 14 000 r·min-1離心5 min，取上清液，BSA方法測(cè)定蛋白濃度。于沸水中煮5～10 min 使蛋白變性后，以含30～60 μg蛋白的溶液體積為上樣量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，將膜用含5%脫脂牛奶的TBST封閉液封閉1 h后，一抗Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、caspase-3(1 ∶1 000)室溫孵育2 h，二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG(H+L) (1 ∶2000)及驢抗山羊IgG(H+L) (1 ∶2000)室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯色后，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像記錄，利用Image J進(jìn)行圖像灰度值處理。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊者用one-factor ANOVA分析，組間比較用LSD檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)符合正態(tài)，方差不齊者用Tamhane’ T2檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.14-HBd對(duì)MCAO/R模型大鼠神經(jīng)病學(xué)評(píng)分的影響如Fig 2所示，與模型組比較，天麻成分4-HBd 20 mg·kg-1劑量組可明顯降低模型大鼠的神經(jīng)病學(xué)評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；天麻成分4-HBd(20、10 mg·kg-1)劑量組均能明顯降低模型大鼠的腦梗死體積，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.2原代皮層神經(jīng)元形態(tài)觀察及鑒定于倒置顯微鏡下觀察原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)d 2 (Fig 3A)、d 3 (Fig 3B)、d 5 (Fig 3C)、d 7 (Fig 3D)形態(tài)，并通過(guò)NSE鑒定。培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)、軸突和樹(shù)突呈棕黃色(Fig 3E)，表明該細(xì)胞為神經(jīng)元，經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)神經(jīng)元的純度能夠達(dá)到90%以上(Fig 3F)；通過(guò)MAP-2鑒定，F(xiàn)ITC和DAPI免疫熒光染色，在一定波長(zhǎng)的熒光下胞質(zhì)會(huì)發(fā)綠色熒光(Fig 3G)，DAPI染色的所有細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光(Fig 3I)，合并圖見(jiàn)Fig 3H，用圖像分析軟件分析，其純度達(dá)90%以上，可用于實(shí)驗(yàn)研究。

3.34-HBd對(duì)OGD/Rep損傷后原代皮層神經(jīng)元存活率、SOD活性、MDA含量、NO釋放量的影響與模型組比較，天麻成分4-HBd(0.41、0.82、1.64、3.28、6.56、13.1 mol·L-1)組可提高OGD/Rep損傷的原代皮層神經(jīng)元的存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)Fig 4A；與模型組(OGD/Rep)比較，4-HBd(1.64、3.28、6.56、13.1 mol·L-1)組均能減少M(fèi)DA的含量，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)Fig 4B；4-HBd各組均能提高SOD活性，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)Fig 4C；4-HBd各組均能減少NO的釋放，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)Fig 4D。

3.44-HBd對(duì)OGD/Rep損傷原代皮層神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)水平的影響與模型組(OGD/Rep)比較，天麻成分4-HBd(1.64、6.56 mol·L-1)組下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 5A；4-HBd(1.64、3.28 mol·L-1)組上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 5B；4-HBd(1.64、3.28、6.56 mol·L-1)組Bcl-2/Bax蛋白的比例上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)Fig 5C。

3.54-HBd對(duì)OGD/Rep損傷原代皮層神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)的影響如Fig 6所示，與模型組(OGD/Rep)比較，天麻成分4-HBd(1.64、6.56、13.1 mol·L-1)組下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

4 討論

Fig 2 Effects of 4-hydroxybenzaldehyde on neurological score and infarct volume in brain tissues of MCAO/R rats(±s, n=6)

Effects of 4-hydroxybenzaldehyde treatment on neurological score(A), neurological changes (B), cerebral infarction rate(C) and infarct size(D) in MCAO/R rats .*P<0.05，**P<0.01vsMCAO/R group

Fig3Morphologyobservationandidentificationofratprimarycorticalneurons

Primary cortical neuron morphology, rats cultured for 2 d (A), 3 d(B), 5 d (C), 7d (D); primary cortical neurons morphology, rats stained with NSE for negative control (E), normal control(F); analysis of MAP-2 protein expression and DAPI in primary cortical neuron morphology, rat immunofluorescence for MAP-2(G), DAPI(H), Merge(I).

在腦缺血發(fā)生過(guò)程中，溶栓藥物的超時(shí)間窗使用、血栓脫落、血栓自溶以及缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)的建立等都會(huì)造成CIRI。CIRI發(fā)生后，缺血中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生壞死，而缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞則以凋亡為主要死亡方式[12]，若藥物能夠阻止缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，將對(duì)CIRI的修復(fù)產(chǎn)生積極的意義。

神經(jīng)病學(xué)評(píng)分通過(guò)模型大鼠體征異常變化判斷神經(jīng)功能缺損的程度，TTC染色能夠直觀地顯示模型大鼠腦梗死的區(qū)域，并可通過(guò)測(cè)定腦梗死體積的大小，反映腦損傷程度。天麻成分4-HBd能降低MCAO/R模型大鼠的神經(jīng)病學(xué)評(píng)分和腦組織梗死體積，提示其對(duì)CIRI有保護(hù)作用。

Fig 4 Effects of 4-hydroxybenzaldehyde on primary cortex neuron rate(A) and MDA(B), SOD(C), NO(D) to

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsOGD/Rep group

Fig 5 Effects of 4-hydroxybenzaldehyde on cortical neurons Bax(A), Bcl-2 (B) protein and Bcl-2/Bax (C)(±s, n=6)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsOGD/Rep group

Fig 6 Effect of 4-hydroxybenzaldehyde on cortical neurons caspase-3 protein(±s, n=6)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsOGD/Rep group

NSE表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)和突起，在突起及胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒狀沉積物，在非神經(jīng)細(xì)胞均沒(méi)有表達(dá)。MAP-2表達(dá)于樹(shù)突軸心，是神經(jīng)元特異性的細(xì)胞骨架蛋白，可作為神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)采用MAP-2和NSE免疫熒光法鑒定神經(jīng)元，經(jīng)鑒定神經(jīng)細(xì)胞的純度達(dá)到90%以上，可滿足實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞的需求。

腦組織缺血缺氧時(shí)，SOD活性下調(diào)，再灌注時(shí)可產(chǎn)生大量氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，并使缺血期因氧耗竭而停止的烷自由基向脂質(zhì)過(guò)氧化自由基的轉(zhuǎn)化得以延續(xù)，從而產(chǎn)生一些脂類過(guò)氧化中間產(chǎn)物，如MDA含量增加。此外，大量增加的ROS超出了SOD等酶的防御清除能力，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)一步破壞線粒體膜的完整性，細(xì)胞功能遭破壞，引發(fā)腦損傷。同時(shí)，在腦缺血/再灌注損傷情況下，神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS，nNOS)介導(dǎo)早期神經(jīng)元損傷，nNOS被催化產(chǎn)生NO，NO在高濃度時(shí)可抑制線粒體電荷傳遞系統(tǒng)的酶，從而抑制細(xì)胞呼吸和能量代謝，NO還可與自由基反應(yīng)形成一系列高反應(yīng)性的有毒基團(tuán)，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用、酶滅活以及DNA硝化作用，導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[13]。研究結(jié)果顯示，4-HBd能明顯提高OGD/Rep損傷模型細(xì)胞的存活率、SOD的活性，減少模型細(xì)胞MDA的含量、NO的釋放量，提示其有保護(hù)OGD/Rep損傷神經(jīng)細(xì)胞的作用。

CIRI損傷過(guò)程中，缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞以凋亡為主要死亡方式，主要由線粒體凋亡通路介導(dǎo)。在線粒體凋亡通路中Bax與Bcl-2是重要的一對(duì)互相拮抗的凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2/Bax的比值決定凋亡啟動(dòng)與否，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡下游的caspase-3、caspase-6等細(xì)胞凋亡。Caspase家族是一類凋亡調(diào)控蛋白，caspase-3是凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶，是caspase級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的執(zhí)行者。Caspase-3通常于正常細(xì)胞中以酶原形式存在，凋亡因素誘導(dǎo)其活化后細(xì)胞骨架蛋白及DNA修復(fù)酶等，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化后最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，4-HBd能下調(diào)OGD/Rep損傷模型細(xì)胞Bax蛋白、上調(diào)模型細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)、上調(diào)Bcl-2/Bax的比例，并最終下調(diào)模型細(xì)胞caspase-3蛋白的表達(dá)，提示其有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，天麻成分4-HBd對(duì)MCAO/R模型大鼠的CIRI有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與提高神經(jīng)細(xì)胞SOD的活性、減少M(fèi)DA的含量、降低NO的釋放、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，進(jìn)而對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

(致謝：本研究所有實(shí)驗(yàn)均在云南中醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室進(jìn)行，感謝教研室老師們的傾力協(xié)助！)

[1] 楊志宏, 胡 亞, 孫曉波. JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及中藥干預(yù)在缺血性腦卒中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(7):889-94.

[1] Yang Z H, Hu Y, Sun X B. A review on JAK/STAT signaling pathway in cell apoptosis of ischemic stroke and intervention of TCM medicine[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(7): 889-94.

[2] Duan X, Wang W, Liu X, et al. Neuroprotective effect of ethyl acetate extract from gastrodia elata against transient focal cerebral ischemia in rats induced by middle cerebral artery occlusion[J].JTraditChinMed, 2015,35(6): 671-8.

[3] 段小花, 李資磊, 楊大松, 等. 昭通產(chǎn)天麻化學(xué)成分研究[J]. 中藥材, 2013,36(10): 1608-11.

[3] Duan X H, Li Z L, Yang D S, et al. Study on the chemical constituents of Gastrodia elata[J].JChinMedMater, 2013,36(10): 1608-11.

[4] 劉珊珊, 向 彬, 郭營(yíng)營(yíng), 等. 天麻成分對(duì)羥基苯甲醛抗炎作用及機(jī)制研究[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2016,25(9): 16-9.

[4] Liu S S, Xiang B, Guo Y Y, et al. Study of anti-inflammation of p-hydroxybenzaldehyde from Gastrodia elata Blume[J].ChinJEthnomedEthnopharm, 2016,25(9): 16-9.

[5] 李秀芳, 代 蓉, 李國(guó)花, 等. 天麻成分對(duì)羥基苯甲醛抗血小板聚集作用及急性毒性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2013,25(3): 317-20.

[5] Li X F, Dai R, Li G H, et al. Anti-platelet aggregation function and acute toxicity of 4-hydroxybenzylaldehyde ( 4-HBAL) extracted from Gastrodia elata Blume[J]．NatProdResDev, 2013,25(3) : 317-20.

[6] Dai R, Wang T, Si X, et al. Vasodilatory effects and underlying mechanisms of the ethyl acetate extracts from Gastrodia elata[J].CanJPhysiolPharmacol, 2017,95(5):564-71.

[7] Longa E Z, Weinstein P R, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989,20(1): 84-91.

[8] 何芳雁, 韓春妮, 李 艷, 等. 制作線栓法大鼠腦缺血再灌注模型的要點(diǎn)及體會(huì)[J] .實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué), 2013,30(4): 46-8.

[8] He F Y, Han C N, Li Y, et al. Research and experience on making rat model of middle cerebral artery occlusion/reperfusion by the thread occlusion method[J].LabAnimSci, 2013,30(4): 46-8.

[9] 賴文芳, 張小琴, 洪海棉, 等. 紅景天苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2015,31(6): 775-80.

[9] Lai W F, Zhang X Q, Hong H M, et al. Experimental studies on the effects of salidroside in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(6): 775-80.

[10] Bederson J B, Pitts L H, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3): 472-6.

[11] Choi B I, Park D, Lee S H, et al. Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models[J].EnvironToxicolPharmacol, 2012,33(1):60-9.

[12] Matsumori Y, Hong S M, Fan Y, et al. Enriched environment and spatial learning enhance hippocampal neurogenesis and salvages ischemic penumbra after focal cerebral ischemia[J].NeurobiolDis, 2006,22(1): 187-98.

[13] Tahir A, Ashfaq M, Aqeel A K, et al. Imbalance of serum trace elements in acute leukemia contributes to pro and anti-oxidative stress via ROS and SOD regulation: a population based study[J].TraceElementsElectrolytes, 2014,32(1): 22-7.

[14] Lari P, Abnous K, Imenshahidi M, et al. Evaluation of diazinon-induced hepatotoxicity and protective effects of crocin[J].ToxicolIndHealth, 2015,31(4):367-76.