周寧娟,張 娟,馬婧一,郭 穎,湯麗萍,蘇 慧,孫 新*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科,西安 710032;2西京醫(yī)院老年病科;*通訊作者,E-mail:sunxin6@fmmu.edu.cn)

胰島素抵抗對(duì)小鼠哮喘模型氣道高反應(yīng)性及肺部炎癥的影響

周寧娟1,張 娟1,馬婧一1,郭 穎1,湯麗萍1,蘇 慧2,孫 新1*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科,西安 710032;2西京醫(yī)院老年病科;*通訊作者,E-mail:sunxin6@fmmu.edu.cn)

目的 探討胰島素抵抗對(duì)小鼠哮喘模型氣道高反應(yīng)性(AHR)及肺部炎癥的影響。 方法 3周齡C57BL/6J雄性小鼠60只隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(HC)、哮喘組(NIRA)、胰島素抵抗組(IRNA)、胰島素抵抗+哮喘組(IRA),每組15只。HC組、NIRA組均給予普通飼料喂養(yǎng);IRNA組、IRA組均給予高脂飼料喂養(yǎng),共喂養(yǎng)9周后,計(jì)算各組小鼠穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗評(píng)價(jià)指數(shù)(HOMA-IR),評(píng)估胰島素抵抗程度;在小鼠胰島素抵抗模型建立成功后,NIRA組和IRA組小鼠給予卵清蛋白(OVA)致敏、激發(fā),分別建立哮喘模型;HC組和IRNA組小鼠給予生理鹽水作為對(duì)照。末次激發(fā)24 h內(nèi),依次霧化吸入濃度為0,3,6,12,25,50,100 mg/ml Mch,測(cè)定氣道高反應(yīng)性,制作肺病理切片,計(jì)數(shù)肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)及分類,檢測(cè)血清和肺泡灌洗液(BALF)中相關(guān)炎性因子的含量,對(duì)各組小鼠氣道高反應(yīng)性及炎性因子水平的變化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 與NIRA組相比,在吸入乙酰甲膽堿(Mch)濃度為12,25,50,100 mg/ml時(shí),IRA組小鼠氣道阻力明顯升高(P<0.05);肺組織病理切片中,HC組、IRNA組小鼠肺組織無(wú)炎癥改變,NIRA組、IRA組炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,尤以IRA組更甚。與HC組比較,NIRA組、IRA組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯增高(均P<0.01);血清中抗OVA特異性IgE和IgG1水平顯著升高(P<0.01或P<0.05);BALF中IL-4、IL-17的水平明顯升高(P<0.01或P<0.05),且IRA組明顯高于NIRA組(P<0.05);IFN-γ的水平明顯降低(P<0.05),且IRA組明顯低于NIRA組(P<0.05)。 結(jié)論 胰島素抵抗促進(jìn)哮喘小鼠炎癥因子的釋放,加重肺部炎癥,增加氣道高反應(yīng)性,加重哮喘的發(fā)生和發(fā)展。

胰島素抵抗; 哮喘; 氣道高反應(yīng)性; 炎性因子

支氣管哮喘(bronchial asthma,BA)是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病[1]。氣道高反應(yīng)(airway hyperresponsiveness,AHR)又稱為支氣管高反應(yīng)性,是指哮喘患者對(duì)多種刺激物的反應(yīng)性異常增高,吸入刺激性物質(zhì)后,更易出現(xiàn)支氣管平滑肌的收縮、黏液分泌增多及免疫炎性介質(zhì)的釋放,氣道阻力急速短暫或較長(zhǎng)時(shí)間的上升、肺通氣功能下降[2]。世界范圍內(nèi)支氣管哮喘的發(fā)病呈逐年增高的趨勢(shì),尤其是兒童[3],大量流行病學(xué)資料表明,兒童期肥胖是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素,慢性炎癥導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂可能是導(dǎo)致其發(fā)生的原因,但具體作用機(jī)制尚不明確[4-6]。然而,近期有研究顯示肥胖不一定都能加重哮喘,只有在胰島素抵抗和(或)糖耐量調(diào)節(jié)異常的狀態(tài)下,才可能加重哮喘的發(fā)生,胰島素抵抗或代謝綜合征是發(fā)生肥胖哮喘的重要危險(xiǎn)因素[7,8]。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是指機(jī)體胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素作用的敏感性下降,即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于其正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài),可誘發(fā)心肺血管疾病、糖尿病、肥胖、血糖異常、血脂紊亂等疾病或生理紊亂狀態(tài)[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗、高胰島素血癥與支氣管哮喘的慢性炎癥狀態(tài)發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。相關(guān)的臨床研究表明,肺功能受損與糖尿病和血糖水平升高密切相關(guān)[10,11]。此外,流行病學(xué)調(diào)查表明:胰島素抵抗和高胰島素血癥與肺功能的下降密切相關(guān)[12,13]。IR在哮喘發(fā)生、發(fā)展中的作用越來(lái)越被重視,但是目前有關(guān)IR對(duì)肺功能以及肺部炎癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究較少且差異很大。因此,本研究通過(guò)建立穩(wěn)定的胰島素抵抗哮喘小鼠模型,探討胰島素抵抗對(duì)氣道高反應(yīng)性及肺部炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

卵清蛋白(ovalbumin,OVA)(美國(guó)Sigma公司),高脂飼料:D12492(開(kāi)源動(dòng)物飼料有限公司),乙酰甲膽堿(acetyl-β-methylcholinechloride,Mch)(美國(guó)Sigma公司),氫氧化鋁(天津市天力化學(xué)試劑公司),IgE、IgG1、IL-4、IL-10、IL-17、INF-γ、小鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒(美國(guó)R&D Systems公司),小鼠肺功能儀(加拿大SCIREQ公司),空氣壓霧縮化器(歐姆龍大連有限公司),酶標(biāo)分析儀(無(wú)錫華衛(wèi)德郎儀器有限公司),超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

3周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠60只[SCXK(軍)2012-0007],體質(zhì)量(10.93±0.64)g,購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)于西京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,恒定室溫(21-25 ℃),濕度50%-65%,光照10-12 h/d。飼料共兩種:為普通飼料和純化高脂飼料(D12492)。普通飼料熱量構(gòu)成比為:脂肪10%,蛋白質(zhì)24%,碳水化合物66%,總熱量為348 kcal/100 g,由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;高脂飼料熱量構(gòu)成比為:脂肪60%,碳水化合物20%,蛋白質(zhì)20%,總熱量為524 kcal/100 g,由開(kāi)源動(dòng)物飼料有限公司提供。飼養(yǎng)過(guò)程遵循西京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物保護(hù)和使用指南。

1.3 胰島素抵抗小鼠模型的建立

1.4 哮喘模型的建立

致敏:在確定胰島素抵抗模型成功后的第0,7,14天,NIRA組、IRA組采用含OVA[100 μg OVA+1.5 mg Al(OH)3]的生理鹽水配成的200 μl致敏液腹腔注射致敏。HC組、IRNA組采用僅含有Al(OH)3,不含OVA的生理鹽水200 μl腹腔注射,注射方法,部位相同。

激發(fā):NIRA組、IRA組于第21-28天放在霧化箱中,用1%OVA霧化液連續(xù)霧化吸入激發(fā)8 d,每天1次,每次30 min,HC組、IRNA組用生理鹽水在相同條件下霧化激發(fā),激發(fā)次數(shù)、持續(xù)時(shí)間相同。

1.5 肺氣道高反應(yīng)性的測(cè)定

4組小鼠在末次霧化吸入激發(fā)24 h內(nèi),每組隨機(jī)取5只小鼠,在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行氣管插管,啟動(dòng)小鼠肺功能儀FlexiVent軟件系統(tǒng)并進(jìn)行校正,將插管成功的小鼠鏈接于Y型管,依次霧化吸入濃度為0,3,6,12,25,50,100 mg/ml Mch,每次間隔2 min,測(cè)定小鼠氣道總阻力(Rrs),記錄小鼠氣道阻力值。

1.6 血清的收集及BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類

1.7 肺組織病理學(xué)檢查

肺泡灌洗完畢后,暴露小鼠肺部,取小鼠左肺組織,將其固定在4 ml 4%多聚甲醛溶液中至少24 h,常規(guī)石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察病理改變。

1.8 細(xì)胞因子的檢測(cè)

用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)血清中抗OVA特異性IgE及IgG1水平;用ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中IL-4、IL-10、IL-17、INF-γ的水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量的比較

隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組小鼠體質(zhì)量逐漸增加,從第2周開(kāi)始,與HC組相比,IRNA組、IRA組鼠體質(zhì)量明顯增加(均P<0.01,見(jiàn)圖1)。第5周末,IRNA組、IRA組小鼠肥胖度均超過(guò)20%,可認(rèn)為肥胖。

第2-14周IRNA組和IRA組與HC組比較均P<0.01圖1 各組小鼠體質(zhì)量的變化 (n=15)Figure 1 Changes of the body weight in different groups (n=15)

2.2 小鼠空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)的比較

造模第9周末,分別測(cè)定4組小鼠FPG、FINS,采用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法計(jì)算HOMA-IR。IRNA組(2.82±0.30)和IRA組(2.89±0.37)HOMA-IR均>2.5(見(jiàn)表1),可確定胰島素抵抗模型建立成功。

組別nFPG(mmol/L)FINS(mIU/L)HOMA?IR(mmol·mIU/L2)HC組15509±052325±044074±013NIRA組15499±043?327±046?073±012?IRNA組15785±056?808±075?282±030?IRA組15803±063?810±084?289±037?

與HC組比較,*P<0.05

2.3 哮喘急性發(fā)作癥狀

NIRA組、IRA組小鼠在霧化過(guò)程中均出現(xiàn)不同程度的煩躁或安靜少動(dòng)、全身瘙癢、抓臉、呼吸加快、點(diǎn)頭呼吸、弓背直立、前肢縮抬、腹肌抽搐等哮喘速發(fā)相表現(xiàn),HC組、IRNA組小鼠霧化過(guò)程中活動(dòng)自如,無(wú)上述表現(xiàn)。

2.4 小鼠氣道高反應(yīng)性

隨著吸入Mch濃度的增加,NIRA組、IRA組小鼠氣道阻力逐漸增高,HC組和IRNA組小鼠氣道阻力沒(méi)有明顯變化。與HC組相比,1.5,3,6,12,25,50,100 mg/ml Mch時(shí)NIRA組和IRA組小鼠氣道阻力明顯升高(P<0.05);與NIRA組相比,12,25,50,100 mg/ml Mch時(shí)IRA組小鼠氣道阻力明顯升高(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

2.5 肺組織病理?yè)p害

HC組、IRNA組小鼠肺組織整體結(jié)構(gòu)基本正常,肺泡無(wú)明顯萎縮或擴(kuò)張,肺泡隔正常,組織無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。NIRA組、IRA組可見(jiàn)細(xì)小支氣管及伴行血管周圍有較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),IRA組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯(如黑色箭頭所示,見(jiàn)圖3)。

2.6 支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)及炎性細(xì)胞分類

與HC、IRNA組小鼠相比,NIRA、IRA組小鼠白細(xì)胞總數(shù)均明顯增多(P<0.01),主要表現(xiàn)為嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的增多;與NIRA組相比,IRA組小鼠白細(xì)胞總數(shù)增多更為明顯(P<0.01),其中嗜酸性粒細(xì)胞的增高更明顯(P<0.05,見(jiàn)圖4，5)。

與HC組比較,#P<0.05;與NIRA組相比,*P<0.05圖2 各組小鼠氣道阻力的變化Figure 2 The changes of Rrs in four groups

A.HC組 B.NIRA組 C.IRNA組 D.IRA組圖3 各組小鼠肺組織病理變化 (HE染色,×200)Figure 3 Pathological changes of lung tissues in each group (HE staining,×200)

與HC組比較,#P<0.01;與NIRA組相比,*P<0.01圖4 四組BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 (n=9)Figure 4 The total white blood cell count in the BALF in four groups (n=9)

與HC組比較,#P<0.01;與NIRA組相比,*P<0.05圖5 各組小鼠BALF中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果 (n=9)Figure 5 The defferential leukocyte counts in the BALF in four groups (n=9)

2.7 血清中抗OVA特異性IgE及IgG1水平

與HC組和IRNA組相比,NIRA組和IRA組小鼠血清中IgE(P<0.01)及IgG1(P<0.05)水平顯著升高,表明小鼠哮喘模型復(fù)制成功。與NIRA組相比,IRA組小鼠血清中IgE(P<0.01)及IgG1(P<0.05)水平升高更顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖6)。

2.8 小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-17、INF-γ的濃度

與HC組和IRNA組相比,NIRA組和IRA組小鼠BALF中IL-4(P<0.01)、IL-17(P<0.05)的濃度明顯升高,而INF-γ的濃度明顯降低(P<0.05);與NIRA組相比,IRA組小鼠BALF中IL-4(P<0.01)、IL-17(P<0.05)的升高更明顯,INF-γ的降低更明顯(P<0.05,見(jiàn)圖7)。

與HC組比較,*P<0.05,**P<0.01圖6 小鼠血清抗OVA特異性IgE和IgG1水平 (n=9)Figure 6 The levels of serum OVA specific IgE and IgG1 in four groups (n=9)

與HC組比較,*P<0.05,**P<0.01;與IRNA組相比,#P<0.05,##P<0.01圖7 四組小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-17、INF-γ的濃度 (n=9)Figure 7 The concentrations of IL-4,IL-17 and INF-γ in the BALF in four groups (n=9)

3 討論

哮喘是全球最常見(jiàn)的慢性疾病之一,據(jù)估計(jì),全球大約3億人患有哮喘,每年約有25萬(wàn)人死于哮喘[2]。哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,氣道高反應(yīng)性是支氣管哮喘肺功能最典型的病理生理特征之一。AHR的改善程度是評(píng)估哮喘治療效果的重要指標(biāo)[17]。近年來(lái),大量流行病學(xué)調(diào)查和研究顯示:存在胰島素抵抗、高胰島素血癥的患者,肺功能均受到不同程度的損傷[12,13]。胰島素抵抗已成為肥胖兒童哮喘發(fā)病增加的重要危險(xiǎn)因素,但它們之間的作用機(jī)制尚不清楚。我們課題組研究的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了它們之間的相互作用,為進(jìn)一步機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。在本次實(shí)驗(yàn)中,隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組小鼠體質(zhì)量逐漸增加,第5周末,IRNA組、IRA組小鼠肥胖度均超過(guò)20%,然而,在第9周末時(shí)高脂飲食組(IRNA和IRA組)小鼠才出現(xiàn)胰島素抵抗,IRNA組(2.82±0.30)、IRA組(2.89±0.37)HOMA-IR值>2.5。結(jié)果表明:肥胖不一定伴有胰島素抵抗,這可能與肥胖持續(xù)的時(shí)間和程度有關(guān)。

眾多研究表明,體內(nèi)Th1/Th2比例失調(diào)是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的重要因素,在哮喘發(fā)病過(guò)程中Th1細(xì)胞功能降低,Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)[18]。Th1細(xì)胞主要分泌INF-γ等細(xì)胞因子,Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5及IL-13等細(xì)胞因子。其中,IFN-γ、IL-4分別是Th1和Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子,嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞[19]。在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)OVA致敏、激發(fā),NIRA組和IRA組小鼠BALF中IL-4(P<0.01)、IL-17(P<0.05)的水平較HC組明顯升高,且IRA組明顯高于NIRA組(P<0.01);IFN-γ的水平明顯降低(P<0.05),且IRA組明顯低于NIRA組(P<0.05)。NIRA組和IRA組小鼠均出現(xiàn)不同程度的煩躁或安靜少動(dòng)、全身瘙癢、抓臉、呼吸加快、點(diǎn)頭呼吸、弓背直立、前肢縮抬、腹肌抽搐等哮喘速發(fā)相表現(xiàn),HC組和IRNA組小鼠活動(dòng)自如,無(wú)上述表現(xiàn)。與HC組相比,NIRA組和IRA組小鼠血清中IgE(P<0.01)及IgG1(P<0.05)水平顯著升高;肺組織病理切片中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯高于其他各組(P<0.01),且與NIRA組相比,IRA組上述表現(xiàn)更加顯著。這些實(shí)驗(yàn)室結(jié)果表明與單純哮喘(NIRA)小鼠相比,胰島素抵抗哮喘(IRA)小鼠哮喘癥狀、體內(nèi)炎性因子的改變更為顯著,證實(shí)了胰島素抵抗可能通過(guò)改變相關(guān)炎性因子的水平而加重氣道炎癥的產(chǎn)生,使氣管平滑肌收縮力增加,加重哮喘。

在測(cè)定小鼠氣道高反應(yīng)性時(shí),隨著吸入Mch濃度的增加,NIRA組、IRA組小鼠氣道阻力逐漸增高,而HC組、IRNA組小鼠氣道阻力沒(méi)有明顯變化。與HC組相比,在吸入Mch濃度為1.5,3,6、12,25,50,100 mg/ml時(shí),NIRA組和IRA組小鼠氣道阻力明顯升高(均P<0.05),說(shuō)明哮喘小鼠和胰島素抵抗哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性明顯增高;與NIRA組相比,在吸入Mch濃度為12,25,50,100 mg/ml時(shí),IRA組小鼠氣道阻力明顯升高(P<0.05),結(jié)果表明在吸入相同濃度的Mch時(shí),胰島素抵抗哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性增高更為顯著,進(jìn)而說(shuō)明存在胰島素抵抗可能會(huì)增加氣道高反應(yīng)性,加重哮喘。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了肥胖不一定存在胰島素抵抗,這與肥胖持續(xù)的時(shí)間和程度有關(guān);胰島素抵抗可以增加哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性;同時(shí)促進(jìn)OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中炎性因子IL-4、IL-17的釋放,降低IFN-γ的水平,加重氣道炎癥反應(yīng),進(jìn)而加重哮喘。此次實(shí)驗(yàn)為下一步研究胰島素抵抗和哮喘之間的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Effectofinsulinresistanceonairwayhyperresponsivenessandpulmonaryinflammationinthemodelofinsulinresistanceasthma

ZHOU Ningjuan1,ZHANG Juan1,MA Jingyi1,GUO Ying1,TANG Liping1,SU Hui2,SUN Xin1*

(1DepartmentofPediatrics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofGeriatrics,XijingHospital;*Correspondingauthor,E-mail:sunxin6@fmmu.edu.cn)

ObjectiveTo explore the effects of insulin resistance on airway hyperresponsiveness(AHR) and pulmonary inflammation in the asthma mice.MethodsSixty 3-week-old specific pathogen free level male C57BL/6J mice were randomly divided into four groups: healthy control group(HC), non-insulin resistance asthmatic group(NIRA), insulin resistance non-asthmatic group(IRNA) and insulin resistance asthmatic group(IRA). The mice

a standard chow diet in HC group and NIRA group, and a high-fat diet(D12492) in IRNA group and IRA group. After feeding for 9 weeks, insulin resistance was assessed by homoeostasis model assessment-estimated insulin resistance(HOMA-IR). After insulin resistance mouse model was successfully established, the mice in NIRA group and IRA group were intraperitoneally sensitized and orally challenged with ovalbumin(OVA)respectively to induce allergic asthma, while the mice in HC group and IRNA group were treated with equal normal saline(NS)as control. In 24 h after the last challenge, the mice were successively given inhalation of 0, 3, 6, 12, 25, 50, 100 mg/ml Mch to detect the bronchial hyperreactivity and prepare lung tissue section for morphometrical lung analysis. Leukocyte and its subgroup populations in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were counted, and the levels of inflammatory factors were detected.Changes of airway hyperresponsiveness and the levels of inflammatory cytokines were compared.ResultsCompared to NIRA group, AHR significantly increased at 12, 25, 50, 100 mg/ml in IRA group(P<0.05). There was no appreciable inflammatory cell infiltration in lungs in HC group and IRNA group. However, the inflammatory infiltration was obviously observed in both NIRA group and IRA group, especially IRA group. Compared to HC group, the number of total inflammatory cells and eosinophils increased in NIRA group and IRA group(P<0.01), OVA-specific IgE and IgG1 were also significantly elevated in NIRA group and IRA group(P<0.01 orP<0.05),Th2 cytokines(IL-4, IL-17) in the BALF were significantly increased in NIRA group and IRA group(P<0.01 orP<0.05), especially in IRA group,while the level of IFN-γ decreased in NIRA group and IRA group(P<0.05).ConclusionInsulin resistance can aggravate the occurrence and development of asthmais by promoting the release of inflammatory cytokines,increasing AHR, and promoting the airway remodeling.

insulin resistance; asthma; bronchial hyperreactivity; inflammatory cytokines

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81670449，31371151，31271219)

周寧娟，女，1985-02生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：zhounjqm@163.com

2017-07-18

R562.25

A

1007-6611(2017)11-1129-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.009