段賢春，周 安，彭代銀，鮑金云，夏倫祝

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院；2.第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 合肥 230038)

腦缺血是致殘和致死的主要原因之一，其發(fā)生概率隨年齡的增長而增加[1]。研究表明，腦缺血缺氧后神經(jīng)細(xì)胞的損傷與谷氨酸(glutamate, Glu) 介導(dǎo)的興奮性毒性密切相關(guān)[2-3]。腦缺血缺氧后突觸前膜會(huì)過度釋放谷氨酸，突觸間隙堆積的谷氨酸引起Ca2+大量內(nèi)流，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。α-氨基羥甲基異惡唑丙酸(amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid, AMPA)受體上的谷氨酸受體2(glutamate receptors 2,GluR2)亞基可以阻斷Ca2+內(nèi)流，絕大部分神經(jīng)元突觸表面的AMPA受體上含有GluR2亞基，對Ca2+的通透性很低[4-5]。研究表明，膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(protein that interacts with C kinase Ⅰ, PICK1)的PDZ結(jié)構(gòu)域與GluR2 C末端緊密結(jié)合可以調(diào)節(jié)突觸AMPA受體GluR2亞基的表達(dá)，進(jìn)而影響到AMPA受體對Ca2+通透性[6]。

三七為五加科多年生草本植物三七Panaxnotoginseng(BurK.)F. H. Chen的干燥根，收錄于《本草綱目》，具有活血化瘀、消腫止痛的作用[7]。三七總皂苷通過促進(jìn)腦缺血/再灌注大鼠腦組織血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。除皂苷類成分外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，三七超臨界萃取物(supercritical fluid extract, SFE)主要含有人參炔醇、斯巴醇等脂溶性成分。三七中的脂溶性成分如人參炔醇對損傷的神經(jīng)細(xì)胞也有保護(hù)作用[9]，但其脂溶性部位對損傷的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制尚不明確。故本實(shí)驗(yàn)采用谷氨酸損傷PC12細(xì)胞為體外缺血性腦損傷模型，研究三七SFE是否可以干擾或阻斷PICK1與GluR2亞基的相互作用，為PICK1成為一個(gè)可能的藥靶蛋白提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1藥物與試劑三七超臨界CO2萃取物(實(shí)驗(yàn)室自制)；FSC231抑制劑(純度>96.66%，美國Calbiochem公司，批號2769360)；L-谷氨酸(Sigma公司進(jìn)口分裝)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胰蛋白酶(Gibco進(jìn)口分裝，武漢生命技術(shù)有限公司)；MTT、DMSO(Sigma公司)；LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Hoechst 33342染色試劑盒(上海貝博生物公司)；Fluo-3/AM熒光染料(日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)；PICK1抗體、GluR2抗體和β-actin抗體(Abcam公司)

1.2儀器CO2培養(yǎng)箱(MCO-175型，日本Sanyo公司)；倒置顯微鏡(CK2型，日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(ELX800uv型，美國Bio-Tek公司)；水平離心機(jī)(LD4-8型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；熒光顯微鏡(BX-60型，日本Olympus公司)；激光共聚焦顯微鏡(IX-81型，日本Olympus公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOC XR型，美國Bio-Rad公司)；純水機(jī)(Milli-Q Advantage A10型，美國Millipore公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含1%青霉素-鏈霉素溶液、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37 ℃，隔天換液，3～4 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2模型的建立取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁后，棄除原培養(yǎng)液，再以含不同濃度(5、10、15、20、25、30 mmol·L-1)谷氨酸的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，正常對照組不加谷氨酸，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置5% CO2培養(yǎng)箱、溫度為37 ℃的條件下，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，MTT法檢測PC12細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按公式計(jì)算生長抑制率：抑制率(IR)/%=(1-模型組OD值/正常組OD值)×100 %，根據(jù)IC50確定最佳造模的時(shí)間與濃度。

2.3實(shí)驗(yàn)分組與處理將細(xì)胞分為7組：對照組(不加谷氨酸的正常細(xì)胞組)、模型組(谷氨酸損傷的細(xì)胞組)、三七SFE給藥組(25、50、100 mg·L-1)、PICK1抑制劑組(100 μmol·L-1FSC231)、三七SFE+抑制劑組(100 mg·L-1SFE+100 μmol·L-1FSC231)，藥物預(yù)處理1 h后，加谷氨酸共同孵育24 h，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察PC12細(xì)胞形態(tài)。

2.4MTT法檢測細(xì)胞活力取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。置5% CO2培養(yǎng)箱、溫度為37 ℃的條件下培養(yǎng)過夜后，按實(shí)驗(yàn)要求給予不同方法處理，每組為6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入DMSO 150 μL，置恒溫振蕩器上振蕩10 min后，酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔吸光度值。細(xì)胞存活率/%=處理組OD值/對照組OD值×100%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.5LDH活性檢測將“2.3”項(xiàng)各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,分別收集培養(yǎng)上清液20 μL，按照說明書測定各組細(xì)胞上清LDH的活力。

2.6Hoechst33342染色檢測細(xì)胞損傷“2.3”項(xiàng)各組細(xì)胞用PBS液洗3遍，每孔中加入用PBS配置好的Hoechst 33342染料1 mL，室溫避光20 min，用4%多聚甲醛固定5 min，熒光顯微鏡下觀察。

2.7Fluo-3/AM熒光染色法檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度“2.3”項(xiàng)各組細(xì)胞用PBS液洗3遍，各組加入濃度為5 μmol·L-1的Fluo-3/AM染色液，置5% CO2培養(yǎng)箱、溫度為37 ℃的條件下，避光孵育30 min。為充分除去殘留的Fluo-3/AM染色液，用PBS液洗3次，然后加入PBS液覆蓋細(xì)胞。用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察并拍照。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析處理，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離鈣相對含量。

2.8Westernblot檢測PICK1、GluR2蛋白表達(dá)同“2.3”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分組與處理方法，以細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。運(yùn)用5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST洗滌3次，每次10 min，加入一抗(1 ∶1 000)孵育過夜。次日，PBST洗滌3次，每次10 min，加入標(biāo)記有HRP的二抗稀釋液(1 ∶10 000)孵育2 h，再以PBST洗滌3次，每次10 min。最后用ECL試劑盒顯影，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，蛋白表達(dá)情況運(yùn)用AlphaView SA軟件分析。

3 結(jié)果

3.1谷氨酸的細(xì)胞毒性作用不同濃度(5、10、15、20、25、30 mmol·L-1)谷氨酸分別作用PC12細(xì)胞24、48、72 h后，MTT法檢測細(xì)胞存活率變化情況。Fig 1結(jié)果顯示，濃度在5～30 mmol·L-1范圍內(nèi)，谷氨酸對PC12細(xì)胞的生長具有明顯抑制作用，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。25 mmol·L-1谷氨酸作用24 h對細(xì)胞生長的抑制率接近50%，故選擇該作用時(shí)間和濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模型。

Fig 1 Effects of glutamate on proliferation of PC12 cells(n=6)

Fig 2 Morphological changes of PC12 cells observed by inverted-microscope(×200)

A:Control group;B:25 mmol·L-1Glu group;C:25 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group;D:50 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group;E:100 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group;F:100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group;G:100 mg·L-1SFE+100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group

3.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常PC12細(xì)胞大多呈長梭形、多邊形貼壁生長，有類似神經(jīng)突觸的細(xì)胞突起。25 mmol·L-1谷氨酸作用PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞變圓，突起減少，貼壁不牢，細(xì)胞間隙增大，折光度下降。而三七SFE和FSC231預(yù)處理后能減輕谷氨酸對PC12細(xì)胞的損傷，與模型組比較，細(xì)胞密度明顯增大，細(xì)胞突起增多，貼壁細(xì)胞增多，折光性增強(qiáng)(Fig 2)。

3.3三七SFE增加谷氨酸損傷PC12細(xì)胞的存活率Fig 3的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組(98.75±7.02)%比較，單用三七SFE組、單用PICK1抑制劑組的細(xì)胞存活率(94.63±4.84)%、(95.46±2.30)%差異均沒有顯著性。25 mmol·L-1谷氨酸作用PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的生長受到明顯抑制，與正常組比較，細(xì)胞存活率下降為(50.27±2.87)%(P<0.05)。與模型組相比，三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h后能明顯提高PC12細(xì)胞存活率，分別為(60.76±1.83)%、 (69.13±2.72)%、 (78.39±5.04)%、(85.89±6.83)%、(86.90±6.07)%(P<0.01)。

3.4三七SFE降低谷氨酸損傷PC12細(xì)胞的LDH活性25 mmol·L-1谷氨酸作用PC12細(xì)胞24 h后，與正常組LDH活性(131.23±4.42)U·L-1比較，培養(yǎng)基上清液中的LDH活性(522.85±26.67)U· L-1明顯增加(P<0.05)。三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h后，與模型組相比，上清液中LDH活性分別為(400.84±20.84)、(246.12±22.86)、(201.26±3.33)、(150.94±21.01)、(143.40±6.66)U·L-1，明顯減少(P<0.01)。不同濃度的三七SFE、FSC231、三七SFE+FSC231能夠減輕谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷(Fig 4)。

3.5三七SFE降低谷氨酸損傷PC12細(xì)胞的凋亡率Hoechst 33342染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。Fig5結(jié)果顯示，正常組的細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞較少。谷氨酸損傷后部分細(xì)胞呈濃染的碎塊狀，并發(fā)出高亮度的熒光，與正常組細(xì)胞凋亡率(9.78±0.96)%相比，凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡率為(64.71±7.47)%(P<0.05)。與模型組相比，三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h后，各組細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減少，凋亡細(xì)胞也明顯減少，凋亡率分別為(58.99±3.55)%、(47.76±6.53)%、(38.81±2.05)%、(19.22±3.18)%、(19.78±2.72)%(P<0.01)。不同濃度的三七SFE、FSC231、三七SFE+FSC231均可抑制谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡。

Fig 3 Effects of SFE on viability of glutamate injured PC12 cells measured by MTT assay(±s,n=6)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig 4 Effects of SFE on glutamate injured LDH release in PC12 cells(±s,n=6)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig5EffectsofSFEonglutamate-inducedapoptosisinPC12cells

A:Apoptosis changes of PC12 cells observed by fluorescence microscopy.a:Control group;b:25 mmol·L-1Glu group;c:25 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group;d:50 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; e:100 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; f:100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group; g: 100 mg·L-1SFE+100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group.B:Effects of SFE on glutamate-induced apoptosis in PC12 cells.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig6EffectsofSFEonglutamate-inducedPC12intracellularCa2+concentration

A:Fluorescence intensity changes of Ca2+of PC12 cells observed by laser confocal microscopy. a: Control group;b:25 mmol·L-1Glu group;c:25 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; d:50 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; e:100 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; f:100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group; g: 100 mg·L-1SFE+100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group. B:Effects of SFE on glutamate-induced PC12 intracellular Ca2+concentration.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05，**P<0.01vsmodel group

3.6三七SFE減少谷氨酸損傷PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度25 mmol·L-1谷氨酸作用PC12細(xì)胞24 h后，與正常組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(99.18±20.48)nmol·L-1比較，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(628.02±53.64)nmol·L-1明顯升高(P<0.05)。三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h后，與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(570.85±19.59)、(423.76±30.27)、(363.08±7.18)、(314.86±23.40)、(303.62±10.42)nmol·L-1，明顯降低(P<0.01)。不同濃度的三七SFE、FSC231、三七SFE+FSC231可以減少谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流(Fig 6)。

3.7三七SFE抑制PICK1和增加GluR2蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果表明，谷氨酸作用于PC12細(xì)胞24 h后，與正常組相比，PICK1、GluR2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h后，與模型組相比，PICK1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)(Fig 7)，GluR2蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.01)(Fig 8)，且三七SFE+FSC231組與FSC231抑制劑組PICK1、GluR2兩種蛋白表達(dá)無明顯差異。三七SFE可能通過增加GluR2蛋白表達(dá)、降低PICK1蛋白表達(dá)，抑制谷氨酸損傷PC12細(xì)胞的凋亡。

Fig 7 Effect of SFE on expression levels of PICK1 in PC12 cells

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

4 討論

谷氨酸是腦組織中一類重要的興奮性氨基酸，腦缺血缺氧時(shí)，突觸前膜釋放大量的谷氨酸并堆積導(dǎo)致鈣超載，繼而對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生致命的損傷[10]。AMPA受體上的GluR2亞基可以阻斷Ca2+內(nèi)流，而膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PICK1可以影響GluR2亞基的表達(dá)。病理狀態(tài)下，PICK1蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域與GluR2 C末端緊密結(jié)合，導(dǎo)致膜表面GluR2亞基含量降低，引起缺乏GluR2亞基的AMPA受體增多，后者對Ca2+有很高的通透性，引起Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷[11-12]。三七中皂苷類成分對損傷的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，除皂苷類成分外，三七中的脂溶性成分如人參炔醇，對損傷的神經(jīng)細(xì)胞也有保護(hù)作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，三七SFE主要含有人參炔醇、斯巴醇等脂溶性成分，脂溶性成分極性小，可能比水溶性成分更容易透過血腦屏障，但其脂溶性部位對損傷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制尚不明確。故本實(shí)驗(yàn)以谷氨酸損傷PC12細(xì)胞為缺血性腦損傷研究模型，觀察三七SFE對谷氨酸損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用并初步探討其可能作用機(jī)制。

Fig 8 Effect of SFE on expression levels of GluR2 in PC12 cells

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單用三七SFE和單用PICK1抑制劑對細(xì)胞存活率影響不大，后期檢測指標(biāo)主要以正常對照組做參照。25 mmol·L-1谷氨酸作用于PC12細(xì)胞后,與正常對照組比較，細(xì)胞存活率降低、LDH漏出率升高、細(xì)胞凋亡率升高、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高、PICK1與GluR2蛋白表達(dá)均降低；三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231可以提高細(xì)胞存活率、降低LDH漏出率、減少細(xì)胞凋亡、減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、降低PICK1蛋白表達(dá)、增加GluR2蛋白表達(dá)，并在三七SFE濃度為25～100 mg·L-1時(shí)呈一定的量效關(guān)系。此外，三七SFE+FSC231組與FSC231抑制劑組PICK1、GluR2兩種蛋白表達(dá)差異無顯著性，表明三七SFE很有可能通過抑制PICK1和GluR2間相互作用來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)初步從分子水平探討了三七SFE的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制PICK1、增加GluR2蛋白表達(dá)、減少鈣離子內(nèi)流有關(guān)，但三七SFE對PICK1與GluR2蛋白共表達(dá)是否有影響及萃取物中何種成分發(fā)揮作用有待于進(jìn)一步研究。

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