曾 梅，鐘 萌，馮 悅，羅見春，張奇嬈，張景勍

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物高校工程研究中心，重慶 400016；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 646099；3. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646099)

阿奇霉素 (azithromycin，AM) 是新一代氮雜內(nèi)酯類抗生素，臨床上主要用于呼吸道、皮膚和軟組織感染。但是其口服治療往往伴有腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等胃腸道不良反應(yīng)[1-2]。因此，制備的陽離子阿奇霉素微類脂體 (azithromycin cationic micron niosomes，ACMNS)是具有脂質(zhì)體相似特征的泡囊結(jié)構(gòu)，用于口服遞送系統(tǒng)后可持續(xù)釋放和改善AM的藥代動力學(xué)過程，提高生物利用度，降低藥物毒副作用，具有很高的潛在應(yīng)用價值[3-4]。

Wagner-Nelson法[5-6]是用于評價一室模型藥物吸收動力學(xué)的經(jīng)典方法。該法簡單，既不要求以靜脈給藥做參比，也不需要對吸收的機制與動力學(xué)模式進行限制。反卷積分法[7](Deconvolution)不需要進行房室模型擬合，直接用數(shù)學(xué)方法以真實的實驗數(shù)據(jù)計算體內(nèi)輸入函數(shù)R。隨著以緩釋、控釋制劑為主的給藥系統(tǒng)的普及，Wagner-Nelson法和反卷積分法的應(yīng)用較為廣泛[8]。本研究同時以Wagner-Nelson法和反卷積分法分別從室模型擬合和數(shù)學(xué)模型的角度，對ACMNS的體內(nèi)外相關(guān)性進行了雙重研究，為ACMNS的體外釋放行為預(yù)測藥物體內(nèi)吸收特征和變化規(guī)律提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1藥品與試劑阿奇霉素(上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司)；阿奇霉素對照品(效價：952 kU·g-1，中國食品藥品檢定研究所)；膽固醇(廣州天馬精細化工廠)；吐溫-80(上海申宇醫(yī)藥化工有限公司)；十八胺(上海南翔試劑有限公司)；甲醇、乙腈、異丙醇為色譜純，其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2儀器安捷倫1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；UV-VIS3150型紫外可見分光光度儀(日本島津公司)；分析電子天秤(瑞士Mettler Toledo公司)；激光粒度儀(英國Malvern公司)；QL-901 型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；TGL-16B型高速臺式離心機(江蘇省金壇市大地自動化儀器廠)；XSP-35-1600X型生物顯微鏡(宜春金浩科技有限公司)；Milli-Q型超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3動物12只健康SD大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量230～250 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物合格證號：SCXK(渝)2013-0001。

2 方法

2.1ACMNS的制備采用薄膜蒸發(fā)-冷凍法制備ACMNS[9]。取適量AM、膽固醇、十八胺和吐溫-80于100 mL圓底燒瓶中，加入適量二氯甲烷溶解，減壓蒸發(fā)至燒瓶內(nèi)壁上形成一層均勻透明薄膜，加入含有5%甘露醇的磷酸緩沖溶液(PBS)和若干玻珠，繼續(xù)水浴，并在常壓下攪拌分散，使薄膜溶脹水合，得到混懸液?；鞈乙褐糜?20℃冰箱中冷凍過夜后，取出，于室溫下完全融化，反復(fù)凍融3次可得ACMNS混懸液，于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2ACMNS的粒徑分布和zeta電位取適量ACMNS，用超純水稀釋一定倍數(shù)后，采用顯微鏡下顯微計數(shù)法測定其粒徑，馬爾文激光粒度儀測定其zeta電位。

2.3ACMNS的體外釋放采用動態(tài)膜透析法[10]測定ACMNS的體外釋放度。精密量取等濃度、等體積的ACMNS和AM溶液，將含藥透析袋置于盛有釋放介質(zhì)為pH 6.8 PBS的溶出瓶中，溶出介質(zhì)體積為500 mL，滿足漏槽條件。溫度為(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96、144、192、240 h時間點取1 mL，立即補加等量同質(zhì)同溫的釋放介質(zhì)。平行操作3份。測定透析袋外液ACMNS和AM的含量，計算累積釋放百分率Y，并繪制釋藥曲線。

2.4ACMNS的體內(nèi)藥代動力學(xué)

2.4.1動物給藥方案及樣品采集 采用交叉設(shè)計單劑量給藥方案，給藥劑量為每只大鼠200 mg·kg-1(以AM計)。將12只♀♂各半的SD大鼠隨機分為2組，每組6只。實驗前禁食12 h，全程不禁水。一組給予AM(ig)，另一組給予ACMNS(ig)，分別于給藥0.5、1、2、4、6、8、12、24、48 h后麻醉大鼠，通過眼底取血采集血樣至肝素浸潤過的離心管中，6 000 r·min-1離心10 min后，取上層血漿，置于-20℃冰箱中保存待測。

2.4.2血漿樣品的處理方法 精密量取血漿樣品300 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)物羅紅霉素(20 mg·L-1)、 80 μL 0.2 mol·L-1的NaOH溶液和2 mL乙醚，渦旋混勻。完畢后，3 000 r·min-1離心10 min，提取乙醚層，于40℃真空干燥后，加200 μL甲醇復(fù)溶，渦旋，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液40 μL作為供試品進樣分析。

2.4.3體內(nèi)分析方法的建立 色譜條件:流動相為乙腈 ∶異丙醇 ∶0.004 mol·L-1的磷酸氫二鈉=60 ∶15 ∶25(V/V/V)，流速1 mL·min-1，檢測波長210 nm，柱溫40℃。色譜柱為大連伊利特C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

標(biāo)準曲線的繪制:5份100 μL的空白血漿中加入不同濃度的AM標(biāo)準溶液，配制成系列濃度的血漿樣品，按血漿樣品處理方法操作后，分別以AM和內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比A對AM濃度C(mg·L-1)進行線性回歸，得到標(biāo)準曲線。

精密度考察:配制AM低、中、高3個質(zhì)量濃度分別為5、15、25 mg·L-1的血漿樣品，各濃度平行配制3份，按血漿樣品的處理方法，1 d內(nèi)連續(xù)進樣檢測5次，連續(xù)5 d，考察其日內(nèi)和日間精密度。

回收率考察:配制AM低、中、高3個質(zhì)量濃度為5、15、25 mg·L-1的血漿樣品，各濃度平行配制3份，按血漿樣品的處理方法，同時直接測定相應(yīng)濃度AM對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，計算絕對回收率和萃取回收率。

2.5Wagner-Nelson法評價體內(nèi)外相關(guān)性將血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS 2.1.1軟件進行擬合，并以AIC、R2的大小判斷ACMNS在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)房室模型。采用Wagner-Nelson法[6,11-12]計算各時間點體內(nèi)藥物吸收百分數(shù)，并與相應(yīng)時間點體外藥物累積釋放百分數(shù)進行線性回歸，考察其體內(nèi)外相關(guān)性，計算公式如下：

(1)

其中，F(xiàn)a為t時藥物吸收百分數(shù)，XA為體內(nèi)吸收的藥物總量，Ct是t時體內(nèi)血藥濃度，k是藥物消除的一級速率常數(shù)。

2.6反卷積分法評價體內(nèi)外相關(guān)性

(2)

公式中AUC為相鄰時間間隔內(nèi)ACMNS藥-時曲線下面積，C(ti)為ACMNS各時間點的血藥濃度，將各點數(shù)據(jù)代入即可求得相鄰時間間隔內(nèi)ACMNS的輸入函數(shù)R[7,11]。以輸入函數(shù)R對相對應(yīng)時間點的體外累積釋放度進行線性回歸，考察ACMNS的體內(nèi)外相關(guān)性。

3 結(jié)果

3.1ACMNS的粒徑分布和zeta電位經(jīng)顯微計數(shù)法測定其粒徑為(5.87±1.17)μm，馬爾文激光粒度儀測定其zeta電位為+(12.5±0.02)mV。

3.2ACMNS的體外釋放ACMNS和AM的釋放曲線如Fig 1所示，二者在相同的釋放介質(zhì)(pH 6.8 PBS)中比較，ACMNS比原料藥AM釋放的慢，在前0.5 h釋放了約24%，前2 h釋放了約38%，8 h釋放了約62%，36 h釋放了約77%，240 h基本釋放完全，ACMNS的釋放行為得以改善，具有明顯的緩釋作用。

3.3ACMNS的體內(nèi)藥代動力學(xué)AM體內(nèi)血漿樣品的標(biāo)準曲線方程為：A=19.26C-52.69，r=0.9991，n=3，AM的濃度在1.0～50.0 mg·L-1范圍內(nèi)和內(nèi)標(biāo)物羅紅霉素的峰面積比有良好的線性關(guān)系。高、中、低3個濃度的溶液中，AM的日內(nèi)精密度RSD分別為4.32%、2.13%、0.94%，日間精密度RSD分別為3.14%、1.56%、1.12%，日內(nèi)和日間精密度均良好，符合生物樣品分析方法學(xué)要求。高、中、低3個濃度的溶液中，AM的絕對回收率分別為97.80%、99.51%、98.43%，萃取回收率分別為82.31%、88.49%、90.24%，回收率較高，說明采用該方法處理AM血漿樣品合適。

Fig 1 The release cure of ACMNS and AM in vitro

ACMNS和AM在大鼠體內(nèi)血藥濃度與時間繪制成的藥-時曲線如Fig 2所示，ACMNS的達峰時間Tmax為4 h。大鼠體內(nèi)的血藥濃度時間數(shù)據(jù)用DAS 2.1.1藥動學(xué)軟件進行處理，得到ACMNS的房室模擬，見Tab 1。根據(jù)R2最大，AIC最小的原則[13]選取ACMNS的最佳藥代動力學(xué)模型為一室模型。

Fig 2 Pharmacokinetic profiles of ACMNS and AM after intragastric administration

3.4Wagner-Nelson法評價體內(nèi)外相關(guān)性由Fig 2可知，單劑量灌胃ACMNS后，4 h后達最大血藥濃度，根據(jù)公式(1)計算0.5、1、2、4 h時ACMNS的體內(nèi)吸收分數(shù)Fa，見Tab 2。以0.5～4 h體外累積釋放百分率為自變量X，體內(nèi)吸收百分數(shù)為因變量Fa，得線性回歸方程Fa=3.0524Y-5.7709，r=0.8976，根據(jù)相關(guān)系數(shù)臨界表r(2，0.05)=0.9500，r小于相關(guān)系數(shù)臨界值，結(jié)果表明ACMNS體外累計釋放百分數(shù)與體內(nèi)吸收百分數(shù)間沒有相關(guān)性。

Tab 1 ACMNS compartment pharmacokinetic model fitting

Tab 2 The Wagner-Nelson parameters about ACMNS

3.5反卷積分法評價體內(nèi)外相關(guān)性根據(jù)公式(2)計算ACMNS反卷積分中的輸入函數(shù)R，得到各時間點為0.5、1、2、4 h時的輸入函數(shù)R值，見Tab 3。以體外累積釋放率X作為自變量，輸入函數(shù)R為因變量,得回歸方程R=2.3413X-58.687，r=0.5217，臨界值r(2, 0. 05)=0.9500,r小于相關(guān)系數(shù)臨界值，結(jié)果表明，ACMNS無體內(nèi)外相關(guān)性。此結(jié)果與Wagner-Nelson法評價體內(nèi)外相關(guān)性的結(jié)果一致。

Tab 3 The deconvolution parameters about ACMNS

4 討論

AM為脂溶性藥物，口服后引起的胃腸道不良反應(yīng)可通過改變其劑型而減輕。因此，將其制備成ACMNS后，類脂體泡囊結(jié)構(gòu)包裹的藥物需通過一定時間的溶解、擴散以及囊材的溶蝕而被體內(nèi)吸收。同時，有效地減緩了藥物的釋放速率，延長了藥物在體內(nèi)有效濃度的時間。

體內(nèi)外相關(guān)性研究的方法較多，最常用的是利用模型參數(shù)k求算出體內(nèi)吸收分數(shù)。以吸收分數(shù)與相同時間點的體外累積釋放率的相關(guān)系數(shù)的大小來判斷體內(nèi)外的相關(guān)性。2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，對于在體內(nèi)吸收呈一室模型的藥物，可根據(jù)Wagner-Nelson法計算其吸收百分數(shù)。本研究通過該法進行ACMNS體內(nèi)外分析，結(jié)果表明ACMNS無體內(nèi)外相關(guān)性。但是室模型擬合法的不足也在于吸收分數(shù)的計算引入了消除速率常數(shù)k。由于緩控釋制劑在體內(nèi)滯留時間較長，藥物從制劑中釋放速度較慢，尾段數(shù)據(jù)?；祀s有吸收相，對尾段數(shù)據(jù)分析易產(chǎn)生較大誤差。反卷積分法不需使用模型而是直接根據(jù)實驗數(shù)據(jù)就可以得到關(guān)于藥物體內(nèi)動態(tài)的情況[14]。但反卷積分法所需數(shù)據(jù)量大，對實驗時間點的設(shè)置也有要求，否則只能根據(jù)原始數(shù)據(jù)通過外推法或者內(nèi)插法計算某些時間點的血藥濃度，因此本文中反卷積分法的相關(guān)性系數(shù)稍低，但與Wagner-Nelson法評價體內(nèi)外相關(guān)性的結(jié)果仍一致。兩種不同類型的方法分別從室模型擬合及數(shù)學(xué)模型的角度雙重驗證了ACMNS的體外釋放與體內(nèi)吸收之間沒有相關(guān)性。

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