梁潘霞，蘭 秀，劉永賢,*，潘麗萍，農(nóng)夢玲，邢 穎，廖 青，鹿士楊，陳錦平

(1. 廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧 530007； 2. 廣西大學，廣西 南寧 530005)

富硒大米硒蛋白提取方法研究

梁潘霞1，蘭 秀2，劉永賢1,2*，潘麗萍1，農(nóng)夢玲2，邢 穎1，廖 青1，鹿士楊1，陳錦平1

(1. 廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧 530007； 2. 廣西大學，廣西 南寧 530005)

【目的】優(yōu)選富硒大米，研究提取分離硒蛋白的最佳生產(chǎn)工藝條件，為提高硒蛋白資源的開發(fā)利用提供參考?！痉椒ā坎捎脡A提法提取硒蛋白，正交試驗法優(yōu)化大米硒蛋白的提取條件，采用考馬斯亮藍 G-250 試劑結(jié)合法測定蛋白含量，原子熒光法測定硒含量。以含硒蛋白質(zhì)及硒得率為指標，研究影響富硒大米中含硒蛋白質(zhì)提取的因素?！窘Y(jié)果】影響富硒大米含硒蛋白提取率的主次因素為：NaOH濃度 gt; 料液比 gt; 溫度 gt; 時間。富硒大米含硒蛋白提取的最佳工藝條件為提取溫度 50 ℃，堿液濃度0.14 mol/L，提取時間 5 h，料液比 1∶30，此條件下硒蛋白提取率為57.11 %?！窘Y(jié)論】采用正交試驗法優(yōu)化的堿提工藝可有效提高硒蛋白提取率，優(yōu)化的工藝參數(shù)可在實際生產(chǎn)中推廣應用。

富硒大米；硒蛋白；正交試驗；提取率

【研究意義】微量元素硒是人體必需的營養(yǎng)元素。 WHO調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，目前大約有10億人面臨著硒營養(yǎng)不良的問題，缺硒引起的“隱性饑餓”正威脅著人類健康[1]，科學合理的補硒已經(jīng)成為我們增強身體素質(zhì)的重要途徑。大米是我國的主要糧食之一，其可作為富硒的中間載體，提取出的大米蛋白可作為新型的富硒營養(yǎng)產(chǎn)品，具有較高的營養(yǎng)價值。研究開發(fā)利用富硒大米中的硒蛋白，將是一種解決國內(nèi)蛋白產(chǎn)業(yè)缺乏問題的新思路，對有效利用富硒大米的附加值有著現(xiàn)實意義。【前人研究進展】張濤[2]研究發(fā)現(xiàn)含硒蛋白是大米中硒的主要賦予形態(tài)，占總硒的73 %，含硒蛋白中谷蛋白硒占總硒48 %。方建軍等[3]研究發(fā)現(xiàn)富硒大米中總硒含量高達 206.71 μg/kg，有機硒是硒主要賦予形態(tài)，占總硒 81.70 %。堿溶性硒蛋白是有機硒的主要存在形式，占 53.40 %，多糖硒 9.28 %，RNA 硒占 1.86 %。 李甜[4]利用單因素及響應面分析法對新疆新春 36 號黑小麥中硒蛋白做系統(tǒng)考察，發(fā)現(xiàn)硒蛋白含量為(240.52 ± 0.3)mg/g，并摸索得到堿溶性硒蛋白提取條件為：NaOH 溶液濃度 0.17 mol/L，酸化 pH 4.7，(NH4)2SO4飽和度 66.0 %，料液比 1∶10，在此條件下得到的硒蛋白提取率為 76.7 %。王珺等[5]在采用反復凍融輔助富硒茶中硒蛋白提取工藝研究中表明：在堿液濃度 0.10 mol/L、提取時間 3 h、提取次數(shù) 2 次、溫度 70 ℃、料液比 1∶60 相同條件下，反復凍融 3 次的實驗組蛋白得率增長了 20 %。鄒秀容[6]在通過超聲波法提取米糠蛋白工藝研究中，確定最優(yōu)條件為：超聲時間 50 min、超聲功率 380 W、料液比 1∶16，其蛋白得率達到51.66 %。Gergely[7]使用 0.1 mol/L NaOH，30 mM 三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)與酶法從香菇中提取硒蛋白。【本研究切入點】目前植物蛋白的提取方法研究較多的是堿法、酶法以及復合提取法等，但是由于不同研究者原輔料工藝的采用和試驗環(huán)境等因素不盡相同，所得的研究結(jié)論也有所差異。此外，目前國內(nèi)關(guān)于富硒大米中硒蛋白的提取工藝、提取條件的優(yōu)化與確證方面鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究堿法提取富硒大米中硒蛋白的效果，獲得提取的最佳工藝條件，為提高硒蛋白資源的開發(fā)利用及為增加營養(yǎng)食品的附加值、多樣性、方便化作出有力的支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

富硒大米采自廣西巴馬白馬村，該地區(qū)土壤硒平均含量為 (0.43 ± 1.24) mg/kg，采用大田自然栽培，常規(guī)管理。采收后的大米置于鼓風干燥箱中60 ℃下烘干，粉碎機粉碎至全部通過100目篩孔，密封置于干燥器中備用。

1.2 主要儀器與試劑

AFS雙道原子熒光光度計，TDZ5-WS高速冷凍離心機，TD-5-A 離心機，ETHOS PLUS微波消解系統(tǒng)，紫外可見分光光度計，SHZ-88水浴恒溫震蕩器。NaOH、NaCl、HCl等主要試劑均為優(yōu)級純，實驗用水均為超純水。

1.3 試驗方案

1.3.1 富硒大米硒蛋白提取液的篩選及提取工藝 控制大米粉末與提取液料液質(zhì)量體積比為1∶20，分別用0.1 mol/L氯化鈉溶液、氫氧化鈉溶液、鹽酸溶液和水作為溶劑，常溫下震蕩提取3 h，25 ℃下4000 r/min 離心20 min，取一定上清液在冰浴下緩慢加入4 倍溶液體積冰丙酮于-24 ℃冰箱放置12 h 沉淀蛋白，4 ℃下10 000 r/min 離心15 min，倒掉上清液并在通風櫥讓丙酮揮發(fā)，得粗蛋白，測硒含量，選擇最佳溶劑。

1.3.2 單因素試驗 在得到最佳溶劑基礎上，利用該提取劑進行單因素實驗，分析不同料液質(zhì)量體積比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、NaOH濃度(0.02、0.05、0.08、0.10、0.14、0.20 mol/L )、溫度(20、30、40、50和60 ℃)、提取時間(1、2、3、4、5和6 h )對硒蛋白提取的影響規(guī)律。

1.3.3 正交試驗 參考單因素試驗結(jié)果，對料液比、NaOH 溶液濃度、提取溫度和提取時間四個因素進行 L9(34)正交試驗設計，通過L9(34) 正交試驗確定最佳的提取條件 。每個因素水平組合試驗重復3次。正交因素水平表見表1。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 硒含量測定 采用氫化物原子熒光光譜法，按照 GB/T 5009.93-2010[23]中的方法測定硒含量。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍 G-250 試劑比色法。AA800 紫外分光光度計595 nm 處測定吸光度值，用牛血清蛋白制作標準曲線，求曲線回歸方程，從而算出總蛋白質(zhì)含量。

1.4.3 硒得率的計算

其中,A為從大米中所提取出的蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，B為蛋白質(zhì)中硒的質(zhì)量分數(shù) ，C為大米中硒的質(zhì)量分數(shù)。

表1 正交因素水平

圖1 不同溶劑對硒得率的影響Fig.1 Effect of different solvents on selenium extraction yield

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003 和SPSS 17.0系統(tǒng)分析軟件對測定的各個指標數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

由圖1 可知，以硒得率為指標，NaOH 提取硒蛋白效果最好 , 硒得率為52.21 %，是水提取的7倍，四種提取劑提取硒蛋白效率從高到低為NaOH gt; NaCl gt; HCl gt; H2O，因此采取NaOH作為提取劑。

2.2 單因素試驗

在保持其他條件不變(提取液濃度為0.1 mol /L、提取溫度為常溫，提取時間3 h)，改變液料比，由圖2可知，隨著液料比的增大，大米蛋白質(zhì)提取率先升高后下降，液料比増加到1∶40 時，提取率達到最高值15.56 %，硒含量1.08 μg/g，而液料比從1∶50到1∶60，提取率急速下降。因此，1∶40 g/mL是單因素實驗優(yōu)化的最佳料液比。

2.3 提取時間對大米硒蛋白提取效果的影響

在保持其他條件不變(提取液濃度為 0.1 mol/L、提取溫度為常溫，液料比為 1∶20)，改變提取時間，大米硒蛋白提取率隨提取時間的變化如圖3所示。一定條件下，提取時間-提取率曲線呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在 4 h 時蛋白提取率達到峰值15.45

圖2 不同料液比對硒蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction rate of selenoproteins

圖3 提取時間對硒蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of selenoproteins

%；此時硒含量也達到最大 1.11 μg/g，提取時間超過 4 h后蛋白的提取率反而呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為蛋白質(zhì)分子溶脹導致溶出率降低。因此，4 h 是單因素實驗優(yōu)化的最佳提取時間。

2.4 提取溫度對大米蛋白提取效果的影響

在保持其他條件不變(提取液濃度為0.1 mol /L、提取時間3 h，液料比為1∶20)，改變提取溫度，由圖4可知，當提取溫度在20 ℃ 升高到40 ℃ 時，大米蛋白提取率隨著溫度的升高而增加，40 ℃時達到最大，增幅為20 ℃的10.07 %；隨著提取溫度的進一步上升，提取率反而呈下降趨勢。因此，確定單因素實驗優(yōu)化硒蛋白的提取最佳溫度為40 ℃。

2.5 堿液濃度對大米蛋白提取率效果的影響

在保持其他條件不變(提取時間3 h、提取溫度為常溫，液料比為1∶20)，改變提取液濃度，由圖5可知，大米硒蛋白提取率隨提取液濃度的升高而緩慢提高后快速下降，在濃度為0.02 ～ 0.08 mol/L范圍內(nèi)，提取率變化不大，在0.08 ～ 0.14 mol/L范圍時，提取率變化顯著，在0.14 mol/L是提取率達到最高值28.07 %，堿液濃度為0.2 mol/L時，提取率最低。因此，堿液濃度0.14 mol/L是單因素實驗優(yōu)化的最佳提取液濃度。

圖4 提取溫度對硒蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of selenoproteins

圖5 堿液濃度對硒蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of alkali concentration on the extraction rate of selenoproteins

試驗號NumberA.料液比(g/mL)Solid-liquidratioB.氫氧化鈉濃度(mol/L)ConcentrationC.溫度(℃)TemperatureD.時間(h)Time提取率(%)Extractionrate11∶300.0830344.85±3.521∶300.140452.78±4.831∶300.1450557.11±2.741∶400.0830526.82±3.351∶400.140345.52±5.161∶400.1450441.68±4.271∶500.0830434.76±3.681∶500.140546.45±4.391∶500.1450355.73±2.9K151.5835.4845.6048.70-K23848.2545.1144.35-K345.6251.5145.8043.46-R7.079.5276.23-

注：表中數(shù)據(jù)為 3 次重復平均值±標準誤差；K-各因素水平的平均蛋白提取率，R-各因素水平平均蛋白提取率極差。

Note:Values are means of three determinations ± standard deviation;Krepresents the average extraction rate of protein;Rvalue means range between average extraction rate of protein.

2.6 正交試驗結(jié)果

由表2中的極差R值可以看出，氫氧化鈉濃度是影響提取率的最主要因素，其次為料液比，浸提溫度和浸提時間對提取率影響較小。組合 A1B3C3D3提取率最高，即料液比 1∶30 g/mL、氫氧化鈉濃度0.14 mol/L、提取溫度 50 ℃、提取時間 5 h，此條件下提取率為 57.11 %。

3 討 論

本研究中的最佳的提取劑為NaOH溶液，這與前人的研究結(jié)果一致[8]。這可能與大米中的氫鍵、酰胺鍵和二硫鍵在高濃度堿條件下水解，進而釋放更多的蛋白質(zhì)有關(guān)[9-11]。Fang 等[12]研究表明，通過提取大米中4 類蛋白，分析蛋白中硒的含量，發(fā)現(xiàn)硒主要存在于堿溶谷蛋白中。胡秋輝等[13]研究表明，清蛋白和醇溶蛋白并不是硒的主要存在蛋白，Se主要存在于分子量較大的堿溶谷蛋白和球蛋白中，且堿溶含硒蛋白為主要組分。張帥等[14]的研究也表明，堿提法工藝成本低，提取率高、提取方法簡單。

在獲得最佳提取劑的基礎上，以提取劑濃度、料液比、提取時間和提取溫度進行單因素試驗，硒蛋白提取率開始隨著堿液濃度的增大而明顯增大，但在0.14 mol/L后開始下降。這與彭煒[8]的研究結(jié)果有相似之處。這可能是因為溶液pH值可以直接改變兩性分子蛋白質(zhì)的表面所帶電荷，進而對蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與溶劑間的相互作用造成影響，從而改變蛋白質(zhì)的溶解性。有研究表明，蛋白質(zhì)溶解度在pH 大于7時顯著升高，在pH 大于12 時，90 %以上的蛋白質(zhì)可溶出[15]。堿法提取條件不同時蛋白提取率結(jié)果就會不同，有研究表明，提取蛋白時，提取液濃度不宜過高，否則會導致蛋白質(zhì)中賴氨酸與丙氨酸或胱氨酸發(fā)生縮合反應[16]，蛋白質(zhì)難以溶出，降低蛋白質(zhì)的純度和品質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值與商用價值，導致提取率的下降[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)提取率隨著料液比增大而增大，但在一定比例后開始下降。這與曹斌[18]在用堿法提取恩施碎米薺時的試驗結(jié)果一致。這可能是因為提取溶劑在料液比較低時粘度大，蛋白濃度較高，蛋白質(zhì)分子間的斥力大，蛋白質(zhì)的擴散作用小，因此提取速率較低。隨著料液比的增加，提取溶劑粘度下降、分子間的斥力減小，蛋白質(zhì)的擴散作用變大，并不斷溶出，提取率則不斷上升。然而當料液比繼續(xù)增大時，提取率不升反降，原因可能是高的料液比增大了提取難度，造成了提取率的下降。

本研究提取溫度單因素試驗結(jié)果表明，在提取溫度大于40 ℃以后，提取率開始下降。有研究表明，隨著的溫度的增高，蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展，增大了其與水分子的相互作用，且分子的擴散作用隨著溫度的增高而增高，加快了蛋白質(zhì)的溶解速率，但增加到一定溫度時，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)被破壞，其疏水集團暴露，導致蛋白質(zhì)的溶解度下降，提取率降低[19-21]。呂佼[24]在對板栗蛋白提取工藝優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，板栗蛋白提取率隨著溫度的升高而降低，這可能是由于板栗淀粉發(fā)生糊化作用，與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)溶解率下降，從而降低蛋白質(zhì)的提取率。在提取時間1～4 h范圍內(nèi)，硒蛋白提取率隨著提取時間的增加而增加，這可能是因為與硒結(jié)合能力強的蛋白質(zhì)不斷溶解有關(guān)[22]。 當提取時間超過4 h時，蛋白的提取率反而呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為蛋白質(zhì)分子溶脹導致溶出率降低。

參考單因素試驗結(jié)果，對料液比、NaOH 溶液濃度、提取溫度和提取時間四個因素進行 L9(34)正交試驗，發(fā)現(xiàn) 9個組合的蛋白提取率均比單因素試驗高，那是因為多因素實驗中， 每個因素都不是單獨發(fā)揮作用，因素間存在相互作用，具有強烈的搭配效果。通過比較極差R值大小，得到各因素對提取率的影響大小為NaOH濃度 gt; 料液比 gt; 提取溫度 gt; 提取時間。最后方差分析得到的最佳提取條件A1B3C3D3。

雖然堿提取法具有成本低廉、易于操作和控制的優(yōu)點，但是需要較長的提取的時間，提取效果也未達到最佳。因此，還可通過復合法提取法，例如加入超聲波輔助提取、堿法與酶法結(jié)合，或采用微射流輔助法來提高硒蛋白提取率。廣西硒資源十分豐富，隨著對大米硒蛋白更深入的研究，包括提取硒蛋白的工藝、硒蛋白基礎理論特性及功能和利用價值等方面，大米硒蛋白將有望廣泛地應用于營養(yǎng)保健、醫(yī)療和食品行業(yè)上，這不僅能節(jié)約資源，而且能為豐富大米資源的開發(fā)利用開辟新的思路，使大米得到深層次的開發(fā)與應用，將資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟優(yōu)勢具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

4 結(jié) 論

影響富硒大米含硒蛋白提取率的主次因素為：NaOH濃度 gt; 料液比 gt; 溫度 gt; 時間，富硒大米含硒蛋白提取的最佳工藝條件為提取溫度 50 ℃，堿液濃度0.14 mol/L，提取時間5 h，料液比 1∶30。采用正交試驗法優(yōu)化的堿提工藝可有效提高硒蛋白提取率，優(yōu)化的工藝參數(shù)可在實際生產(chǎn)中推廣應用。

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(責任編輯 韋 冪)

StudyonExtractionMethodofSe-enrichedRice

LIANG Pan-xia1, LAN Xiu2, LIU Yong-xian1,2*, PAN Li-ping1, NONG Meng-ling2,XING Ying1, LIAO Qing1，LU Shi-yang1，CHEN Jin-ping1

(1.Resources and Environment Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007, China；2.Guangxi University，Guangxi Nanning 530007, China)

【Objective】 The study aims to optimize the extraction process of selenoproteins from selenium-enriched rice in Guangxi and provide reference for the exploitation and utilization of selenium protein resources. 【Method】Selenium-enriched rice was used as materials to extract selenoproteins by alkali extraction method and to optimize the extraction process of selenoproteins by using the orthogonal experiment. Proteins and selenium content were measured by coomassie brilliant blue G-250 reagent and AFS (atomic fluorescence spectrometry) respectively.【Result】The most significant factor affecting extraction of rice selenoproteins was sodium hydroxide concentration , followed by the ratio of solid-liquid, temperature and then extraction time. The optimum extraction conditions of rice selenoproteins: extraction temperature was 50 ℃, sodium hydroxide concentration was 0.14 mol/L, extraction time was 5h, and the ratio of solid-liquid was 1∶30.【Conclusion】The alkali extraction process optimized by orthogonal test can effectively improve the extraction rate of selenium protein, and the optimized process parameters can be popularized and applied in practical production.

Selenium-enriched rice；Selenoproteins；Orthogonal experiment；Extraction efficiency

S38

A

1001-4829(2017)11-2474-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.014

2017-05-25

廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(桂科合415104 001-22)；廣西農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務專項資助項目(桂農(nóng)科2017YZ03)；廣西重點研發(fā)計劃(桂科AB16380088)；廣西富硒特色作物試驗站(桂TS2016011)；南寧市青秀區(qū)重點研發(fā)計劃(2016039)；廣西農(nóng)業(yè)科學院科技成果轉(zhuǎn)化項目(2017NZ04)

梁潘霞(1979-)，女，廣西邕寧人，博士，助理研究員，主要從事土壤環(huán)境生態(tài)、植物生理生化和生物技術(shù)研究，E-mail：lpx831@163. com,*為通訊作者，劉永賢，E-mail：liuyx27@163.com。