韋忠紅，余蘇云，陳文星，王愛云，陸 茵,3＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院 南京 210023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室 南京 210023；3.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210023）

微量中藥成分的起效機制研究不容忽視
——“遺傳協(xié)同致死”模式有助于發(fā)現(xiàn)并闡釋中藥顯效物質基礎及起效機制＊

韋忠紅1,2，余蘇云1,2，陳文星1,2，王愛云1,2，陸 茵1,2,3＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院 南京 210023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室 南京 210023；3.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210023）

中藥作用機制及顯效物質的闡明是制約中藥現(xiàn)代化進程的主要障礙。當前研究的對象大都為中藥的豐度成分，研究思路多歸為正向藥理學模式，這種模式往往忽略對中藥微量成分的研究?！斑z傳協(xié)同致死”是一種基因之間的互作關系，可使得共同調控生物效應呈現(xiàn)級數(shù)放大（大于1 000倍）。鑒于，遺傳協(xié)同研究模式在抗腫瘤藥物研發(fā)中取得喜人成績。（包括PARP抑制劑的發(fā)現(xiàn)，化療藥物增效減毒組合的臨床使用等）。同時，中藥在對抗環(huán)境脅迫所產(chǎn)生的多種次生代謝產(chǎn)物，為契合遺傳協(xié)同靶點提供多成分基礎。那么，是否可以將這一研究模式用于闡明微量活性成分的研究？從“靶點-成分-效應”的逆向思維出發(fā)，在明確遺傳協(xié)同靶點的基礎上，對中藥微量弱效成分起效機制展開研究，并進一步發(fā)現(xiàn)潛力的協(xié)同成分組合。

微量中藥成分 遺傳協(xié)同致死 環(huán)境脅迫 逆向藥理學 顯效物質基礎

中藥現(xiàn)代化的發(fā)展進程中，對藥物作用機制的探討始終備受重視，創(chuàng)新的中藥藥理學研究思維成為中藥現(xiàn)代研究的關鍵任務，也是探索中藥治療策略和中藥作用模式的基礎。當前主流的中藥藥理學研究思維是一種“成分-靶點-效應”的正向藥理學研究思路，包括中藥復方“霰彈靶點理論”、多成分多靶點思想，網(wǎng)絡藥理學等等。以上研究思路有著從分析向綜合、從局部向整體的發(fā)展趨勢，都從不同的側面表述了中藥作用的特點。上述研究的方法和思路圍繞中藥及中藥復方中的豐度成分及常量成分，往往忽略中藥組分中種類眾多的微量成分，而這些微量成分在中藥整合藥效中扮演著不可或缺的重要角色。這些微量的活性成分（如鴉膽子中的苦木內酯[1]，莪術中的β-欖香烯[2]，紅花中的羥基紅花黃色素[3]）在整個中藥材中的含量不高，且多數(shù)有效成分代謝動力學特征不理想，進入特定組織或細胞的有效成分濃度低；此外，與西藥的靶向制劑相比，大多中藥中的有效靶點與受體的親和力較弱[4,5]，中藥的微量弱效的活性成分是如何起效的呢？

施以逆向思維，從生物網(wǎng)絡靶標之間的協(xié)同關系研究中藥微量弱效成分之間的協(xié)同倍增效應，或許可以進一步探索中藥多成分之間，除了存在多成分單靶點的疊加和多成分各個靶點的協(xié)同以外，是否還存在某種更為重要的靶點與靶點之間協(xié)同作用機制，從而使得低親和力、微量中藥多成分組合的效應級數(shù)倍增？

近二十年來，“遺傳協(xié)同致死”模式被成功地應用于抗癌藥物的研發(fā)中，為靶向抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)[6]及聯(lián)合使用[7]提供了高效的研究策略。那么，是否可以從“遺傳協(xié)同致死”的角度來詮釋中藥微量弱效成分起效的機制，完成將中藥活性成分的研究從常量化學成分向微量化學成分的轉變。這或許是中藥發(fā)揮藥效重要起效機制的一種補充，成為中藥藥理學研究新的突破點。

1 遺傳協(xié)同致死——靶與靶之間的協(xié)同效應倍增

遺傳協(xié)同致死（synthetic lethality）是因兩個非致死性基因同時發(fā)生突變或干預（如藥物干擾，RNA干擾等），從而產(chǎn)生致死效應，屬于一種基因層面的相互作用而產(chǎn)生的特定生物現(xiàn)象[8,9]。遺傳協(xié)同致死不是兩個基因之間孤立的相互作用關系，而是這兩個基因所在的基因組背景下，在功能上的互作關系?；檫z傳協(xié)同致死的基因具有某些重要功能上的互補性，當某一個基因功能異常時，另外一個基因會對其進行補償以維持功能正常。當兩基因中任一基因發(fā)生突變或干預，對生物事件影響甚微，但若兩個基因同時發(fā)生突變，或同時進行干預，或在一個基因突變的情況下對另一個基因進行干預，則會使這兩個基因共同影響的生物事件發(fā)生致死效應[10,11]。（如圖1所示）

圖1 基因A與基因B互為遺傳協(xié)同致死關系

1.1 遺傳協(xié)同致死關系互作網(wǎng)絡

遺傳協(xié)同致死在低等模式生物（酵母、果蠅、秀麗隱桿線蟲等）[12-14]上是一種普遍的基因互作方式。模式生物酵母除了10%的關鍵基因（單基因缺失即可致死），其余約80%的基因都是遺傳協(xié)同致死基因，且大多數(shù)基因都和多個基因間存在遺傳協(xié)同致死關系[15,16]。如調控DNA復制的基因和DNA損傷修復基因就存在遺傳協(xié)同致死關系；負責細胞有絲分裂檢查點的基因也和DNA修復基因產(chǎn)生遺傳協(xié)同致死效應[7,17]。

鑒于人和酵母等模式生物在多種基本生物學過程以及功能上的保守性，從而激發(fā)對腫瘤遺傳協(xié)同致死基因發(fā)現(xiàn)的研究[18,19]。2009年Peter C.Fong發(fā)表在New England Journal of Medicine文章提供了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在遺傳學“協(xié)同致死”現(xiàn)象的最早臨床證據(jù)[10]。更加令人興奮的是，Livnat Jerby-Arnon在2014年Cell上闡述了一種基于“遺傳協(xié)同致死”進行抗腫瘤靶點篩選的數(shù)學模型[20]。2017年，Tim Wang等進一步利用基因組CRISPR篩選技術，成功繪制出急性髓系白血病上癌基因Ras的遺傳協(xié)同致死互作基因網(wǎng)絡[21]。這種“共犯關系”的確定揭示了已知的互作基因群體，也發(fā)現(xiàn)了一些基因之間以前不知道的或未被研究過的新聯(lián)系[21,22]。

令人欣喜的是，基于遺傳協(xié)同致死研究模式開展抗腫瘤藥物的研發(fā)策略也獲得了可喜的成果，體現(xiàn)了協(xié)同致死關系在腫瘤治療中的巨大潛力。

1.2 基于特殊遺傳缺陷的遺傳協(xié)同致死基因的抗腫瘤藥物開發(fā)

PARP抑制劑就是第一種成功利用遺傳協(xié)同致死研究模式開發(fā)并獲批臨床使用的抗癌藥物[6,23,24]。已上市的PARP1抑制劑（奧拉帕尼[25]，尼拉帕尼[26,27]等）可特異性治療BRCA突變所致DNA修復缺陷的腫瘤，如乳腺腺癌及卵巢癌等[24,25]。正常情況下，BRCA與PARP共同協(xié)作，保證DNA被完整修復，但是在BRCA發(fā)生突變的腫瘤細胞上只剩下一條途徑修復單鏈斷裂，細胞的存活就更加依賴于PARP1的修復功能。故而，抑制PARP1的功能就可以選擇性地殺傷BRCA突變的腫瘤細胞，而對正常細胞影響甚微。

誠然PARP抑制劑是基于BRCA遺傳協(xié)同致死關系開發(fā)出來的，但是PARP的“協(xié)同致死伴侶”絕不僅僅只有BRCA。2017年美國癌癥研究協(xié)會（AACR）年會上，指出PARP抑制劑處理攜帶IDH基因突變的癌細胞，則可進一步破壞DNA修復機制，從而有效殺傷癌細胞。奧拉帕尼對復發(fā)性膠質母細胞瘤患者療效的臨床試驗中，初步證據(jù)表明，奧拉帕尼可以進入某些膠質母細胞瘤[28]。該項研究在確定PARP與IDH遺傳協(xié)同致死關系的同時，也從DNA修復角度詮釋了IDH突變對膠質母細胞瘤所賦予的新的基因功能。

1.3 利用遺傳協(xié)同致死關系開展化療藥物協(xié)同增效藥物篩選

圖2 受環(huán)境脅迫產(chǎn)生的多成分防御物質是中藥發(fā)揮遺傳協(xié)同致死效應的基礎

除了對具有某一基因突變的腫瘤進行高特異性靶向藥物的開發(fā)以外，遺傳協(xié)同致死模式也用于細胞毒類藥物耐藥協(xié)同增效基因及藥物的發(fā)現(xiàn)。早在2007年，Whitehurst等就已經(jīng)利用RNA干擾文庫對紫杉醇協(xié)同增效基因進行了全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)多個基因的敲除能夠使肺癌細胞系對紫杉醇的敏感性顯著增加，其中一些基因的敲除可以使得紫杉醇的敏感性提高超過1 000倍[29]。另有研究發(fā)現(xiàn)，與PARP抑制劑聯(lián)用能夠使成膠質細胞瘤細胞對化療藥物替莫唑胺的敏感性增加。而蛋白激酶B、BCL/XL、巖藻糖激酶FUK和酰基輔酶A硫酯酶ACOT11等多個基因的敲除能夠使成膠質細胞瘤細胞對長春堿的敏感性增加[30,31]?；谶z傳協(xié)同致死模式對細胞毒類藥物增敏基因的篩選為臨床實施靶向藥物與細胞毒類藥物聯(lián)合應用提供了依據(jù)[32]。如，硼替佐米（蛋白酶體抑制劑）與紫杉醇聯(lián)合使用已應用于臨床中，并取得喜人的成效[33]。

2 中藥的多成分是環(huán)境脅迫的進化產(chǎn)物，為契合遺傳協(xié)同靶點提供物質準備

“若無進化之光，生物學將毫無意義”，新達爾文主義（綜合學說）的創(chuàng)建人杜布藍斯基的這一觀點有助于詮釋中藥的藥效物質基礎的來源。中藥（尤以植物源性中藥）結構種類多樣的成分（群、族）是為了適應環(huán)境脅迫而不斷進化的結果。中藥為了應對微生物、昆蟲等生物脅迫，分泌特殊物質（即功能性小分子物質）構成化學防御，這種外源性化學興奮效應可以使得微生物或昆蟲的脅迫耐受性增加；同時，為了抵御干旱、缺氧、強紫外線、重金屬等非生物脅迫，中藥體內產(chǎn)生大量的結構多樣的次生代謝產(chǎn)物[34,35]。

即使是在面對某一種環(huán)境脅迫時，植物形成的相互影響自我更新的適應性進化產(chǎn)物也并非是單一成分，而是調控此脅迫多環(huán)節(jié)過程的結構多樣性成分。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)有幾百種植物次生代謝產(chǎn)物具有抗真菌、細菌、病毒等作用。例如，Deavours等研究指出，苜蓿葉為了抵御莖點霉（一種真菌病原體），苜蓿葉片中的芒柄花素苷和苜蓿素的含量會同時增加[36,37]；另外，當植物受到昆蟲啃食這一生物脅迫是，組織被破壞，釋放出自身的或感受到植食性昆蟲口腔分泌物中的誘導因子時，能迅速作出反應，合成毒性次生代謝產(chǎn)物，構成直接化學防御或合成揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物吸引植食性昆蟲的天敵形成間接化學防御，以避免遭受過度啃食。如樹胡椒[38]在應對昆蟲脅迫時，一方面產(chǎn)生會異松油烯導致昆蟲拒食，另一方面產(chǎn)生黃樟素直接殺死昆蟲。

雖然人對植物脅迫性進化的貢獻較小，但鑒于物種適應性進化的保守性和趨同性，使得包括人類在內的動物與植物具有很高的生物相似性。除了合成和降解蛋白質、核酸、糖與脂質基本細胞生理過程一致外，一系列相互關聯(lián)的信號通路在植物與動物體內中亦都有及其相似保留[35]。例如，細胞色素CYP450酶系[39]廣泛進化保守性地存在于所有生物體，參與了化合物的生物合成、解毒、代謝等諸多過程之中；人體的AMPK蛋白[40]與植物中的SnRK1[41]為同源物，這一同源的蛋白質激酶都能夠通過感受細胞能量狀態(tài)來維持真核細胞的ATP生成和消耗的平衡，來實現(xiàn)能量代謝的穩(wěn)態(tài)；此外，人體內Nrf-2作為一個核轉錄因子參與基因的ARE調控元件的核心TGACG序列相結合，轉錄調控機體一系列抗氧化應激損傷，抗炎等保護基因的表達[42]。而在植物體內具有與ARE啟動子調控元件序列及功能極其類似的As-1順式作用元件，并具有與Nrf2結合域序列中等程度的相似的TGA轉錄子與之相結合[43]。

藥用植物在應對環(huán)境脅迫所產(chǎn)生的防御物質，除了改善自身適應非生物性脅迫和對抗生物脅迫外，可以與人體產(chǎn)生優(yōu)秀的生物相容性，用于人類疾病的治療（如圖2）。這些防御物質（包括次生代謝產(chǎn)物）多為中藥活性成分，而應對環(huán)境脅迫的中藥活性成分可能就是靶向人體遺傳協(xié)同致死靶點，實現(xiàn)藥效協(xié)同倍增的藥物組合來源。

3 基于遺傳協(xié)同致死模式發(fā)現(xiàn)并闡明中藥微量弱效活性成分起效機制

3.1 從同一環(huán)境脅迫的防御物質中發(fā)現(xiàn)協(xié)同效應倍增的中藥活性成分組合

植物在面對一種環(huán)境脅迫時，產(chǎn)生多種防御成分來對抗，那么同時產(chǎn)生的防御成分往往可對一種脅迫產(chǎn)生協(xié)同作用。2000年Frank R.Stermitz等[44]就指出了一組出色的天然組合——小檗堿和5’-MHC的協(xié)同抗菌作用使小檗屬植物幾乎不會受到病源菌等微生物的生物脅迫。5’-MHC是專一的微生物多藥耐藥泵（MDR）抑制劑，可強效抑制微生物將小檗堿排出。但是5’-MHC是沒有直接殺菌作用的，5’-MHC與小檗堿聯(lián)合使用時，可以將小檗堿的最低抑菌濃度提高500倍以上。

又如，銀杏在應對光照脅迫時，銀杏葉片中的黃酮和內酯含量會發(fā)生一致性改變，在42%的自然光照強度條件下，黃酮含量和內酯含量最高[45]。而銀杏黃酮和銀杏內酯[46]在心血管疾病上的應用都表現(xiàn)出優(yōu)秀的藥效，且共同參與調節(jié)抗血小板聚集、抗缺血再灌注損傷、保護血管內皮細胞、抗炎、抗動脈粥樣硬化及抗心律失常等心血管疾病的多個方面。更有甚者，銀杏酮酯以作為中藥銀杏制劑應用于臨床。歐洲將銀杏酮酯EGb761(Ginkgo biloba extract30,GBE30)即銀杏黃酮不得低于24%，銀杏內酯不得低于6%作為銀杏制劑的國際標準制品。我國自主研發(fā)、具有獨立知識產(chǎn)權的類似EGb761的新型銀杏制劑—銀杏酮酯GBE50[47]，其銀杏總黃酮含量達44%以上，銀杏內酯達6%以上，臨床用于治療冠心病、心絞痛和腦動脈硬化、眩暈等心腦血管疾病，具有較好的臨床療效。

據(jù)此可見，對抗同一種環(huán)境脅迫的防御成分中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生遺傳協(xié)同致死效應的中藥活性成分是成分發(fā)現(xiàn)效應倍增協(xié)同藥物組合的有效途徑。如，莪術塊根中的莪術油成分為了抵御光照不足而蓄積[48]，丹參中的芳香酸類成分為了應對UV-B輻射和干旱的脅迫而增加[49]，其中莪術油中的莪術醇、莪術二酮，欖香烯等和丹參芳香酸類成分中的迷迭香酸，阿魏酸，丹參素等成分研究均證實可以調控不同信號來發(fā)揮抗腫瘤藥效；那么從這些成分入手，篩選協(xié)同組合使得抗腫瘤效應倍增不失為一個有希望的突破口。

3.2 基于遺傳協(xié)同致死原理以逆向思維發(fā)現(xiàn)中藥效應倍增活性成分組合

從逆向藥理學思維出發(fā)，根據(jù)不同疾病的生物網(wǎng)絡調控過程中靶蛋白之間存在協(xié)同作用，探究中藥微量成分效應倍增的機制，并發(fā)現(xiàn)主要顯效物質組合。提出“遺傳協(xié)同靶點驗證→中藥顯效成分篩選→成分組合藥效評價”的研究思路。

隨著各種組學數(shù)據(jù)的迅速擴增以及合適藥靶的不斷發(fā)現(xiàn)，在不同疾病中基于遺傳協(xié)同靶點的組合藥物研發(fā)逐漸受到重視，其中不乏用于中藥防治疾病的研究。例如，基于遺傳協(xié)同靶點網(wǎng)絡的構建，進行了中藥防治阿爾茲海默（AD）的研究，篩選出了包括32個基因的擬用于防治AD藥物篩選的候選基因群，并發(fā)現(xiàn)針對于這些基因的藥物組合[50]。又如，Wnt信號激活的腫瘤細胞對表皮生長因子受體ErbB 3和血管內皮生長因子受體VEGFR1等信號分子的依賴性增加[51]，Wnt+ErbB 3、Wnt+VEGFR1即可作為抗腫瘤中藥發(fā)現(xiàn)的組合靶點，作用于Wnt信號的水溶性成分丹參素[52]與作用于ErbB 2的丹參酮IIA[53]及作用于VEGFR1的隱丹參酮[54]都是丹參抗腫瘤效應倍增活性成分潛在組合。

將經(jīng)典的遺傳協(xié)同致死模式用以探討中藥有效成分量低，與靶點的親和力弱，但是可以顯效的作用特點。不僅從新的角度詮釋了中藥的作用機制，也為未來天然活性成分發(fā)現(xiàn)提供了一種全新的研究思維模式。

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The Mechanism Study of Micro-substance of Chinese Medicine——The Discovery and Elucidation of Effective Substance and Mechanism of Chinese Medicine via the Theory of Synthetic Lethality

Wei Zhonghong1,2,Yu Suyun1,2,Chen Wenxing1,2,Wang Aiyun1,2,Lu Yin1,2,3*
(1.School of pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;2.Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medicine,Nanjing 210023,China;3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine(TCM)Prevention and Treatment of Tumor,Nanjing 210023,China)

The elaboration of the mechanism and pharmacodynamic substance are the main obstacles to the modernization of Chinese medicine.The rich ingredient of Chinese medicine is almost attention,with a research strategy of forward pharmacology.This strategy often neglects the study of trace components of Chinese medicine.Synthetic lethality,a extremely complex gene interactions,is to magnify the effects of the co-regulation of biological effects(＞1 000 times).The theory of synthetic lethality has achieved good results in the development of anti-tumor drugs,including the discovery of PARP inhibitors,the clinical use of chemotherapy drug addition and attenuation combination.In view of this,this research model may be used to elucidate trace effective substance.Based on the reverse thinking of"targetcomponent-effect"and clear synergistic targets,the mechanism of traces and weak-potency substance of traditional Chinese medicinewasstudied,and the synergistic combination of potential wasfound.

micro-substance of Chinese medicine,synthetic lethality,environment stresses,reverse pharmacology,effective substance

10.11842/wst.2017.09.003

R286

A

2017-08-09

修回日期：2017-09-11

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81673725）：利用“遺傳協(xié)同致死”模式研究丹參微量弱效多成分的效應倍增機制，負責人：陸茵；江蘇省研究生創(chuàng)新基金項目（KYCX17_1315）：基于腫瘤血管芽生的遺傳協(xié)同靶點研究丹參異類協(xié)同機制，負責人：韋忠紅；江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團隊：活血化瘀中藥對腫瘤轉移的調控及機制研究，負責人：陸茵

＊＊ 通訊作者：陸茵，教授，博士生導師，主要研究方向：活血化瘀中藥對腫瘤轉移的影響。

（責任編輯：張 靜，責任譯審：王 晶）