周榮勝,劉慶波,顏 飛,王 強,李小剛,劉齊寧

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院麻醉科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:lqnhhlqnhh@163.com)

門靜脈和下腔靜脈不同阻斷時間對肺動脈高壓大鼠血漿和肺組織ET-1、NO、TXB2和HO-1表達的影響

周榮勝,劉慶波,顏 飛,王 強,李小剛,劉齊寧*

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院麻醉科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:lqnhhlqnhh@163.com)

目的 探討門靜脈和下腔靜脈不同阻斷時間對肺動脈高壓大鼠血漿和肺組織中ET-1、NO、TXB2和HO-1表達的影響。 方法 80只健康清潔級雄性SD大鼠隨機分為實驗組和對照組,每組40只。根據(jù)門靜脈和下腔靜脈阻斷時間的長短,兩組均分為4個亞組:T1(0 min)、T2(15 min)、T3(30 min)、T4(45 min),每組10只。實驗組腹腔注射野百合堿60 mg/kg,對照組注射同等劑量的生理鹽水;3周后,經右側頸外靜脈插入聚苯乙烯管,測量右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure,RVSP)、肺動脈平均壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)。開腹,解剖暴露,實驗組和對照組大鼠門靜脈和下腔靜脈分別被阻斷0，15，30，45 min。開放后取門靜脈血、肺動脈血和肺組織,ELISA試劑盒檢測血中內皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)、血栓素B2(TXB2)、血紅素氧化酶-1(HO-1)的表達。 結果 與對照組相比較,實驗組RVSP和mPAP顯著升高(P<0.05),表明肺動脈高壓模型建立成功;在肺組織勻漿、肺動脈血、門靜脈血中，實驗組ET-1、TXB2和HO-1在門靜脈和下腔靜脈阻斷0，15，30，45 min四個時間的表達均高于對照組,而實驗組NO的表達均低于對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);對照組內4個阻斷時間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);實驗組門靜脈和下腔靜脈阻斷時間越長,ET-1、TXB2和HO-1的表達越高,NO的表達越低,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論 隨著門靜脈和下腔靜脈阻斷時間的增長,ET-1、TXB2的表達增高,NO的表達降低,對肺動脈高壓大鼠的危害越大;同時HO-1表達增高,這對肺動脈高壓大鼠可能有一定的保護作用。

門靜脈-下腔靜脈阻斷; 肺動脈高壓; ET-1; NO; TXB2; HO-1

終末期肝病常可累及肺血管,有研究顯示6.3%-8.5%患者合并有肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH),而肺動脈高壓是肝移植圍手術期間高死亡率的主要原因,防治肺動脈高壓是降低肝移植圍手術期死亡率的關鍵[1]。門靜脈和下腔靜脈阻斷是肝移植手術過程中常用的操作,對機體及血流動力學的影響很大,對于本身有肺動脈高壓的患者來說影響更大。因此,探討門靜脈和下腔靜脈阻斷對PAH患者的發(fā)展機制并找到處理對策,阻斷肺動脈高壓的惡性循環(huán),減少并發(fā)癥的發(fā)生,對提高病人的術后生存具有重要的意義。通過文獻檢索,我們發(fā)現(xiàn)有關門靜脈和下腔靜脈阻斷對PAH患者影響的文獻很少,大都集中在圍術期治療方面,而對門靜脈和下腔靜脈阻斷時間長短對圍術期肺動脈高壓的影響卻鮮有報道。本實驗首先建立大鼠肺動脈高壓模型,然后對門靜脈和下腔靜脈采取不同阻斷時間,檢測血漿和肺組織中ET-1、NO、TXB2和HO-1的含量變化,探討不同阻斷時間對PAH大鼠ET-1、NO、TXB2和HO-1表達的影響,為PAH患者圍手術期的防治提供臨床指導作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

健康清潔級雄性SD大鼠80只,體質量230-280 g,由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。適應性喂養(yǎng)3-4 d后,進行實驗。野百合堿(美國Sigma公司提供);大鼠ET-1 ELISA試劑盒、大鼠NO ELISA試劑盒、大鼠HO-1 ELISA試劑盒和大鼠TXB2ELISA試劑盒均為武漢博士德(Boster)生物工程有限公司提供;DG3090自動酶標洗板機(南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)、ELx808吸收光酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)、finnpipette移液器(美國Thermo Scientific)等儀器由西安交通大學醫(yī)學部實驗中心提供。

1.2 動物分組和模型制備

80只健康清潔級雄性SD大鼠隨機分為實驗組和對照組,每組40只。根據(jù)門靜脈和下腔靜脈阻斷時間的長短,兩組均分為4個亞組:T1(阻斷0 min)、T2(阻斷15 min)、T3(阻斷30 min)、T4(阻斷45 min),每組10只。適應性喂養(yǎng)3 d后,實驗組腹腔注射野百合堿60 mg/kg,對照組注射同劑量的生理鹽水。同等條件下喂養(yǎng)3周,每天記錄大鼠的活動情況、進食情況、體質量變化、毛發(fā)的光滑度和有無死亡等。3周后,先麻醉,然后進行門靜脈和下腔靜脈阻斷實驗,取門靜脈血和肺動脈血,放血處死大鼠后,取右肺上葉置于10%中性福爾馬林溶液浸泡固定。

1.3 肺動脈平均壓、右心室收縮壓測定

10%烏拉坦(1 000 mg/kg)大鼠腹腔注射麻醉后,仰臥固定在手術臺上。小心分離氣管,插入氣管導管,用調整好參數(shù)的動物呼吸機輔助控制呼吸;分離右側頸外靜脈,將與壓力換能器連接并且充滿肝素溶液的聚苯乙烯管插入右側頸外靜脈,按順序通過右心房、右心室、肺動脈,測量右心室收縮壓(RVSP)、肺動脈平均壓(mPAP)。

1.4 門靜脈血、肺動脈血、肺組織勻漿的制備

1.5 肺組織形態(tài)學觀察(HE染色)

取部分肺組織經過脫蠟,水化,染色,脫水,透明,封片,在光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學變化,采集圖像。

1.6 ELISA法檢測ET-1、NO、TXB2和HO-1含量

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差形式表示。采用SPSS17.0軟件包進行分析。組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準取α=0.05,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織形態(tài)學觀察

對照組大鼠肺組織呈淡紅色,未見出血點、瘀點或瘀斑;實驗組可見兩肺表面蒼白,并可見點狀出血灶和瘀斑。光鏡下,可見對照組肺組織結構完整,無炎性細胞浸潤,血管壁未見增厚;實驗組肺組織血管壁增厚,肺間質增厚水腫,有大量炎性細胞浸潤,肺泡腔大小不一,且有破裂,可見紅色滲出液(見圖1)。

A.實驗組 B.對照組圖1 肺組織HE染色 (×200)Figure 1 Pathology of lung tissues by HE (×200)

2.2 右心室收縮壓及肺動脈平均壓的測定

與對照組相比,實驗組大鼠的RVSP和mPAP均顯著升高(P<0.05,見表1),表明肺動脈高壓的模型建立成功。

組別RVSP(mmHg)mPAP(mmHg)實驗組4355±858?3365±904?對照組2332±2142043±382

與對照組比較,*P<0.05

2.3 ET-1的表達水平

在肺組織勻漿、肺動脈血、門靜脈血中,實驗組ET-1在門靜脈和下腔靜脈阻斷0，15，30，45 min的表達均高于對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組內4個阻斷時間兩兩比較,對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),實驗組ET-1的表達水平隨阻斷時間的增長而增高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表2)。

2.4 NO的表達水平

在肺組織勻漿、肺動脈血、門靜脈血中,實驗組NO在門靜脈和下腔靜脈阻斷0，15，30，45 min四個時間的表達均低于對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組內4個阻斷時間兩兩比較,對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),實驗組NO的表達水平隨阻斷時間的增長而降低,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表3)。

部位組別T1 T2 T3 T4 肺勻漿 實驗組 8425±1309? 9281±813?#11209±1034?#△12860±1079?#△▲對照組 5831±529 5856±424 5911±431 6014±501肺動脈血實驗組10774±1196?11943±1096?#14152±1324?#△15937±1239?#△▲對照組 6335±624 6541±542 6354±603 6405±527門靜脈血實驗組 8135±1569? 9358±939?#11310±1513?#△12359±960?#△▲對照組 5744±518 5952±434 5801±417 5814±511

與對照組比較,*P<0.05;實驗組組內比較:與T1比較,#P<0.05;與T2比較,△P<0.05;與T3比較,▲P<0.05

部位組別T1 T2 T3 T4 肺勻漿 實驗組 5129±874? 4209±975?# 3675±720?#△ 3245±499?#△▲對照組11633±157111743±124411911±143111743±1202肺動脈血實驗組 4483±996? 3668±794?# 3113±407?#△ 2808±463?#△▲對照組12348±142212543±131212634±138912568±1372門靜脈血實驗組 4391±807? 3453±741?# 3019±374?#△ 2579±486?#△▲對照組11479±112911647±121411379±108911539±1258

與對照組比較,*P<0.05;實驗組組內比較:與T1比較,#P<0.05;與T2比較,△P<0.05;與T3比較,▲P<0.05

2.5 TXB2表達水平

在肺組織勻漿、肺動脈血、門靜脈血中,實驗組TXB2在門靜脈和下腔靜脈阻斷0，15，30，45 min四個時間的表達均高于對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組內4個阻斷時間兩兩比較,對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),實驗組TXB2的表達水平隨阻斷時間的增長而增高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表4)。

2.6 HO-1表達水平

在肺組織勻漿、肺動脈血、門靜脈血中,實驗組HO-1在門靜脈和下腔靜脈阻斷0，15，30，45 min四個時間的表達均高于對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組內4個阻斷時間兩兩比較,對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),實驗組HO-1的表達水平隨阻斷時間的增長而增高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表5)。

部位組別T1 T2 T3 T4 肺勻漿 實驗組7020±811? 9826±976?#12743±761?#△14974±1010?#△▲對照組5248±794 5278±596 5314±647 5299±592肺動脈血實驗組7858±966? 9858±985?#13370±1143?#△16334±1287?#△▲對照組5863±682 5924±786 5968±861 5886±935門靜脈血實驗組9754±906?12704±1158?#15564±975?#△17454±1032?#△▲對照組6012±725 6213±824 6122±793 6318±875

與對照組比較,*P<0.05;實驗組組內比較:與T1比較,#P<0.05;與T2比較,△P<0.05;與T3比較,▲P<0.05

部位組別T1 T2 T3 T4 肺勻漿 實驗組3490±353?3877±234?#4671±337?#△5795±339?#△▲對照組 725±112 732±155 743±201 777±189肺動脈血實驗組3969±412?5001±350?#5866±463?#△6849±503?#△▲對照組 732±087 745±123 801±181 766±162門靜脈血實驗組3218±459?3895±398?#4560±306?#△5345±282?#△▲對照組 711±096 719±102 736±123 748±135

與對照組比較,*P<0.05;實驗組組內比較:與T1比較,#P<0.05;與T2比較,△P<0.05;與T3比較,▲P<0.05

3 討論

肺動脈高壓(PAH)是各種原因引起的靜息狀態(tài)下右心導管測得的肺動脈平均壓≥25 mmHg的一組臨床病理生理綜合征,由肺血管重塑引起肺循環(huán)血流動力學改變,最終可導致右心衰竭,甚至死亡[2]。能引起肺動脈高壓的病因很多,其中終末期肝病是引起肺動脈高壓的一個重要原因。終末期肝病PAH的出現(xiàn)對肝移植患者危害極大,術前主要表現(xiàn)為呼吸和肺交換功能障礙,PAH是肝移植圍術期高死亡率的主要原因之一。由于肝臟血管豐富,在行肝部分切除時,往往需要阻斷門靜脈甚至下腔靜脈來減少術中出血,目前國內外最常用的是Pringle法;而肝移植時則需要采用全肝血流阻斷的方法,即同時阻斷肝上和肝下腔靜脈,但這種方法易引起全身血流動力學不穩(wěn)定,同時引起內環(huán)境的劇烈變化,甚至其他遠隔器官如腎、肺等功能受損。有研究顯示門靜脈和肝后下腔靜脈阻斷與開放后,肺組織與肺動脈病理性損傷明顯加重[3]。目前的研究主要集中在門靜脈和下腔靜脈阻斷對肺組織病理生理、相關細胞因子等的改變,阻斷時間長短對肺組織細胞因子表達的影響的研究很少,而阻斷時間長短對外科手術具有重要的指導意義。因此,我們的實驗首先是建立PAH模型,然后阻斷門靜脈、肝上和肝下下腔靜脈,檢測相關指標,觀察不同阻斷時間對PAH大鼠血漿和肺組織中ET-1、NO、TXB2和HO-1表達的影響。

野百合堿在實驗室常用來建立肺動脈高壓動物模型,野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓的模型,其病理生理及作用特點與臨床患者PAH的形成機制類似,到目前為止,是一種比較理想的PAH模型造模選擇。通過查閱文獻,野百合堿的實驗劑量采用60 mg/kg[4]。本實驗實驗組測得的RVSP[(43.55±8.58)mmHg]和mPAP[(33.65±9.04)mmHg]明顯大于25 mmHg,符合PAH診斷,說明我們的模型建立成功。

在肺動脈高壓機制的研究中,目前認為血管內皮產生的局部活性介質是產生肺動脈高壓的一個重要因素,其中NO和ET-1、TXB2和PGI2是與肺動脈高壓關系密切的兩個平衡系統(tǒng)[5,6]。ET-1是目前認為活性最強的縮血管活性物質,能夠促進肺動脈平滑肌細胞的DNA合成與增殖;其受體有兩種亞型,ETA和ETB,前者位于外周小動脈,介導收縮,與細胞增殖有關,后者位于外周血管平滑肌細胞,促進NO和PGI2的釋放,介導血管舒張和抑制內皮素轉換酶表達[7]。TXB2和PGI2是花生四烯酸內環(huán)氧酶代謝途徑產生,前者具有強烈的血管收縮作用,后者具有強烈的擴張血管、抑制血小板聚集和抑制平滑肌增殖的作用,正常情況下,兩者處于動態(tài)平衡[8]。由于肺臟是ET/NO產生的重要地方,也是TXB2和PGI2合成的主要場所,當兩大系統(tǒng)失調時,即ET-1和TXB2的合成增多,NO和PGI2的合成減少時,可以導致PAH的形成[9]。因此,對于PAH大鼠NO和ET-1、TXB2和PGI2含量的測定,可以反映PAH的嚴重程度,作為本實驗分析的指標。本實驗中,實驗組ET-1和TXB2的含量升高,NO含量降低,這與心源性PAH中含量變化一致,再次驗證本實驗PAH模型成功,可以繼續(xù)進行下一步實驗。實驗組門靜脈和下腔靜脈阻斷時間越長,ET-1和TXB2的含量越高,NO含量越低,說明阻斷的時間越長,對圍術期產生PAH大鼠的影響越大,其后果也越嚴重。這可以提示我們對于PAH患者手術時,盡量縮短門靜脈和下腔靜脈的阻斷時間,對于術后PAH的治療和并發(fā)癥的預防,有很重要的意義。

HO-1是血紅素代謝限速酶,分布在多種組織和器官中,如心臟、肝臟、肺臟等部位,在應激狀態(tài)時表達量會顯著增多,具有抗凋亡、抗氧化及抗炎癥等活性,同時對細胞內和細胞間的信號傳導具有調節(jié)作用,細胞受到損傷后參與調節(jié)細胞自身穩(wěn)態(tài)的過程[10]。近幾年來,國內外學者越來越重視HO-1與PAH發(fā)生發(fā)展的關系,研究顯示HO-1及其代謝產物CO通過調節(jié)血管舒張以及抑制血管平滑肌細胞增殖等多種途徑參與PAH的形成[11,12]。本實驗中,PAH大鼠隨著門靜脈和下腔靜脈阻斷時間的延長,肺組織勻漿、肺動脈血和門靜脈血產生HO-1的含量是逐漸增多的,這提示我們,HO-1可以在一定程度上保護因阻斷時間延長而加重的PAH,這對于PAH患者術后的預防和治療有一定的指導意義。

綜上所述,門靜脈和下腔靜脈阻斷時間越長,PAH大鼠表達的ET-1、TXB2的含量越高,NO的含量越低,說明阻斷時間越長,對于PAH大鼠的危害越大;而HO-1也隨著阻斷時間的延長表達增加,對PAH大鼠可能具有一定保護作用。PAH患者進行門靜脈和下腔靜脈阻斷手術的過程復雜多樣,本實驗僅僅研究的是門靜脈和下腔靜脈阻斷時間與PAH的關系,還有沒有其他因素對PAH產生影響,有待于我們進一步研究。

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EffectofdifferentblockingtimeinportalveinandinferiorvenacavaonexpressionofET-1,NO,TXB2andHO-1inplasmaandlungtissueofpulmonaryarterialhypertensionrats

ZHOU Rongsheng, LIU Qingbo, YAN Fei, WANG Qiang, LI Xiaogang, LIU Qining*

(DepartmentofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;*Correspondingauthor,E-mail:lqnhhlqnhh@163.com)

ObjectiveTo investigatethe effect of different blocking time in portal vein and inferior vena cava on expression of ET-1,NO,TXB2and HO-1 in plasma and lung tissue of pulmonary arterial hypertension rats.MethodsEighty healthy and clean male SD rats were randomly assigned into experimental group and control group. The two groups were divided into four subgroups according to the blocking time of the portal vein and inferior vena cava: T1(0 min), T2(15 min), T3(30 min)，T4(45 min).The rats in experimental group were intraperitoneally injected with monocrotaline 60 mg/kg, while the rats in control group were injected with equal dose of normal saline.The right ventricular systolic pressure(RVSP) and average pulmonary artery pressure(mPAP) were measured using polystyrene tube via the right external carotid vein after treatment for three weeks. After laparotomy and anatomical exposure，the portal vein and inferior vena cava were blocked for 0, 15, 30, 45 min, respectively. Portal venous blood, pulmonary artery blood and lung tissue were taken after vessel opening. The expression of ET-1,NO,TXB2and HO-1 was detected by ELISA.ResultsCompared with control group, RVSP and mPAP were significantly increased in experimental group(P<0.05).The pulmonary hypertension model was established successfully. The expression of ET-1, TXB2and HO-1 in lung tissue homogenate, pulmonary artery and portal vein were significantly higher than those in control group at 0 min, 15 min, 30 min and 45 min after portal vein and inferior vena cava blocking, while the expression of NO in experimental group was lower than that in control group.There was no statistically significant difference in the expression of ET-1, NO, TXB2and HO-1 between four subgroups in control group(P>0.05).In experimental group, as the portal vein and inferior vena cava blocking time increased, the expression of ET-1, TXB2and HO-1 increased(P<0.05), while the expression of NO decreased(P<0.05).ConclusionWith the increase of blocking time in the portal vein and inferior vena cava, the expression of ET-1 and TXB2increases, the expression of NO decreases, and the risk of pulmonary hypertension in rats becomes greater. The expression of HO-1 also increases at the same time, which may have protective effect from pulmonary hypertension rats.

portal vein-inferior vena cava block; pulmonary hypertension; ET-1; NO; TXB2; HO-1

陜西省科技計劃項目(2006K14-G2-(9));西安交通大學第一附屬醫(yī)院青年創(chuàng)新基金資助項目(2014YK14);西安交通大學第一附屬醫(yī)院教學改革研究項目(17YB17)

周榮勝,男,1981-04-生,碩士,主治醫(yī)師,E-mail:zrs972@sina.com

2017-07-10

R544.1

A

1007-6611(2017)11-1124-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.008