劉艷玲，向鳳寧

(1.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院信息工程系，山東 萊蕪 271100；2.山東大學(xué)生命科學(xué)院植物細(xì)胞工程與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS2的載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

劉艷玲1，向鳳寧2

(1.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院信息工程系，山東 萊蕪 271100；2.山東大學(xué)生命科學(xué)院植物細(xì)胞工程與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

【目的】本文擬進(jìn)行麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS2的載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化?！痉椒ā?首先利用gateway方法進(jìn)行GsAS2的RNAi載體(pK7GWIWG-GsAS2)和過表達(dá)載體(pK7WG2D-GsAS2)的構(gòu)建，并利用基因槍轉(zhuǎn)化麻花艽胚性愈傷組織，經(jīng)卡那霉素(Kan)篩選后，進(jìn)一步用35S啟動(dòng)子引物進(jìn)行抗性植株總DNA的PCR檢測。【結(jié)果】獲得GsAS2的RNAi陽性植株5株，過表達(dá)植株8株，轉(zhuǎn)化頻率分別為2.94 %和4.00 %。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GsAS2的半定量RT-PCR分析和齊墩果酸的HPLC測定表明：GsAS2的表達(dá)在RNAi系中受到較大抑制，其齊墩果酸含量均低于對(duì)照(為對(duì)照的48.5 %～80.7 %)，而在過表達(dá)系中GsAS2則超量表達(dá)，且齊墩果酸含量均高于對(duì)照(為對(duì)照的1.67～2.46倍)?！窘Y(jié)論】說明GsAS2的表達(dá)與下游產(chǎn)物齊墩果酸的含量關(guān)系密切。

麻花艽；β-amyrin合成酶基因；載體構(gòu)建；遺傳轉(zhuǎn)化

【研究意義】隨著基因工程技術(shù)的不斷完善，應(yīng)用分子克隆和遺傳轉(zhuǎn)化手段對(duì)植物細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行修飾和改造來積累目標(biāo)產(chǎn)物已成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[1-2]。【前人研究進(jìn)展】目前，通過超量表達(dá)代謝途徑中的限速酶基因來提高目標(biāo)產(chǎn)物含量已成為植物代謝工程的主要方法之一[3-5]。Yun等在顛茄中引入編碼莨菪堿-6β-羥化酶基因，結(jié)果使顛茄中含量很低的東莨菪堿大量積累，并且?guī)缀跛械妮馆袎A都轉(zhuǎn)化成了東莨菪堿[6]；Shim等在人參中過量表達(dá)SQS基因，測得轉(zhuǎn)基因植物中人參皂甙的含量為對(duì)照的2.5倍[7]。因此目前較好的方法就是用已獲得的有用基因建立起簡單的轉(zhuǎn)基因系來研究次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因及與目標(biāo)產(chǎn)物的關(guān)系。麻花艽(GentianastromineaMaxim.)系龍膽科(Gentianaceae)、龍膽屬(Gentiana)植物，是我國重要的傳統(tǒng)中藥材之一，主要有效成分為熊果酸、齊墩果酸、獐牙菜苷等，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、黃膽性肝炎、膽結(jié)石等疾病[8-11]。其中齊墩果酸為抗肝炎的有效成分，其合成的前體物是β-amyrin。研究表明，β-amyrin合成酶為氧化角鯊烯環(huán)化酶(OSCs)家族的一員，是合成β-amyrin及其下游產(chǎn)物齊墩果酸的關(guān)鍵酶之一[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前面的研究中，已經(jīng)克隆獲得了β-amyrin合成酶基因GsAS2的全長序列并進(jìn)行了功能驗(yàn)證[14]，本研究中，擬實(shí)現(xiàn)GsAS2對(duì)麻花艽愈傷組織的轉(zhuǎn)化，從而獲得GsAS2 RNAi系和過表達(dá)系的再生植株，分析陽性植株中GsAS2的表達(dá)量與齊墩果酸含量的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為齊墩果酸代謝途徑的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

1.1.1 載體 pDONR為入門載體，pK7GWIWG為RNAi載體，pK7WG2D為過表達(dá)載體。

1.1.2 PCR反應(yīng)引物 P1：5′-AAAAAGCAGGCTTCATTCTTTACGCAGAGCCG-3′；P2：5′-AGAAAGC TGGGTCATCGTGCTGTGACCTTCTAT-3′； P3：5′-AA AAAGCAGGCTCGATGTGGAGGCTGAAGATCG-3′；P4：5′-AGAAAGCTGGGTCCGTCTCTCAAATCTTCAA GATGGCAA-3′。

1.1.3 BP反應(yīng) 反應(yīng)體系：二次PCR產(chǎn)物(40～100 fmol) 3.5 μl，pDONRTMvector (150 ng/μl) 0.5 μl，BP ClonaseTMenzyme mixture 1 μl，25 ℃水浴8 h。

1.1.4 LR反應(yīng) 反應(yīng)體系：BP產(chǎn)物(40～100 fmol) 3.5 μl，Destination vector (150 ng/μl) 0.5 μl，BP ClonaseTMenzyme mixture 1 μl，25 ℃水浴8 h。

1.2 遺傳轉(zhuǎn)化

1.2.1 基因槍轉(zhuǎn)化方法 在轉(zhuǎn)化之前將麻花艽愈傷組織轉(zhuǎn)至含有高滲培養(yǎng)基(MS+0.4 mol/L甘露醇)的培養(yǎng)皿中心2 cm2范圍內(nèi)；基因槍為PDS-1000/He型，氣壓1100 psi；微彈制作過程參照Becker等[15]方法。轟擊的微彈量為2912 μg/g。

1.2.2 再生陽性植株篩選 轟擊后16 h 將胚性愈傷組織移至含150 mg/L卡那霉素的IB培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代篩選，然后在不含抗生素的IB培養(yǎng)基上分化出綠色再生植株。以CTAB法提取再生植株DNA，PCR擴(kuò)增35S啟動(dòng)子片段，篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。

1.3 齊墩果酸的HPLC測定

1.3.1 儀器與試劑 LC-10AD型高效液相色譜儀(日本島津公司)，齊墩果酸對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 分別取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品3、6、9、12、15 μl進(jìn)樣，以峰面積為橫坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)作圖，得到回歸方程：y=0.0016x-180.44(R=0.0093)。表明齊墩果酸進(jìn)樣量在200～1000 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNAi和過表達(dá)載體構(gòu)建

采用gateway方法來構(gòu)建麻花艽GsAS2基因載體。RNAi載體構(gòu)建，首先要進(jìn)行2次PCR反應(yīng)，第一次以P1、P2為引物，pMD18T-GsAS2質(zhì)粒為模板進(jìn)行(圖1A)；第二次以attB1和attB2為引物、一次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行(圖1B)，然后經(jīng)過BP反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并通過菌體PCR篩選獲得陽性質(zhì)粒pDONR-GsAS2(圖1C)，最后進(jìn)行LR反應(yīng)，獲得pK7G-GsAS2陽性質(zhì)粒(圖1D)，通過測序證明GsAS2的RNAi載體構(gòu)建成功。

對(duì)于過表達(dá)載體構(gòu)建，也是首先進(jìn)行2次PCR反應(yīng)，第一次以P3、P4為引物、pMD18T-GsAS2質(zhì)粒為模板進(jìn)行(圖2A)，第二次以attB1和attB2為引物、一次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行(圖2B)，然后經(jīng)過BP反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，通過菌體PCR篩選獲得陽性質(zhì)粒pDONR-GsAS2(圖2C)，最后進(jìn)行LR反應(yīng)，獲得pK7W-GsAS2陽性質(zhì)粒(圖2D)，通過測序證明GsAS2的過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A.GsAS2基因片段的一次PCR結(jié)果圖；B. GsAS2基因片段的二次PCR結(jié)果圖；C. BP反應(yīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后pDONR-GsAS2的菌體PCR驗(yàn)證；D. LR反應(yīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后pK7G-GsAS2片段的菌體PCR驗(yàn)證A.The first PCR of GsAS2 fragment; B. The second PCR of GsAS2 fragment; C. Thalli PCR verification of pDONR-GsAS2 fragment after BP reaction; D. Thalli PCR verification of pK7G-GsAS2 fragment after LR reaction圖1 麻花艽GsAS2 RNAi載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of RNAi vector for G. strominea gene GsAS2

A.GsAS2基因片段的一次PCR結(jié)果圖；B. GsAS2片段的二次PCR結(jié)果圖；C.BP反應(yīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后pDONR-GsAS2的菌體PCR驗(yàn)證；D. LR反應(yīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后pK7W-GsAS2 的菌體PCR驗(yàn)證A.The first PCR of GsAS2 fragment; B. The second PCR of GsAS2 fragment; C. Thalli PCR verification of GsAS2 after BP reaction;D. Thalli PCR verification of GsAS2 fragment after LR reaction圖2 麻花艽GsAS2 過表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of overexpression vector for G. strominea gene GsAS2

2.2 麻花艽的遺傳轉(zhuǎn)化

選取具有胚性的麻花艽愈傷組織作為轉(zhuǎn)基因植物材料，置于培養(yǎng)皿中用于pK7G-GsAS2和pK7W-GsAS2的基因槍轉(zhuǎn)化?；驑屴Z擊后，先將麻花艽愈傷組織暗培養(yǎng)24 h，然后轉(zhuǎn)接于B1培養(yǎng)基(含有150 mg/L卡那霉素)上，根據(jù)其生長情況留下黃綠色部分，剔除黑褐色部分，從而篩選出抗性愈傷組織。而后再轉(zhuǎn)接于IB培養(yǎng)基(不含卡那霉素)進(jìn)行苗的分化培養(yǎng)，經(jīng)過多次繼代待幼苗長出后，使用25 mg/L的卡那霉素進(jìn)一步來篩選抗性植株，最終得到RNAi系植株21株、過表達(dá)系植株34株(圖3，表1)。用35S啟動(dòng)子引物對(duì)抗性植株總DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明，pK7G-GsAS2 RNAi系的陽性植株為5株，轉(zhuǎn)化率為2.94 %；pK7W-GsAS2過表達(dá)系的陽性植株為8株，轉(zhuǎn)化率為4.00 %(圖4，表1)。

A～D. pK7G-GsAS2遺傳轉(zhuǎn)化過程；E-H. pK7W-GsAS2遺傳轉(zhuǎn)化過程；A、E. 轉(zhuǎn)化前愈傷組織；B、F. 遺傳轉(zhuǎn)化; C、G. 抗性愈傷組織的篩選; D、F. 陽性再生植株A-D. pK7G-GsAS2 genetic transformation；E-H. pK7W-GsAS2 genetic transformation；A,E. The calli before transformation；B,F. Genetic transformation; C，G. Selection of kan-resistant calli; D，F(xiàn). Positive plants圖3 麻花艽愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.3 The transformation of G.strominea calli

A. pK7G-GsAS2轉(zhuǎn)基因抗性植株的PCR結(jié)果(1～5:陽性植株)；B. pK7W-GsAS2轉(zhuǎn)基因抗性植株的PCR結(jié)果(1～5:陽性植株)A. PCR result from resistant plants of pK7G-GsAS2 transformation (1-5:Positive plants); B. PCR result from resistant plants of pK7W-GsAS2 transformation (1-5:Positive plants)圖4 抗性植株的PCR檢測Fig.4 PCR result from transformation resistant plants

圖5 轉(zhuǎn)基因陽性植株GsAS2的半定量RT-PCRFig.5 RT-PCR of GsAS2 for positive plants of pK7G-GsAS2 and pK7W-GsAS2 transformation

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測

2.3.1 轉(zhuǎn)基因麻花艽GsAS2的RT-PCR分析 分別選取5株pK7G-GsAS2和pK7W-GsAS2的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS2的RT-PCR分析(圖5)，在RNAi系轉(zhuǎn)基因植株中，GsAS2的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照，而在過表達(dá)系轉(zhuǎn)基因植株中，其表達(dá)量均明顯高于對(duì)照，說明GsAS2的表達(dá)在RNAi系中受到較大抑制，而在過表達(dá)系中則超量表達(dá)。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的齊墩果酸含量分析 對(duì)上述選取的10株轉(zhuǎn)基因麻花艽進(jìn)行齊墩果酸的HPLC分析。如圖6所示，RNAi系中的5株轉(zhuǎn)基因麻花艽的齊墩果酸含量均低于對(duì)照(為對(duì)照的48.5 %～80.7 %)，而過表達(dá)系中的5株轉(zhuǎn)基因麻花艽的齊墩果酸含量均高于對(duì)照(為對(duì)照的1.67～2.46倍)。由此可見，可以通過抑制或促進(jìn)GsAS2的表達(dá)來降低或提高齊墩果酸的合成，且抑制和促進(jìn)的程度與齊墩果酸的含量呈正相關(guān)。

3 討 論

萜類化合物是目前最大的一類植物次級(jí)代謝物，近幾年，有關(guān)萜類的代謝工程研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，從人參[7]、擬南芥[16-17]、豌豆[18]等植物中分離和克隆了許多OSCs基因，但是，有關(guān)OSCs基因的研究多局限在通過酵母表達(dá)體系來鑒定其生化功能，而在植物體中所參與代謝途徑的解析及生物學(xué)功能的研究還非常少[19-20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)OSCs基因家族成員β-amyrin合成酶基因GsAS2進(jìn)行了植物表達(dá)載體的構(gòu)建，獲得了GsAS2的RNAi系和過表達(dá)系，并通過轉(zhuǎn)化麻花艽胚性愈傷組織，篩選得到了陽性植株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNAi系中GsAS2基因表達(dá)量明顯下降，且其下游產(chǎn)物齊墩果酸含量也很低；而過表達(dá)系中，GsAS2基因表達(dá)量明顯上升，且齊墩果酸含量也大幅升高，二者具有很好的相關(guān)性。這為齊墩果酸代謝途徑的深入研究打下了良好的基礎(chǔ)。

WT:野生型；R:RNAi系；E：過表達(dá)系WT: Wild type; R: RNAi lines; E: Over-expression lines圖6 轉(zhuǎn)基因陽性植株的齊墩果酸含量分析Fig.6 Oleanolic acid content of transgenic plants

植物次生代謝是一個(gè)龐大的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，中間涉及多條代謝途徑及參與這些途徑的基因和酶。目前我們掌握的信息還非常少，僅局限在鑒定和克隆少數(shù)幾個(gè)基因上，在齊墩果酸合成過程中，除β-amyrin合成酶基因外是否還有其它關(guān)鍵酶基因或旁支途徑影響其代謝還不得而知，因此要想全面探明影響齊墩果酸代謝的各種酶、各基因及各途徑的相互關(guān)系將是一個(gè)非常艱巨和長期的任務(wù)，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過進(jìn)行麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS2的載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化，獲得GsAS2的RNAi陽性植株5株，過表達(dá)植株8株，轉(zhuǎn)化頻率分別為2.94 %和4.00 %。且GsAS2的表達(dá)在RNAi系中受到較大抑制，其齊墩果酸含量均低于對(duì)照(為對(duì)照的48.5 %～80.7 %)，而在過表達(dá)系中GsAS2則超量表達(dá)，齊墩果酸含量均高于對(duì)照(為對(duì)照的1.67～2.46倍)。說明GsAS2的表達(dá)與下游產(chǎn)物齊墩果酸的含量關(guān)系非常密切。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

ConstructionandTransformationofβ-amyrinSynthaseGeneGsAS2VectorinGentianastramineaMaxim.

LIU Yan-ling1, XIANG Feng-ning2

(1.Biotechnology Institute, Laiwu College for Vocational Technology, Shandong Laiwu 271100,China; 2. Key Laboratory of Plant Cell Engineering and Germplasm Innovation, Ministry of Education, School of Life Sciences, Shandong University,Shandong Jinan 250100, China)

【Objective】Construction and transformation of β-amyrin synthase geneGsAS2 vector inGentianastramineaMaxim. was done in this subject. 【Method】Plant RNAi vector (pK7GWIWG-GsAS2) and overexpression vector (pK7WG2D-GsAS2) were constructed using gateway technique and transferred into callus ofG.Stramineaby particle gun. Resistant lines were gained by selecting in the culture medium with 150 mg/L kanamycin. 35S promoter primers were used to amplify a fragment ofGsAS2 from genome of resistant plants. 【Result】 The transformation rate was caculated (GsAS2 RNAi lines 2.94 %,GsAS2 overexpression lines 4.00%). The results of RT-PCR and HPLC analysis for transgenic plants showed that in RNAi lines the expression ofGsAS2 was suppressed and the plants had lower oleanolic acid, whereas in overexpression lines the expression ofGsAS2 was promoted and the plants accumulated more oleanolic acid. 【Conclusion】All this showed there was close relationship between the expression ofGsAS2 and the content of oleanolic acid.

GentianastromineaMaxim.; β-amyrin synthase geneGsAS2; Vector construction; Genetic transformation

Q81

A

1001-4829(2017)11-2444-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.009

2016-12-23

萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金(2015bsky01)

劉艷玲(1977-)，女，黑龍江北安人，博士研究生，主要研究方向：中藥材次生代謝，E-mail：lyling9030@163.com，Tel:13376343556。