段麗芳,范建偉,張曉芹

(陜西中醫(yī)藥大學病理生理學教研室,咸陽 712046;*通訊作者,E-mail:livina-2007@126.com)

急性白血病源漿細胞樣樹突狀細胞的功能及TLR7、TLR9的表達

段麗芳*,范建偉,張曉芹

(陜西中醫(yī)藥大學病理生理學教研室,咸陽 712046;*通訊作者,E-mail:livina-2007@126.com)

目的 通過觀察急性白血病(AL)患者外周血漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)的功能及Toll樣受體7(TLR7)及TLR9 mRNA的表達變化,探討pDCs功能缺陷的可能原因。 方法 免疫磁珠分選11例初診未治急性淋巴細胞白血病(ALL)、13例急性髓細胞白血病(AML)和15例健康對照(正常對照組)外周血pDCs,用CpG ODN 2216刺激外周血pDCs,收集細胞培養(yǎng)上清液,ELISA檢測上清液IFN-α、TNF-α、IL-6水平;real-time PCR檢測pDCs TLR7 mRNA、TLR9 mRNA表達。 結(jié)果 AML組和ALL組pDCs產(chǎn)生的IFN-α、TNF-α、IL-6水平均明顯低于正常對照組(P<0.05),pDCs功能明顯下降;AML組和ALL組pDCs內(nèi)TLR7 mRNA、TLR9 mRNA亦明顯低于正常對照組(P<0.05)。 結(jié)論 急性白血病源pDCs內(nèi)TLR7 mRNA、TLR9 mRNA表達減少,可能進一步抑制pDCs功能,是AL發(fā)病機制之一。

急性髓細胞白血病; 急性淋巴細胞白血病; Toll樣受體7; Toll樣受體9; 漿細胞樣樹突狀細胞

急性白血病(acute leukemia,AL)作為血液系統(tǒng)常見的惡性克隆性疾病,目前主要的治療手段仍是化療,盡管單純放化療后初診患者完全緩解(CR)率可達到70%-80%,但其中約60%患者不可避免地面臨復(fù)發(fā),因此復(fù)發(fā)是目前白血病治療中的難題[1]。復(fù)發(fā)的根源是化療不能根除體內(nèi)所有的白血病細胞,即使骨髓及血液查不到明顯的白血病細胞,骨髓原始細胞<5%,但體內(nèi)白血病細胞總數(shù)仍有107-109個,稱微小殘留病灶(minimal residual disease,MRD)[2]。免疫治療通過活化吞噬細胞、NK細胞等功能,增細胞胞因子的分泌,重塑機體免疫系統(tǒng),增強抗腫瘤能力,同時有效清除MRD,降低復(fù)發(fā)率,成為白血病繼化療后又一重要的治療手段。漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells,pDCs)是DC的一個重要亞型,活化后通過產(chǎn)生大量IFN-α,進一步激活NK細胞、B細胞、T細胞、巨噬細胞等增強抗腫瘤能力,且自身逐步成熟向樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)分化,而在連接固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著重要作用[3]。而pDCs的功能與其表達的Toll樣受體7(Toll-like receptor 7,TLR7)及TLR9密切相關(guān)[4]。已有研究證實,AL患者體內(nèi)pDCs數(shù)量減少,伴功能缺陷[5],但對pDCs功能缺陷原因未進一步探討。本研究通過分離AL源外周血pDCs,觀察pDCs內(nèi)TLR7及TLR9的表達,探討pDCs功能缺陷的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

急性白血病患者外周血單個核細胞取自陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院血液科,2013-02～2014-02收治的24例初診白血病患者,其中急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者13例(M01例、M25例、M32例、M44例、M51例),急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)患者11例;年齡2-60歲,中位年齡34歲。診斷符合張之南主編的《血液病診斷及療效標準》[6]。健康志愿者15例,年齡8-65歲,中位年齡37歲。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清購自為杭州四季青生物工程公司,Ficoll-hypaqu購自北京索來寶生物科技有限公司,CpG ODN-2216購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。大鼠抗人BDCA-4免疫磁珠為德國美天旎生物技術(shù)公司產(chǎn)品,小鼠抗人BDCA-2、小鼠抗人CD123單克隆抗體購自為荷蘭Hycult公司,RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR試劑購于大連TaKaRa公司,IFN-α ELISA試劑盒(3.9 pg/ml)、IL-6 ELISA試劑盒(靈敏度0.7 pg/ml)及TNF-α ELISA試劑盒(靈敏度5 pg/ml)均為美國R&D公司產(chǎn)品。

1.3 pDCs的分選

外周血單個核細胞(PBMCs)分離:收集AML、ALL患者及健康志愿者外周血20 ml(肝素抗凝),PBS液稀釋,等體積Ficoll-hypaqu行密度梯度離心,收集單個核細胞,液氮保存?zhèn)溆?。pDCs分選:常規(guī)復(fù)蘇凍存的PBMCs,用RPMI 1640調(diào)整細胞密度至1×109/L,加小鼠抗人BDCA-2、小鼠抗人CD123單克隆抗體單抗,經(jīng)細胞磁珠分選系統(tǒng)分離獲得pDCs,檢測其純度為93%,存活率為92%。

1.4 ELISA檢測外周血pDCs釋放的IFN-α、TNF-α及IL-6的含量

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整pDCs密度為1×106/L,接種于48孔培養(yǎng)板(500 μl/孔),加入CpG ODN 2216(終濃度為6 μmol/L),共刺激24 h,收集上清,按ELISA試劑盒說明書檢測各組IFN-α、TNF-α及IL-6含量,顯色后酶標儀檢測450 nm波長OD值,繪制標準曲線,并根據(jù)曲線計算上述細胞因子含量。

1.5 real-time PCR檢測pDCs內(nèi)TLR7 mRNA及TLR9 mRNA的表達

應(yīng)用Primer Express軟件(PE Biosystems)設(shè)計基因特異性PCR引物序列,TLR7上游引物為:5′-TTCAACCAGACCTCTACATTCCATT-3′,下游引物為:5′-GCAGTCCACGATCACA TGGTT-3′;TLR9上游引物為:5′-CCGTGACAATTACCTGGCCTTC-3′,下游引物為:5′-CAGGGCCTTCAGCTGGTTTC-3′;β-actin上游引物為:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,下游引物為:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG AAGCA-3′。按試劑的操作步驟提取pDCs總RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進行PCR,反應(yīng)條件(25 μl體系),SYBR Premix Ex Taqtm II 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl,cDNA(20 mg/L)2 μl,dH2O 8.5 μl。擴增條件:預(yù)熱50 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30s,共40個循環(huán);以CT表達目的基因的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(Mean±SD)描述,采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。各組間采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 pDCs細胞IFN-α、TNF-α、IL-6的表達水平

經(jīng)CpG ODN刺激后,不同組pDCs細胞上清中IFN-α、TNF-α、IL-6分泌水平差異明顯:AML和ALL患者外周血pDCs產(chǎn)生的IFN-α、TNF-α、IL-6的水平均明顯低于正常對照(P<0.05)。AML和ALL組間相比無顯著性差異(見圖1)。

2.2 TLR7 mRNA及TLR9 mRNA擴增曲線

用ABI7500定量PCR儀分析各組外周血pDCs內(nèi)TLR7 mRNA及TLR9 mRNA表達,擴增曲線見圖2。

2.3 pDCs內(nèi)TLR7 mRNA及TLR9 mRNA表達水平

實驗結(jié)果表明:白血病組和正常對照組pDCs中均有TLR7 mRNA、TLR9 mRNA的表達,白血病組外周血pDCs內(nèi)TLR7 mRNA及TLR9 mRNA的表達均明顯低于正常對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AML和ALL組間差異無統(tǒng)計學意義(見圖3)。

與control組比較,#P<0.05圖1 各組pDCs表達的IFN-α、IL-6、TNF-α水平Figure 1 The concentration of cytokines in the supernatant of pDCs with AL

A. TLR7 mRNA B. TLR9 mRNA 圖2 Toll樣受體7及9擴增曲線Figure 2 Amplification curves of the mRNA expression of TLR7 and TLR9

與control組比較,#P<0.05圖3 白血病組及正常對照組TLR7及TLR9的mRNA表達Figure 3 The mRNA expression of TLR7 and TLR9 in AL group and control group

3 討論

1958年,Lennert和Remele在活動性淋巴結(jié)周圍發(fā)現(xiàn)pDCs,因其形態(tài)與漿細胞相似,故將其命名為漿細胞樣單核細胞,后來研究證實這類細胞可向成熟DC分化,又將其命名為pDCs[7]。在病毒等刺激下,pDCs可產(chǎn)生大量IFN-α及其他細胞因子,參與免疫應(yīng)答。其中,IFN-α可抑制腫瘤細胞增殖,誘導腫瘤細胞凋亡,已被用于腫瘤及白血病治療中。pDCs通過誘導初始T細胞向Th2方向分化、活化B細胞、激活NK細胞等方式調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,在固有免疫及適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用[3]。隨著對pDCs功能的深入研究,越來越多的證據(jù)提示,pDCs的功能與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),在HIV感染、慢性乙型肝炎甚至實體瘤中均可見到pDCs數(shù)量減少伴功能缺陷,提示pDCs與多種疾病的發(fā)病和預(yù)后密切相關(guān)[8-10]。

前期研究已經(jīng)證實慢性粒細胞白血病患者外周血pDCs分泌的細胞因子數(shù)量明顯減少,緩解期則明顯好轉(zhuǎn),提示pDCs功能缺陷參與慢性粒細胞白血病發(fā)病[11]。本實驗結(jié)果顯示:急性髓細胞白血病(AML)及急性淋巴細胞白血病(ALL)患者外周血pDCs分泌的IFN-α、TNF-α、IL-6水平均明顯下降,提示pDCs功能缺陷可能參與白血病發(fā)病。pDCs功能缺陷,不能產(chǎn)生足夠的細胞因子,造成B細胞活化障礙,影響體液免疫,同時誘導成熟DC減少,NK細胞活化功能障礙,T細胞極化受到影響不能發(fā)揮正常的細胞免疫,引起免疫微環(huán)境紊亂,抗腫瘤免疫能力下降,造血干細胞惡克隆性增生。

pDCs分泌大量的細胞因子與其表面的模式識別受體有關(guān)。研究證實,pDC選擇性表達TLR7和TLR9模式識別分子[12]。TLR7/9識別配體后,通過TIR募集下游的關(guān)鍵分子MyD88,磷酸化IRAK,與TRAF6結(jié)合,IRAKs/TRAF6復(fù)合物聯(lián)合TAK1激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)[4]。此外,IRAKs/TRAF6復(fù)合物激活干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)活化pDCs[13]。在pDC早期內(nèi)體,A型CpG DNA激活TLR9后觸發(fā)IRF7介導的信號級聯(lián)反應(yīng),導致IFN-I釋放。B型CpG DNA激活TLR9后,在晚期內(nèi)體激活NF-κB/MAPKs信號級聯(lián)反應(yīng),釋放TNF-α和IL-6。其中TNF-α提高pDCs抗原提呈作用的同時,上調(diào)MHC-Ⅰ類分子的表達,促進DC成熟;IL-6聯(lián)合IFN-α則可以誘導B細胞成熟,增強固有免疫應(yīng)答[14];還可促使T細胞向Th2分化,活化NK細胞增強其抗腫瘤能力,提高獲得性免疫應(yīng)答[12]。TLR7及TLR9下調(diào)可減弱對病原體的易感性和特異性免疫[15]。

徐寧等[16]研究揭示,慢性乙型肝炎患者體內(nèi)pDCs內(nèi)TLR7及TLR9表達下降是pDCs功能缺陷的主要原因,參與疾病進展。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)慢性細胞白血病源pDCs內(nèi)TLR7及TLR9表達亦導致pDCs功能缺陷。本實驗還觀察到,AL患者外周血pDCs功能下降的同時,伴TLR7及TLR9表達下調(diào)。TLR7及TLR9是pDCs活化的重要的模式識別受體,AL患者體內(nèi)造血微環(huán)境及免疫微環(huán)境的改變,導致TLR7及TLR9表達減少,pDCs功能缺陷,不能激活下游的信號轉(zhuǎn)導途徑,分泌的細胞因子減少,導致DCs、NK細胞及效應(yīng)T細胞功能紊亂,對Treg的抑制作用減輕,影響固有免疫和適應(yīng)性免疫的功能,促使AL細胞克隆性生長。研究結(jié)果提示TLR7及TLR9表達減少可能是pDCs功能下降的重要原因。因此,通過提高TLR7及TLR9表達,重建pDCs的功能及相應(yīng)的免疫網(wǎng)絡(luò),恢復(fù)機體原有的免疫狀態(tài),使微小殘留病灶處于休眠期狀態(tài)而有望成為潛在治療手段。

綜上,急性白血病進展中pDCs數(shù)量減少,分泌的細胞因子減少,造成免疫功能紊亂,參與AL發(fā)病促進AL進展;pDCs功能缺陷與TLR7及TLR9表達減少有關(guān)。本研究結(jié)果證實了AL源pDCs功能缺陷的主要原因,為以pDCs為靶點的生物免疫治療提供實驗依據(jù)。

[1] Eigendorff E, Hochhaus A. Acute leukemia in adults[J]. Pathologe, 2015, 36(5):503-517.

[2] 黎國偉,王東寧,葉玉蝶,等.急性髓細胞白血病CDX2基因表達及臨床意義的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2009,16(16):1253-1255.

[3] Swiecki M, Colonna M. The multifaceted biology of plasmacytoid dendritic cells[J]. Nat Rev Immunol, 2015, 15(8):471-485.

[4] Bao M, Liu YJ. Regulation of TLR7/9 signaling in plasmacytoid dendritic cells[J]. Protein Cell, 2013, 4(1):40-52.

[5] 劉立明,張彥明,陸沭華,等.黃芪多糖促進急性髓細胞白血病患者細胞樣樹突狀細胞成熟[J].中國腫瘤生物治療雜志,2010,17(6):657-660.

[6] 張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].北京:科學出版社,2008:178-180.

[7] Mathan TS, Figdor CG, Buschow SI. Human plasmacytoid dendritic cells: from molecules to intercellular communication network[J]. Front Immunol, 2013, 4:372-396.

[8] Lombardi VC, Khaiboullina SF, Rizvanov AA. Plasmacytoid dendritic cells, a role in neoplastic prevention and progression[J]. Eur J Clin Invest, 2015, 45(Suppl 1):1-8.

[9] Santana-de Anda K, Gomez-Martin D, Soto-Solis R,etal. Plasmacytoid dendritic cells: key players in viral infections and autoimmune diseases[J]. Semin Arthritis Rheum, 2013, 43(1):131-136.

[10] Dhamanage A, Thakar M, Paranjape R. Human immunodeficiency virus-1 impairs IFN-alpha production induced by TLR-7 agonist in plasmacytoid dendritic cells[J]. Viral Immunol, 2017, 30(1):28-34.

[11] 段麗芳,張連生,岳玲玲,等.Toll樣受體7及9在慢性粒細胞白血病患者漿細胞樣樹突狀細胞內(nèi)的表達[J].中國腫瘤生物治療雜志,2012,19(3):257-260.

[12] Cao W, Bover L, Cho M,etal. Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction[J]. J Exp Med, 2009, 206(7):1603-1614.

[13] Kim TW, Hong S, Lin Y,etal. Transcriptional repression of IFN regulatory factor 7 by MYC is critical for type I IFN production in human plasmacytoid dendritic cells[J]. J Immunol, 2016, 197(8): 3348-3359.

[14] Hardy AW, Graham DR, Shearer GM,etal. HIV turns plasmacytoid dendritic cells(pDC) into TRAIL-expressing killer pDC and down-regulates HIV coreceptors by Toll-like receptor 7-induced IFN-alpha[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(44):17453-17458.

[15] Saitoh S, Miyake K. Regulatory molecules required for nucleotide-sensing Toll-like receptors. Immunol Rev, 2009, 227(1):32-43.

[16] 徐寧.Toll樣受體7,9在慢性乙型肝炎發(fā)病機制中作用的研究[D].寧波:浙江大學,2007.

ThefunctionofplasmacytoiddendriticcellsandtheexpressionofTLR7mRNAandTLR9mRNAinacuteleukemia

DUAN Lifang*,FAN Jianwei,ZHANG Xiaoqin

(DepartmentofPathophysiology,ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046，China;*Correspondingauthor,E-mail:livina-2007@126.com)

ObjectiveTo explore the causes of plasmacytoid dendritic cells(pDCs) dysfunction by observing the function of pDCs and Toll-like receptor 7(TLR7) mRNA and TLR9 mRNA expression in patients with acute leukemia(AL).MethodsThe peripheral blood pDCs from 11 patients with untreated acute lymphocytic leukemia(ALL), 13 patients with acute myeloid leukemia(AML) and 15 healthy controls(normal control group) were sorted by immune magnetic beads. After the pDCs were cultured with CpG ODN 2216, the supernatants were collected to detect the levels of IFN-α, TNF-α and IL-6 in supernatants by ELISA and the expression of TLR7 mRNA and TLR9 mRNA in pDCs by real-time PCR.ResultsThe levels of IFN-α, TNF-α and IL-6 produced by pDCs were significantly lower in patients with AML and ALL than those of normal controls(P<0.05), and the pDCs function significantly decreased. Compared with controls, the mRNA expression of TLR7 and TLR9 in pDCs was significantly decreased in AML and ALL patients(P<0.05).ConclusionThe expression of TLR7 mRNA and TLR9 mRNA in pDCs of AL decrease, which further inhibits the function of pDCs and promote the pathogenesis of AL.

acute myelocytic leukemia; acute lymphoblastic leukemia; Toll like receptor 7; Toll like receptor 9; plasmacytoid dendritic cells

陜西省教育廳科學研究項目(14JK1191);陜西中醫(yī)藥大學科研創(chuàng)新基金項目(2015QN06)

段麗芳,女,1986-01生,碩士,講師,主治醫(yī)師,E-mail:livina-2007@126.com

2017-06-30

R733.7

A

1007-6611(2017)11-1141-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.011