季宇彬，劉雪松，張妙笛，王 敏，張靜宜，王瑞瑩，孫桂波，孫曉波

(1.哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193)

缺血性心肌病在治療后會發(fā)生缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷，導致受損心肌的梗死面積擴大，受損程度也會加重。這種現(xiàn)象的發(fā)生與多種機制有關，包括鈣超載、氧自由基增多、炎癥反應等。隨著心肌缺血的治療技術的提高，I/R時期的治療已成為缺血性心肌病的治療重點，因此，揭示心肌I/R損傷的發(fā)生機制和研究防治損傷的措施，已經(jīng)成為現(xiàn)代心血管疾病防治中的關鍵課題之一[1]。

鈣-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(calcium-calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKII)是一種分布廣泛的多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化與Ca2+調節(jié)相關的蛋白，影響心肌的興奮收縮偶聯(lián)及細胞鈣穩(wěn)態(tài)。在心肌缺血缺氧等病理條件下，心肌細胞鈣離子循環(huán)出現(xiàn)異常，Ca2+超載進一步導致I/R損傷，CaMKII通過代償性活性改變起到維持Ca2+穩(wěn)態(tài)及心肌保護效應。深入了解楤木皂苷C(aralosdie C，SMC)對I/R原代大鼠心肌細胞收縮功能及鈣瞬變產(chǎn)生的影響具有重要的臨床應用前景[2]。

龍牙楤木[Araliaelata(Miq)Seem]系五加科楤木屬植物，其性味辛、苦，有低毒，具有補氣安神、養(yǎng)心除煩、活血通絡之功效[3]。本課題組從上世紀80年代就開始了對龍牙楤木的系統(tǒng)研究，通過研究發(fā)現(xiàn)了龍牙楤木總皂苷治療冠心病的新用途[4]，目前，以龍牙楤木總皂苷為成分研制的楤木心脈通膠囊已獲得藥物臨床研究批件(批件2003L01111)，現(xiàn)已完成臨床觀察。SMC為龍牙楤木總皂苷中的成分之一，屬于齊墩果酸型五環(huán)三萜，為龍牙楤木主要活性成分之一[5]。本研究采用Langendorff心臟灌流系統(tǒng)分離得到原代大鼠心肌細胞[6]，通過細胞收縮與離子濃度同步測定系統(tǒng)[7]，同步檢測SMC對I/R心肌細胞的收縮/舒張功能和鈣瞬變的影響[8]。通過KN-93抑制CaMKⅡ，進一步驗證SMC發(fā)揮作用的機制。

1 材料

1.1動物20只成年♂ SD大鼠，體質量180～200 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)2012-0001。實驗動物在清潔級動物室飼養(yǎng)，標準室溫(22±2)℃和相對濕度(60±10)%。

1.2藥物與試劑龍牙楤木總皂苷單體C(SMC，中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心)；臺式液(單位：mmol·L-1，NaCl 137、KCl 5.4、MgCl21.2、HEPES 10、glucose 1.0，4℃ pH 7.4)；Buffer A(?；撬峤K濃度 10 mmol ·L-1的無鈣臺式液)；Buffer B( CaCl2終濃度1.2 mmol·L-1的臺式液)；Buffer E( 30 mL Buffer A+30 mg BSA+24 mg膠原酶Ⅱ)；KB 液(單位：mmol·L-1，KOH 80、KCl 40、KH2PO425、MgSO43.0、L-谷氨酸 50、?；撬?20、HEPES 10、EGTA 1.0、D-Glu 10，pH 7.2)；化學缺氧液(單位：mmol·L-1，NaCl 123、NaHCO36.0、NaH2PO40.9、KCl 8.0、MgSO40.5、Na-Lactale 20、CaCl21.8，pH 6.8)；膠原酶Ⅱ、Fura-2/AM(美國 Invitrogen 公司)；牛血清白蛋白、牛磺酸(美國 Sigma Chemical 公司)。

1.3儀器細胞收縮與離子濃度同步測定系統(tǒng)(美國 IonOptix 公司)；恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方法

2.1成年大鼠原代心肌細胞分離采用烏拉坦[9](1 g·kg-1，ip)麻醉大鼠后，打開胸腔并迅速取出心臟(盡量取足夠長的主動脈)，迅速置于冰冷無鈣的臺式液中。去除多余組織，迅速將動脈針套入主動脈并用縫合線扎緊，固定于Langendorff心臟灌流系統(tǒng)(從開胸到開始灌流時間不要超過2 min)，經(jīng)主動脈灌流(38℃)預充高純氧的Buffer B約2 min，以泵出血污。換Buffer A灌流液灌5 min，使心臟的血液完全排出。氧飽和的Buffer E循環(huán)灌流，不斷檢查心臟硬度，灌流約10～15 min后，待心臟變得柔軟，終止消化。用注射器注射15 mL Buffer A沖洗心臟內的消化酶，剪下左心室至KB液中，用鑷子撕碎。用3 mL吸管反復吹打加速細胞分離，100目篩網(wǎng)過濾，吸取細胞濾液至10 mL的EP管中，室溫靜置10 min，使存活的心肌細胞沉降，棄去上清液，再次用KB液重懸細胞室溫靜置10 min，棄去上清。第3次KB液重懸細胞，室溫靜置超過30 min，讓營養(yǎng)充分作用于細胞。然后分3次復鈣，使Buffer B體積比逐漸升高，每次讓細胞自然沉降10 min，棄上清加入下一濃度的鈣溶液中。3次的Buffer B與臺式液的體積比分別為1 ∶2、2 ∶1、3 ∶0，最終得到鈣耐受心肌細胞。復鈣完成后棄去上清液，定容至3 mL備用。終濃度取4～8 μL的Fura-2/AM加入細胞液中，負載15 min，棄上清，用Buffer B洗2次，各5 min。3 mL Buffer B稀釋細胞，取2～3滴加到載物臺靜置2 min。選擇外形呈棒狀并具有清晰邊緣的心室肌細胞用于本次研究。

2.2I/R模型制備及實驗分組將分離純化的心肌細胞分為對照組(Control)、模型組(I/R)、模型加藥組(根據(jù)前期實驗基礎篩選出終濃度為8 μmol·L-1SMC，給藥5 min[10])、抑制劑組(根據(jù)已有文獻報道采用KN-93終濃度1 μmol·L-1，給藥5 min[11])。心肌細胞在0.5 Hz、5 ms 波寬電場刺激下，有節(jié)律收縮穩(wěn)定后，模型組用化學缺氧液灌流20 min模擬缺血，然后換以Buffer B 再灌注 20 min。模型加藥組使用含SMC(終濃度8 μmol·L-1)的Buffer B灌流液預給藥5 min，然后以化學缺氧液進行模擬缺氧，20 min后再灌注Buffer B。抑制劑組灌流含KN-93的Buffer B(終濃度1 μmol·L-1)5 min，再以含SMC的Buffer B(終濃度8 μmol·L-1)預給藥5 min，化學缺氧液灌流20 min，然后Buffer B再灌注20 min，模擬I/R。

2.3心肌細胞收縮及鈣瞬變檢測心肌細胞收縮采用 IonOptix 細胞收縮與離子濃度同步測定系統(tǒng)同步檢測細胞收縮及鈣瞬變。該系統(tǒng)可以自動將波長變化與視頻框架同步記錄，可獲得250對比率/秒的比率，配置中包含HyperSwith光源系統(tǒng)，測Ca2+可以實現(xiàn)340/380快速轉化波長，其比率可達250 Hz，采樣速度達到1 000次/秒，可以實現(xiàn)真正的實時測量。將心肌細胞置于倒置顯微鏡載物臺上的細胞灌流小室內，并給予電場刺激 (0.5 Hz，5 ms)，IonOptix的MyoCam照相系統(tǒng)接收細胞收縮的影像并呈現(xiàn)在監(jiān)視器上。心肌細胞肌小節(jié)收縮幅度及速度等指標由計算機實時采集并記錄。同時，細胞內與游離 Ca2+結合的熒光物質被激發(fā)，并通過雙激發(fā)熒光光電倍增系統(tǒng)檢測熒光信號。選取長桿狀，邊緣折光性好，橫紋清晰，無自發(fā)收縮的心室肌細胞進行實驗，且給藥前細胞收縮幅度恒定至少5 min。

3 結果

3.1SMC及KN-93對正常心肌細胞收縮和鈣瞬變的影響Fig 1、2數(shù)據(jù)表明，單加SMC、單加抑制劑KN-93與正常心肌細胞相比較，靜息態(tài)肌節(jié)長度、收縮幅度、收縮速度、舒張速度差異均無顯著性，說明單加SMC、單加KN-93對細胞收縮功能無較大影響。觀察心肌細胞鈣瞬變相關指標可知，穩(wěn)態(tài)鈣靜息值、鈣瞬變幅度與對照組水平相近，單加SMC后，細胞收縮時[Ca2+]i上升的速率、細胞舒張時[Ca2+]i下降的速率高于正常心肌細胞，單加KN-93細胞收縮時[Ca2+]i上升的速率、細胞舒張時[Ca2+]i下降的速率與正常心肌細胞差異無顯著性。

3.2KN-93對SMC改善I/R誘導心肌細胞收縮功能異常的影響Fig 3、4結果表明，I/R+SMC與I/R組相比，肌節(jié)長度、收縮幅度、收縮/舒張速度均明顯升高，其中收縮幅度和收縮/舒張速度高于對照組，表現(xiàn)正性肌力作用。細胞達到舒張時最大長度90.0 %的時間與細胞收縮達峰值的時間明顯降低，具有恢復至缺氧前水平的趨勢。但加入KN-93抑制CaMKⅡ后，除肌節(jié)長度無明顯變化外，SMC對細胞收縮幅度、速度以及細胞達峰值時間等均比I/R+SMC組降低，說明加入抑制劑后，SMC對細胞收縮功能的作用效果降低。

Fig 1 Effect of aralosdie C and KN-93 on contractile function of normal myocardium

Fig 2 Effect of aralosdie C and KN-93 on Ca2+ transients of normal myocardium

A: Resting calcium ratio; B: Amplitude resting calcium; C: +d[Ca2+]/dtmax; D: -d[Ca2+]/dtmax.#P<0.05vscontrol

3.3KN-93對SMC改善I/R誘導心肌細胞鈣瞬變紊亂的影響再灌注后，SMC恢復細胞收縮功能的同時，心肌細胞鈣瞬變也恢復。主要檢測指標鈣瞬變幅度、細胞收縮時[Ca2+]i上升的速率、細胞舒張時[Ca2+]i下降的速率較模型組明顯增加，另外，穩(wěn)態(tài)鈣靜息值、收縮期[Ca2+]i上升到最高50.0 %的時間、胞內鈣瞬變衰減率均減少。KN-93抑制CaMKⅡ后，除穩(wěn)態(tài)鈣息值無變化外，SMC對鈣瞬變的作用效果也相應降低，表明SMC改善I/R誘導心肌細胞鈣瞬變紊亂作用機制可能與CaMKⅡ有關(Fig 5)。

4 討論

中國心血管病報告顯示，2016年我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)達2.9億，當心肌缺血/再灌注損傷 (myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)發(fā)生時[12]，可導致心絞痛、心肌梗死等多種疾病。血運重建仍然是目前最主要的治療心肌缺血的方法，目前關于MIRI的機制尚不十分明確，治療效果一般，尤其是沒有非常有效針對MIRI的治療藥物，MIRI已成為世界亟待解決的難題。

為了探討SMC是否通過調控CaMK II對大鼠心肌細胞收縮功能和鈣瞬變產(chǎn)生影響，本實驗使用膠原酶分解法分離得到成年大鼠心室肌細胞，使用SMC體外干預，減少了多種體內因素對SMC心肌保護作用的影響[13]。使用細胞收縮與離子濃度同步測定系統(tǒng)實時記錄SMC對心肌細胞收縮與鈣瞬變的影響。該測定系統(tǒng)的特點是在獲得細胞肌節(jié)收縮/舒張功能相關參數(shù)的同時，可以獲得心室肌細胞內鈣瞬變的同步變化，從而便于對細胞肌小節(jié)收縮及鈣瞬變的結果進行綜合分析。根據(jù)前期SMC改善I/R損傷的預實驗，濃度篩選范圍為0.01～20 μmol·L-1，最終選擇了8 μmol·L-1作為最佳劑量；給藥時間嘗試5、10、15、20 min，發(fā)現(xiàn)預給藥5 min為最佳給藥時間[10]。對加入SMC和未加入SMC的I/R成年大鼠心肌細胞收縮功能進行比較，發(fā)現(xiàn)SMC處理可明顯促進I/R成年大鼠心肌細胞收縮功能的恢復，SMC改善心肌細胞收縮的同時，其鈣瞬變也相應改善，并且SMC使鈣瞬變幅度和[Ca2+]i上升/下降的速率明顯升高，但加入KN-93抑制CaMKⅡ后，除穩(wěn)態(tài)鈣息值無變化外，SMC對鈣瞬變的作用效果降低，表明SMC改善I/R損傷可能與CaMKⅡ有關。在I/R原代大鼠心肌細胞中使用特異性抑制劑KN-93阻斷CaMKⅡ信號途徑，導致SMC對細胞收縮功能及鈣瞬變的作用效果降低。

Fig 3 Effect of aralosdie C on cardiomyocyte contractile function during I/R

A: Resting sarcomere length; B: Peak shortening; C: -dL/dtmax; D: +dL/dtmax; E: TR90; F: TPS.#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsI/R;△P<0.05vsI/R+Aralosdie C.

Fig 4 Sarcomere shortening and Ca2+ transient recorded simultaneously from left ventricular myocytes after aralosdie C perfusion during I/R using SoftEdge MyoCam system

Fig 5 Effect of aralosdie C on Ca2+ transient and cell contraction during I/R

A: Resting calcium ratio; B: Amplitude resting calcium; C: +d[Ca2+]/dtmax; D: -d[Ca2+]/dtmax; E: Time to 50% peak [Ca2+]i; F: Intracellular Ca2+transient decay rate.#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsI/R;△P<0.05vsI/R+Aralosdie C.

綜上所述，SMC可明顯改善I/R成年大鼠心肌細胞的收縮功能和鈣瞬變，減輕I/R成年大鼠心肌細胞損傷，為尋找安全有效的防治MIRI的藥物提供了實驗依據(jù)，對防治缺血/再灌注所造成的心肌損害具有重要意義和應用前景。

[1] 李 光, 邢小燕, 張美雙, 等.中藥三七對缺血/再灌注損傷的保護作用及應用前景[J].中國藥理學通報, 2015,31(10): 1340-4.

[1] Li G, Xing X Y, Zhang M S, et al. Panax notoginseng in treatment of myocardial ischemia/reperfusion injury and its application prospect [J].ChinPharmacolBull, 2015,31(10):1340-4.

[2] 常 榮, 格日力.CaMKⅡ在細胞鈣穩(wěn)態(tài)維持及心肌保護中作用的研究進展[J].生理科學進展, 2011,42(1):55-8.

[2] Chang R, Ge R L. Research progress in the role of CaMK II in maintenance of cellular calcium homeostasis and myocardial protection[J].ProgPhysiolSci,2011,42(1):55-8.

[3] 孫桂波, 王 敏, 高蒙蒙, 等.龍牙楤木總皂苷對H2O2誘導乳鼠心肌細胞損傷的保護作用[J].中國藥理學通報, 2013,29(6):773-7.

[3] Sun G B, Wang M, Gao M M, et al. Protective effects of Aralosides (AS) against H2O2-induced injury in neonatal rat cardiomyocytes [J].ChinPharmacolBull, 2013,29(6):773-7.

[4] 孫桂波, 李 銳, 周莉玲, 等.龍牙楤木化學成分與藥理作用的研究進展[J].中藥新藥與臨床藥理, 2003,(2):139-41.

[4] Sun G B, Li R, Zhou L L, et al. Research progress of chemical constituents and pharmacological effects of Aralia elata [J].TraditChinDrugResClinPharmacol, 2003,(2): 139-41.

[5] 張家鑫, 田 瑜, 孫桂波, 等.龍牙楤木皂苷類成分及藥理活性研究進展[J].中草藥, 2013(6): 770-9.

[5] Zhang J X, Tian Y, Sun G B， et al. Research progress in chemcial constituents of saponins from Aralia elataand their pharmacological activities[J].ChinHerbalMed, 2013(6): 770-9.

[6] 謝英花, 馬燕山, 張 楠, 等.硫化氫抑制離體灌流大鼠急性心肌缺血所致心肌細胞凋亡研究[J].中國藥理學通報, 2014,30(11): 1543-7.

[6] Xie Y H, Ma Y S, Zhang N, et al. Inhibitory effect of hydrogen sulfide on cardiomyocyte apoptosis induced by acute myocardial ischemia in rats[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(11):1543-7.

[7] 張海鋒, 張 博, 張曉東, 等.可視化動緣探測系統(tǒng)檢測心肌細胞舒縮功能[J].中國應用生理學雜志, 2004,20(4):99-103.

[7] Zhang H F, Zhang B, Zhang X D, et al. Measurement of systolic/diastolic function in isolated ventricular myocytes by video-based motion Edge-Detection system [J].ChinJApplPhysiol, 2004,20(4):99-103.

[8] 張妙笛, 孫桂波, 徐惠波, 等.龍牙楤木總皂苷對缺血/再灌注心肌細胞收縮功能和鈣瞬變的影響[J].中國中藥雜志, 2015,40(12):2403-7.

[8] Zhang M D, Sun G B, Xu H B, et al.Effect of aralosides to contraction function and calcium transient of ischemia/reperfusion myocardial cells [J].ChinaJChinMaterMed, 2015,40(12):2403-7.

[9] Wang M, Xu X, Xu H, et al. Effect of the total saponins of Aralia elata (Miq) Seem on cardiac contractile function and intracellular calcium cycling regulation[J].JEthnopharmacol, 2014,155(1): 240-7.

[10] Wang M, Tian Y, Du Y, et al. Protective effects of Araloside C against myocardial ischaemia/reperfusion injury: potential involvement of heat shock protein 90[J].JCellMolMed, 2017,21(9):1870-80.

[11] Yan W, Zhang F, Zhang R, et al. Adiponectin regulates SR Ca2+cycling following ischemia/reperfusion via sphingosine 1-phosphate-CaMKII signaling in mice[J].JMolCellCardiol, 2014,74:183-92.

[12] 盧 寧, 韓吉春, 任博雪, 等.二氫槲皮素預處理對心肌缺血/再灌注損傷抗氧化作用的影響[J].中國藥理學通報, 2017,33(4):487-92.

[12] Lu N, Han J C, Ren B X, et al. Antioxidation effect of dihydroquercetin pretreatment in isolatedrat hearts during myocardial ischemia reperfusion injury [J].ChinPharmacolBull,2017,33(4): 487-92.

[13] 石曉路, 柳 絮, 郭會彩, 等.大鼠心肌細胞分離方法的改進[J].中國藥理學通報, 2010,26(5):687-90.

[13] Shi X L, Liu X, Guo H C, et al.An improved method of isolation of rat cardiac myocytes [J].ChinPharmacolBull,2010,26(5):687-90.