姜 爽，王曉波，張治然，孫 嵐，李勁草，張英鴿

(1. 解放軍第210醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連 116021；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所納米藥理毒理室，北京 100850)

在我國，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)占全部淋巴瘤病例的90%左右，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤第 5 位。其中，B細(xì)胞來源的淋巴瘤占NHL發(fā)病率的85%[1]。NHL患者常常需要接受大劑量的化療和免疫治療[2]，盡管標(biāo)準(zhǔn)化療和近些年出現(xiàn)的新藥已經(jīng)提高了NHL治療的有效率[3-4]，但該病復(fù)發(fā)率也高，且復(fù)發(fā)后再次治療的緩解率低。探索和發(fā)現(xiàn)治療惡性淋巴瘤新的策略，已成為目前亟待解決的問題。

在我國第一部藥物學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》上就有記載的我國傳統(tǒng)中藥雄黃是中醫(yī)內(nèi)治外用常用藥之一，其主要成分為二硫化二砷(As2S2)或四硫化四砷(As4S4)。近現(xiàn)代研究表明，雄黃有鎮(zhèn)痛、消炎、提高免疫力等功效，并且對多種血液系統(tǒng)腫瘤，尤其是白血病有較明顯的治療效果。我們課題組業(yè)已證明，雄黃納米化可提高生物利用度、減毒增效[5-6]。不同粒徑的雄黃誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及毒副作用具有尺寸效應(yīng)，即納米顆粒越小，作用效果越強[7-9]，并在一定的粒徑范圍具有某種程度的肝、脾和腫瘤組織靶向性。我院研究人員在納米雄黃制備及抗腫瘤的作用機制上也進行了較深入的研究[10-11]。有關(guān)三氧化二砷(As2O3)對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的臨床療效研究尚可見，但關(guān)于雄黃(主要成分為As2S2)對B細(xì)胞來源的NHL研究較少。由于廣義上的淋巴瘤是包括白血病的，因此，本研究是在前期納米雄黃抗白血病研究的基礎(chǔ)上，深入研究納米雄黃對B細(xì)胞淋巴瘤的作用，旨在探討納米雄黃對B細(xì)胞來源NHL作用的敏感性，對B細(xì)胞來源的NHL細(xì)胞株增殖和凋亡的影響, 為進一步完善B細(xì)胞淋巴瘤的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1細(xì)胞株人Burkitt淋巴瘤 Raji細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2試劑雄黃(As2S2，純度為98%)購自湖北中藥研究所，檢測到雄黃的Zeta電位為(-20.6 ±1.50)mV。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基，均購自Gibco公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Hoechst 33258細(xì)胞核染液，均購自碧云天試劑有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、4%多聚甲醛等，購自北京賽馳生物科技有限公司。

1.3儀器H-7650透射電鏡，日本日立公司；Zetasize 3000 HS激光粒度和Zeta電位分析儀，英國馬爾文公司；SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀，美國MD公司；Nanowizard 原子力顯微鏡，德國JPK公司；FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

2 方法

2.1納米雄黃和水飛雄黃的制備按照文獻[7]的方法，制備水飛雄黃和納米雄黃。

2.2納米雄黃和水飛雄黃的表征分別取上述制備的納米雄黃和水飛雄黃各1 mg，溶解在5 mL乙二醇溶液中，室溫超聲30 min后，迅速用激光粒度儀分別檢測納米雄黃和水飛雄黃的粒徑、聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index，PDI)；雄黃電勢的測定溶劑為純水。

透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)和原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)評價納米雄黃和水飛雄黃的形態(tài)特征。分別取上述制備的納米雄黃和水飛雄黃各1 mg，溶解在10 mL無水乙醇溶液中，超聲分散后，分別吸取10～30 μL滴在銅網(wǎng)和新鮮剝離的云母片上，在空氣中自然晾干后，在TEM、AFM下觀察形態(tài)。

2.3Raji細(xì)胞體外培養(yǎng)[12]Raji細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)中，置于37℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng), 每2 d傳代1次，并取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

2.4AFM觀察懸浮生長淋巴瘤細(xì)胞

2.4.1AFM掃描細(xì)胞樣品的制備 ①制作多聚賴氨酸包被的蓋玻片：稱取12 mg的L-多聚賴氨酸，加6 mL滅菌的PBS，制備成2 g·L-1的多聚賴氨酸儲液。在實驗前，取1 mL L-多聚賴氨酸和1 mL PBS混合，放到培養(yǎng)皿中，加入用75%乙醇清洗過的蓋玻片，室溫浸泡2 h后，用三蒸水輕柔沖洗多余的L-多聚賴氨酸5次，將黏附處理過的蓋玻片在酒精燈旁烤干，備用。②制作懸浮細(xì)胞AFM樣品：1.5 mL的離心管收集6孔板(依次為對照組、加藥各劑量組)中各孔培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，800 r·min-1，離心3 min, 再用1 mL PBS洗滌1次細(xì)胞，離心棄PBS，再加1 mL PBS，制成細(xì)胞懸液，滴100 μL細(xì)胞懸液于上述制備好的L-Lys包被的蓋玻片上，靜置2 min, 用濾紙條吸走多余的PBS，加入100 μL 4%多聚甲醛固定液，固定15 mim, 用PBS沖洗5遍，三蒸水輕柔沖洗3遍，自然晾干。

2.4.2AFM 測定參數(shù) 掃描采用RTESP 硅的AFM針尖，掃描模式為輕敲模式，掃描頻率為1 Hz，環(huán)境溫度為25℃，濕度小于30%，圖像處理采用AFM的脫機處理軟件。

2.5光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察分別將納米雄黃和水飛雄黃配制成100 mg·L-1的PBS混懸液。將正常培養(yǎng)的Raji細(xì)胞傳代至6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為2.5×107·L-1，每孔接種細(xì)胞1.8 mL,在6孔板中培養(yǎng)24 h后，在給藥孔中加入200 μL濃度為100 mg·L-1的納米雄黃或水飛雄黃混懸液，使納米雄黃或水飛雄黃對細(xì)胞的作用濃度為10 mg·L-1。分別在作用24、48、72 h后，對給藥組和對照組進行顯微鏡拍照，觀察細(xì)胞的聚集生長狀態(tài)。

2.6MTT法檢測Raji細(xì)胞增殖活力按MTT試劑盒的說明書操作，將生長活力良好的Raji細(xì)胞以每孔8 000個的密度鋪在96孔板中，每孔細(xì)胞溶液為90 μL，待細(xì)胞生長12 h進入增殖期后，分別將配制好的梯度納米雄黃或水飛雄黃混懸液依次加入各孔中，每個濃度的雄黃溶液均加入到6個復(fù)孔，每孔10 μL，其它步驟按說明書操作。將各組細(xì)胞培養(yǎng)44 h后，每孔加20 μL MTT，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,再每孔加入100 μL裂解液，在570 nm處測量各孔的吸光值。取6孔的平均值，按下列公式計算細(xì)胞生長存活率，實驗重復(fù)3次。

2.7AFM觀察Raji細(xì)胞的細(xì)胞膜表面細(xì)胞樣品的制備和AFM的掃描參數(shù)與“2.4”相同。雄黃樣品的配制與細(xì)胞給藥方法與“2.5”相同，只是在共培養(yǎng)24 h時，將對照組細(xì)胞和給藥組細(xì)胞用PBS洗滌，離心后收集，用多聚甲醛固定后，制成AFM細(xì)胞樣品觀察。

2.8TEM觀察Raji細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)將“2.5”中培養(yǎng)24 h的Raji細(xì)胞用PBS離心漂洗后，棄PBS，將沉積到離心管底部的細(xì)胞用2.5%戊二醛固定，制成電鏡樣品，于透射電鏡下觀察[13]。

2.9熒光顯微鏡觀察Raji細(xì)胞的細(xì)胞核凋亡分別將處于對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞吹成細(xì)胞懸液，依次接種1.8 mL Raji細(xì)胞懸液至6孔板中，使6孔板中各孔的細(xì)胞初始密度為每孔2.5×106個細(xì)胞。將載有細(xì)胞的6孔板在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，將各孔細(xì)胞用含有納米雄黃或水飛雄黃的培養(yǎng)基0.2 mL孵育，培養(yǎng)24 h后，離心，PBS洗滌2次，除掉多余的藥物，濃縮細(xì)胞為100 μL，各組細(xì)胞混懸液中加入100 μL Hoechst 33258染液，染色10 min后，再將各組細(xì)胞用PBS洗2次，最后，將高度濃縮的細(xì)胞混懸液滴至載玻片上，甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察[14]。

2.10流式雙染檢測Raji細(xì)胞的凋亡率取對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，加入終濃度均為10 mg·L-1的納米雄黃和水飛雄黃，培養(yǎng)30 h。將上述細(xì)胞懸液離心，棄上清液，按照Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒操作。將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到每毫升2×105～1×106個，在500 μL結(jié)合緩沖液中重新懸浮細(xì)胞，加入Annexin-V染液5 μL, 再加入PI染液5 μL，混勻并離心，于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。

2.11Raji細(xì)胞周期變化的檢測取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔1×106個的濃度接種于6孔板，實驗分正常對照組、水飛雄黃組和納米雄黃組，雄黃的終濃度為10 mg·L-1。作用30 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，70%冷乙醇-20℃冰箱固定過夜。固定后的細(xì)胞離心，棄上清，加入碘化丙啶(PI，終濃度為100 mg· L-1)和 RNase(終濃度為50 mg·L-1)，4℃避光染色30 min后，流式細(xì)胞儀分析，并進行DNA倍體及細(xì)胞周期分析。

3 結(jié)果

3.1納米雄黃的表征如Fig 1透射電鏡結(jié)果所示，水飛雄黃的粒徑在微米級，顆粒之間容易聚集；納米雄黃顆粒是雄黃經(jīng)長時間的低溫球磨后得到的，粒徑已經(jīng)達(dá)到納米級, 且顆粒分散性較好。如Fig 2所示，AFM的結(jié)果與TEM的結(jié)果相一致，F(xiàn)ig 2A、2C分別為水飛雄黃和納米雄黃的高度圖，F(xiàn)ig 2B、2D分別為水飛雄黃和納米雄黃的三維圖。如Fig 3所示，激光粒度儀檢測的結(jié)果為水飛雄黃的粒徑為(1.89±0.2)μm，PDI指數(shù)為(0.302±0.3)；納米雄黃的粒徑為(79±8)nm，PDI指數(shù)為(0.278±0.2)。

3.2納米雄黃和水飛雄黃對Raji細(xì)胞的抑制作用

3.2.1光鏡實驗 如Fig 4所示，培養(yǎng)24 h時，正常對照組Raji細(xì)胞呈通透的球形，表面不光滑，活力高的細(xì)胞聚集成團生長，呈葡萄狀；水飛雄黃組的Raji細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，細(xì)胞數(shù)目略有減少；納米雄黃組的Raji細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞孤立生長，細(xì)胞聚集生長狀態(tài)完全被破壞，但單個細(xì)胞的折光性很好。培養(yǎng)48 h時，正常對照組Raji細(xì)胞，聚集生長的細(xì)胞數(shù)明顯增多，成團塊狀生長，細(xì)胞的增殖活力大；水飛雄黃組的Raji細(xì)胞，細(xì)胞聚集生長的活力明顯被抑制，只有少數(shù)的細(xì)胞聚集成串生長；納米雄黃組的Raji細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量大幅減少，細(xì)胞折光性降低，細(xì)胞只有微弱的聚集生長能力。培養(yǎng)72 h時，正常對照組Raji細(xì)胞的數(shù)量持續(xù)增多，視野內(nèi)均是聚集成大團塊生長的細(xì)胞；水飛雄黃組的Raji細(xì)胞的數(shù)量略有增加，與正常對照組相比，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，只有少數(shù)細(xì)胞聚集生長，細(xì)胞生長受到了抑制。納米雄黃組的Raji細(xì)胞的數(shù)量與相同培養(yǎng)時間的對照組和水飛雄黃組相比，細(xì)胞增殖數(shù)量最少，受到了最強的抑制殺傷作用，可看到一些細(xì)胞體積變小，皺縮，死亡。該結(jié)果證明了與相同劑量的水飛雄黃相比，納米雄黃對Raji細(xì)胞的抑制作用更強，可明顯抑制Raji細(xì)胞的聚集生長。

Fig 1 Characterization of crude realgar particles and realgar nanoparticles with TEM

A: Crude realgar particle; B: Realgar nanoparticles

Fig 2 Characterization of crude realgar particles and realgar nanoparticles with AFM

A: Height image of crude realgar particles; B: 3D image of crude realgar particles; C: Height image of realgar nanoparticles; D: 3D image of realgar nanoparticles

Fig 3 Particle size of crude realgar particles and realgar nanoparticles with laser particle size analyzer

A: Crude realgar particles; B: Realgar nanoparticles

Fig 4 Morphology of Raji cells under light microscopy

3.2.2AFM實驗 如Fig 5所示，正常的Raji細(xì)胞為球形，細(xì)胞膜表面是粗糙的，細(xì)胞表面有孔洞，細(xì)胞膜表面還分泌有黏附物質(zhì)向四周伸展，這是光鏡所觀察不到的，F(xiàn)ig 5A為高度圖，F(xiàn)ig 5B為三維圖，F(xiàn)ig 5C為正常的單個Raji細(xì)胞高度圖，可清楚地看到向四周伸展的黏附物質(zhì)，F(xiàn)ig 5D為單細(xì)胞三維圖，可看到細(xì)胞膜表面有一些突起。相同劑量(10 mg· L-1)的納米雄黃和水飛雄黃作用30 h后，水飛雄黃處理組的Raji細(xì)胞表面的黏附物質(zhì)明顯減少，這也是光鏡下觀察到細(xì)胞增殖受到抑制的原因(Fig 5E為高度圖，F(xiàn)ig 5F為對應(yīng)的三維圖，F(xiàn)ig 5G為單細(xì)胞高度圖，F(xiàn)ig 5H為單細(xì)胞對應(yīng)的三維圖)。納米雄黃處理組的Raji細(xì)胞(Fig 5I為高度圖，F(xiàn)ig 5J為對應(yīng)的三維圖)的體積明顯皺縮，變小，單細(xì)胞圖可見細(xì)胞凋亡(Fig 5K為高度圖，F(xiàn)ig 5L為對應(yīng)的三維圖)。

3.2.3透射電鏡實驗 如Fig 6所示，正常的Raji細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞器均未見異常，而納米雄黃可引起Raji細(xì)胞內(nèi)大量線粒體出現(xiàn)空泡，細(xì)胞核皺縮，而相同劑量的水飛雄黃對Raji細(xì)胞影響不明顯。

3.2.4MTT實驗 如Fig 7所示，納米雄黃和水飛雄黃分別作用于Raji細(xì)胞24、48 h后，Raji細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。24 h時，50 mg· L-1水飛雄黃作用下Raji細(xì)胞的存活率為(0.65±0.03)%，而相同劑量納米雄黃作用下，Raji細(xì)胞的存活率為(0.40±0.02)%；48 h時，50 mg· L-1水飛雄黃作用下，Raji細(xì)胞的存活率為(0.42±0.02)%，而相同劑量納米雄黃作用下，Raji細(xì)胞的存活率僅為0.10%。

3.2.5熒光顯微鏡實驗 Fig 8為濃度均為10 mg· L-1的納米雄黃和水飛雄黃與Raji細(xì)胞共培養(yǎng)30 h后，利用熒光顯微鏡觀察到的Raji細(xì)胞核變化情況。正常Raji細(xì)胞核為圓形，沒有高亮顯示。在與水飛雄黃作用30 h后，Raji細(xì)胞的增殖數(shù)量與正常對照組相當(dāng)，增殖能力未受到抑制，細(xì)胞核的變化不明顯。與正常對照和水飛雄黃組相比，納米雄黃與Raji細(xì)胞作用30 h后，細(xì)胞的數(shù)量明顯降低，增殖的能力受到抑制，單個Raji細(xì)胞核明顯皺縮，體積變小，細(xì)胞核密度分布不均勻，細(xì)胞核中部呈高亮顯示，細(xì)胞核凋亡明顯。

Fig 5 The membrane surface of Raji cells under AFM

A: Height image of control Raji cells; B: 3D images of control Raji cells; C: Height image of a single control Raji cell; D: 3D image of a single control Raji cell; E: Height image of Raji cells treated with crude realgar particles; F: 3D image of Raji cells treated with crude realgar particles; G: Height image of a single Raji cell treated with crude realgar particles; H: 3D image of a single Raji cell treated with crude realgar particles; I: Height image of Raji cells treated with realgar nanoparticles; J: 3D image of Raji cells treated with realgar nanoparticles; K: Height image of a single Raji cell treated with realgar nanoparticles; L: 3D image of a single Raji cell treated with realgar nanoparticles

Fig 6 Ultra-microstructure of Raji cells under TEM A: Control; B: Crude realgar particles; C: Realgar nanoparticles

Fig 7 The cell viability of Raji cells with MTT

3.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 Fig 9為納米雄黃與水飛雄黃分別與Raji細(xì)胞共培養(yǎng)30 h后，用Annex-Ⅴ-FITC、PI雙染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測到的Raji 細(xì)胞的凋亡率。正常的Raji細(xì)胞的早期凋亡率為3.44%，晚期凋亡率為2.46%。水飛雄黃作用30 h后，Raji細(xì)胞的早期凋亡率為5.17%，晚期凋亡率為5.97%，水飛雄黃作用下的Raji細(xì)胞總凋亡率為11.14%；納米雄黃作用30 h后，Raji細(xì)胞的早期凋亡率為4.96%，晚期凋亡率為10.94%，納米雄黃處理組的Raji細(xì)胞總凋亡率為15.9%。與正常對照組相比，納米雄黃和水飛雄黃與Raji細(xì)胞作用30 h時， Raji細(xì)胞早期凋亡變化均不明顯，納米雄黃引起的晚期凋亡率明顯升高。

3.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 如Fig 10所示，10 mg· L-1納米雄黃作用Raji細(xì)胞30 h后，在G1期的細(xì)胞為(88.37±3.89)%，G2期為(1.06±0.33)%，S期為(10.57±0.78)%；而相同劑量的水飛雄黃作用30 h后，G1期的細(xì)胞占(46.27±1.29)%，G2期為(24.89±0.82)%，S期為(28.84±1.05)%；對照組的細(xì)胞周期分布分別為G1期的細(xì)胞(40.12±2.16)%，G2期為(19.67±0.67)%，S期為(40.21±2.34)%。與水飛雄黃相比，納米雄黃使Raji細(xì)胞在G1期的分布比例明顯升高，S期分布比率下降。

4 討論

早在1980年，我院以青黛、雄黃、丹參、太子參組方研制出的“復(fù)方黃黛片”，就以醫(yī)院協(xié)定處方的形式用于臨床各類白血病的治療。上世紀(jì)90年代，我院科研團隊進行了以雄黃、青黛為主要成分的復(fù)方黃黛片Ⅰ、II期及III期的系列研究，并于2009年7月獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局新藥證書，且與As2O3相比，以其可經(jīng)口服的獨特優(yōu)點而廣泛地應(yīng)用于急性早幼細(xì)胞白血病患者[15]。近年來，雄黃在抗腫瘤中的應(yīng)用研究越來越廣泛。除了對白血病細(xì)胞有很強的殺傷作用外，體外實驗也證實雄黃對肝癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等實體腫瘤也存在抑制腫瘤細(xì)胞生長及促進凋亡的作用。我們在前期的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，相同劑量的納米雄黃對淋巴瘤Raji細(xì)胞殺傷作用比對肺癌(A549)、肝癌(HepG2)和宮頸癌(HeLa)等貼壁癌細(xì)胞的作用強。由于廣義的淋巴瘤是包括白血病的，水飛雄黃粒徑大、生物利用度小，因此，我們近年嘗試將復(fù)方黃黛的君藥雄黃進行納米化，以提高其生物利用度，考察其對淋巴瘤的治療作用。因此，本研究以水飛雄黃為對照，直觀地考察了納米雄黃對B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞膜表面及其超微結(jié)構(gòu)的影響。納米雄黃可明顯抑制Raji細(xì)胞的增殖，破壞細(xì)胞膜表面的黏附物質(zhì)，破壞其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在本研究中，我們只對雄黃抗Raji細(xì)胞的凋亡和周期影響做了初步的研究。

Fig 8 The nuclear apoptosis morphology of Raji cells measured with fluorescence microscope A: Control; B: Crude realgar particles; C: Realgar nanoparticles

Fig 9 The apoptosis rates of Raji cell measured with Annex-Ⅴ-FITC, PI double staining

Fig 10 The cell cycle distribution of Raji cells measured with flow cytometry

A: Control; B: Crude realgar particles; C: Realgar nanoparticles; D: Cell cycle distributions of Raji cells.

通過光鏡、AFM、TEM等顯微學(xué)研究，我們發(fā)現(xiàn)納米雄黃殺傷淋巴瘤的作用非常強大，但通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到細(xì)胞凋亡率僅為15.90%，說明雄黃殺傷Raji細(xì)胞的作用機制并不僅僅通過細(xì)胞凋亡的途徑。我們在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，納米雄黃抗白血病K562細(xì)胞的機制是通過細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬實現(xiàn)的[16]。文獻報道，雄黃還可以下調(diào)多藥耐藥ABC家族基因的mRNA水平，降低化療藥物阿霉素(ADM)對耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADM細(xì)胞的IC50，部分逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM細(xì)胞對阿霉素的抗藥性，這就提示我們雄黃很可能是一種多藥耐藥抑制劑，在治療腫瘤方面可發(fā)揮更好的療效。因此，我們對納米雄黃抗淋巴瘤的機制研究要從多條途徑進行研究。關(guān)于納米雄黃抗白血病、淋巴瘤等腫瘤的機制研究，要結(jié)合抗多藥耐藥、抗腫瘤干細(xì)胞的研究進行，目前，該項研究正在進行中。本研究重點是對納米雄黃和水飛雄黃進行比較，對淋巴瘤細(xì)胞殺傷作用的形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)等細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的研究。

臨床中用到的雄黃復(fù)方制劑是粒徑在微米級的雄黃，存在臨床用藥量大、生物利用度低等缺點。采用物理或化學(xué)的方法制備納米雄黃，將雄黃粒徑控制在100～200 nm之間是較理想的粒徑范圍。處于這個粒徑范圍的納米雄黃還具有淋巴趨向性和腫瘤表面吸附性，可以依靠腫瘤部位的生理、病理特點，使納米雄黃能夠有效蓄積在腫瘤部位，發(fā)揮被動靶向腫瘤組織的作用，這一特點在后期體內(nèi)研究和臨床研究中會有所體現(xiàn)。

本研究中的淋巴瘤Raji細(xì)胞是一種懸浮生長的細(xì)胞，在制備AFM樣品時，需要將細(xì)胞先固定在基底上，再進行掃描。本研究中用自制的多聚賴氨酸黏附的玻璃片很好地解決了懸浮細(xì)胞的固定問題，可用于其他懸浮細(xì)胞AFM掃描。

盡管對納米雄黃研究仍停留在實驗階段，離臨床應(yīng)用仍有相當(dāng)距離。但該研究可為B細(xì)胞淋巴瘤的治療提供理論依據(jù)。隨著科技進步和研究的不斷深入，相信不久的將來，納米雄黃將成為高效低毒的臨床常用高品質(zhì)藥物。

(致謝:該研究關(guān)于納米雄黃細(xì)胞學(xué)部分完成于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院張英鴿教授納米藥理毒理實驗室，在此由衷感謝！)

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