徐 磊，胡小文，姚艷麗，邢淑蓮，劉 洋

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實驗站 廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524013)

甜高粱WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達(dá)分析

徐 磊，胡小文，姚艷麗，邢淑蓮，劉 洋*

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實驗站 廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524013)

【目的】克隆甜高粱WRKY基因，分析其序列特征和表達(dá)譜，為甜高粱抗旱育種提供基因來源?！痉椒ā恳蕴鸶吡黄贩NM81-E幼苗總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)克隆甜高粱WRKY基因，通過生物信息學(xué)軟件分析其序列特征，采用實時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)情況，獲得2條WRKY基因，命名為SbWRKY1(Genebank 登錄號：KY231904)和SbWRKY2(Genebank 登錄號：KY231905)。【結(jié)果】SbWRKY1 cDNA序列全長1086 bp，包括1個1059 bp的開放閱讀框，編碼352個氨基酸。SbWRKY2 cDNA序列全長750 bp，包括1個717 bp的開放閱讀框，編碼238個氨基酸。2個基因編碼的蛋白均具有WRKY核心序列“WRKYGQK”和“C-X4-5-C-X22-23 -H-X1-H”鋅指結(jié)構(gòu)模型。SbWRKY1蛋白分子式為C1628H2619N509O504S16，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為37.89 kDa，等電點(diǎn)(PI)為9.78。SbWRKY2蛋白分子式為C1131H1752N326O344S21，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為26.09 kDa，等電點(diǎn)(PI)為8.43。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，SbWRKY1蛋白與高粱、玉米和谷子WRKY蛋白親緣關(guān)系較近，SbWRKY2蛋白與高粱、芒草和玉米WRKY蛋白親緣關(guān)系較近。熒光定量PCR分析表明，隨著干旱脅迫時間延長，SbWRKY1和SbWRKY2呈上調(diào)表達(dá)趨勢?！窘Y(jié)論】SbWRKY1和SbWRKY2基因可能在甜高粱應(yīng)對干旱脅迫中發(fā)揮一定作用。

甜高粱；轉(zhuǎn)錄因子；WRKY；RT-PCR

【研究意義】轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)又稱反式作用因子，它能激活或抑制相關(guān)基因表達(dá)，通過這一轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，植物可以應(yīng)對各種生物及非生物脅迫[1]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子DNA保守結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，可以將其分成若干個家族，如AP2/EREBP、MADS、bZIP和MYB等[2]。WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子是植物中一類較大的基因家族，所有WRKY蛋白都包含1～2個保守WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有約60個氨基酸序列，N端主要由“WRKYGQK”核心序列組成，C端序列為“C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H或C-X7-C-X23-H-X1-C”類型的鋅指結(jié)構(gòu)[3-4]。根據(jù)WRKY基因分類標(biāo)準(zhǔn)，該類轉(zhuǎn)錄因子可分為是I型、II型和III型。I型有個2個WRKY結(jié)構(gòu)域，分別位于N端和C端，其鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2；II型和III型各含有1個保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，II型鋅指類型為C2H2，III型鋅指結(jié)構(gòu)類型則為C2HC[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在植物中，自1994年從甘薯中克隆第一個WRKY基因以來[6]，針對WRKY轉(zhuǎn)錄因子已有較多研究報道，在WRKY全基因組鑒定[7]、生物[8]及非生物脅迫[9]表達(dá)特征分析和轉(zhuǎn)基因功能驗證[10]等方面開展研究。擬南芥中有68 %的AtWRKYs響應(yīng)SA處理或丁香假單胞菌侵染[11]。棉花GhWRKY3不僅在ABA、SA、MeJA、GAs和ET多種激素處理后上調(diào)表達(dá)，而且在立枯絲核菌、棉花炭疽病菌和棉花枯萎病菌侵染后增強(qiáng)表達(dá)，同時該基因能夠被干旱、高鹽和冷害脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[12]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有多種生物學(xué)功能，在植物發(fā)生長發(fā)育、抗病反應(yīng)、激素誘導(dǎo)和環(huán)境脅迫等進(jìn)程中發(fā)揮作用[13]。甜高粱起源于非洲，是粒用高粱的一個變種，生物量大、含糖量高，是優(yōu)質(zhì)的飼料作物和能源作物。它具有耐旱、耐鹽堿和耐貧瘠等多種特性[14]。而高粱基因組小(750 Mbp)，是禾本科作物中抗旱性研究的優(yōu)良模式植物[15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】高粱基因組測序已于2009年完成，但有關(guān)高粱WRKY基因的研究鮮有報道，本研究以甜高粱品種M81-E為試材，通過同源克隆獲得甜高粱的WRKY基因，并研究基因在干旱脅迫處理條件下的表達(dá)模式?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為甜高粱WRKY基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甜高粱品種：M81-E，由本實驗室保存。試劑：Trans2K Plus DNA Marker、Easy Pure Plant RNA kit、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、2x EasyTaqPCR SuperMix、pEASY-T1 Cloning Kit、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞和TransStart Green qPCR Super Mix均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 高粱苗期脅迫處理

M81-E種子用5 % NaClO溶液消毒，無菌水沖洗3次，種植于溫室，以0.5×Hoagland營養(yǎng)液水培，每3 d更換1次營養(yǎng)液，待生長至3葉1心時，用含20 % PEG6000的營養(yǎng)液進(jìn)行干旱脅迫處理，分別于0、1和24 h收集全株植物，用錫箔紙包裹后放入液氮冷凍處理20 min，然后迅速放入-80 ℃冰箱保存。

1.3 基因克隆策略

分別以玉米ZmWRKY21蛋白氨基酸序列(NP_001147091.1)和谷子SiWRKY64蛋白氨基酸序列(XP_004978524.1)在Phytozome V11.0網(wǎng)站通過Blast獲得高粱基因的cDNA序列和編碼蛋白序列。進(jìn)一步通過SMART(http://smart.embl-heidelberg. de/)在線預(yù)測蛋白是否包含WRKY結(jié)構(gòu)域。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

按照RNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行總RNA提取，提取的總RNA經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，以檢測合格的總RNA為模板，按照cDNA第1鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈，用于基因克隆試驗和qRT-PCR試驗。

1.5 引物設(shè)計和RT-PCR克隆

為克隆全長cDNA序列，使用Primer 3引物設(shè)計工具(http://primer3.ut.ee)在基因的完整閱讀框兩側(cè)設(shè)計巢式引物(表1)。實驗步驟、PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序參考徐磊的方法[16]并稍作修改，具體如下：引物C1用于第1輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物C2用于第2輪PCR反應(yīng)。以cDNA為模板擴(kuò)增基因的ORF(Open reading frame，ORF)；反應(yīng)體系(10 μl)：cDNA 1 μl，上游引物、下游引物各0.5 μl，2× EasyTaqPCR Super Mix 5 μl，補(bǔ)ddH2O至10 μl；PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共34個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標(biāo)PCR條帶經(jīng)膠回收、純化后與PEASY-T1載體連接，然后熱擊Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，恢復(fù)培養(yǎng)后涂氨芐平板于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆搖菌后送上海美吉生物公司測序。

1.6 序列的生物信息學(xué)分析

ORF和氨基酸序列分析利用NCBI ORF Finder程序；采用Protparam在線軟件分析蛋白理化性質(zhì)；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用在線SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫；利用NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；多序列比對使用Clustal X 2.1軟件[17]，然后用MEGA 4.1軟件[18-19]采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 基因克隆與表達(dá)分析所用引物

1.7 甜高粱WRKY基因的熒光定量表達(dá)分析

根據(jù)克隆的2條基因cDNA序列設(shè)計qPCR引物qSbWRKY1和qSbWRKY2(表1)。內(nèi)參選擇高粱GAPDH基因(XM_002452356)。利用SYBR Green法進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析，在ABI 7500實時熒光定量PCR儀上分析[20]。PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序參考徐磊的方法[16]并稍作修改，具體如下：PCR反應(yīng)體系(20 μl)：cDNA 1 μl，2×TransStart Green qPCR Super Mix 10 μl，上游引物、下游引物各0.5 μl，補(bǔ)ddH2O至20 μl；PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。按照2-ΔΔCT法[21]計算基因在對照組和處理組之間的相對表達(dá)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜高粱WRKY基因的克隆與測序

通過Blast比對檢索到2個同源性高的高粱基因(Sb01g014180和Sb04g033240 )。Sb01g01418 0CDS全長1059 bp，在CDS兩側(cè)設(shè)計巢式引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、測序(圖1)，獲得1條完整的cDNA序列，該基因cDNA序列全長1086 bp，包含1個1059 bp的開放閱讀框，編碼352個氨基酸。與高粱

M: Trans2K plus DNA marker; 1: SbWRKY1全長cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物; 2: SbWRKY2全長cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物M: Trans2K plus DNA marker; 1: Full-length cDNA product of SbWRKY1; 2: Full-length cDNA product of SbWRKY2圖1 甜高粱SbWRKY1和SbWRKY2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of SbWRKY1 and SbWRKY2 genes from sweet sorghum

方框中ATG為起始密碼子，*為終止密碼子TAG；“WRKYGQK”為WRKY核心序列，“C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H”為鋅指結(jié)構(gòu)ATG in the box means the initiator codon, * means termination codon TAG; ‘WRKYGQK’ is the core sequence of WRKY, ‘ C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H’ is zinc finger structure model圖2 甜高粱SbWRKY1cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 SbWRKY1 cDNA sequences and deduced amino acid sequences from sweet sorghum

Sb01g014180基因相比，編碼區(qū)有6個核苷酸突變(269 A-G; 424 T-C; 428 C-T; 458 G-A; 828 T-C; 938 T-C)，5個氨基酸發(fā)生突變(90 Q-R; 122 S-P; 123 A-V; 153 R-Q; 313 V-A)，命名為SbWRKY1(圖2)。

Sb04g033240 CDS全長717 bp，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、測序(圖1)，該基因cDNA全長750 bp，包含1個717 bp的開放閱讀框，編碼238個氨基酸(圖3)。與高粱Sb04g033240基因相比，3個核苷酸發(fā)生突變(476 A-T; 486 C-T; 592 T-C)，2個氨基酸發(fā)生突變(159 Y-F; 198 S-P)，命名為SbWRKY2。2個基因編碼的蛋白序列均具有典型的WRKY核心序列“WRKYGQK” 和“C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H”鋅指結(jié)構(gòu)模型。表明克隆的2條基因為WRKY基因(圖3)。

2.2 SbWRKY1和SbWRKY2蛋白理化性質(zhì)和蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白理化性質(zhì)分析表明：SbWRKY1蛋白分子式為C1628H2619N509O504S16，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為37.89 kDa，等電點(diǎn)(PI)為9.78；包含20種常見氨基酸，含量最高的氨基酸為Ser(12.2 %)，最低的是Trp(0.3 %)；不穩(wěn)定指數(shù)為49.15，為不穩(wěn)定蛋白；疏水性 GRAVY值為-0.580，為親水性蛋白。SbWRKY2蛋白分子式為C1131H1752N326O344S21，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為26.09 kDa，等電點(diǎn)(PI)為8.43；包含20種常見氨基酸，含量最高的為Ser(8.8 %)和Gly(8.8 %)，最低的是Ile(0.8 %)；不穩(wěn)定指數(shù)為53.87，為不穩(wěn)定蛋白；疏水性 GRAVY值為-0.455，為親水性蛋白。預(yù)測的蛋白三級結(jié)構(gòu)表明(圖4)，SbWRKY1基因編碼蛋白與數(shù)據(jù)庫2ayd.1.A蛋白匹配，兩者序列相似性為57.97 %，GMQE值為0.12，QMEAN4值為-1.86。SbWRKY2基因編碼蛋白也與2ayd.1.A蛋白匹配，兩者序列相似性為50.67 %，GMQE值為0.19，QMEAN4值為-1.79。

2.3 SbWRKY1和SbWRKY2蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

對2條基因編碼蛋白進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，2個蛋白都包含1個典型的WRKY結(jié)構(gòu)域(圖5)。

2.4 SbWRKY1和SbWRKY2基因的表達(dá)特征分析

以高粱GAPDH基因作內(nèi)參，采用熒光定量PCR分析干旱脅迫條件下2條WRKY基因的表達(dá)，與 0 h表達(dá)量相比，干旱處理1、24 h均上調(diào)表達(dá)，隨著干旱脅迫時間延長，基因相對表達(dá)量持續(xù)增加(圖6)。SbWRKY1和SbWRKY2表達(dá)趨勢一致。

方框中ATG為起始密碼子，*為終止密碼子TGA；“WRKYGQK”為WRKY核心序列，C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H為鋅指結(jié)構(gòu)ATG in the box means the initiator codon, * means termination codon TGA; ‘WRKYGQK’ is the core sequence of WRKY, ‘C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H’ is zinc finger structure model圖3 甜高粱SbWRKY2cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 SbWRKY2 cDNA sequences and deduced amino acid sequences from sweet sorghum

2.5 WRKY蛋白進(jìn)化樹分析

通過NCBI Blast P工具比對分析，下載與SbWRKY1和SbWRKY2蛋白序列相似性高的蛋白序列，SbWRKY1蛋白與高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)、谷子(Setariaitalica)、節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)、短柄草(Brachypodiumdistachyon)、大麥(Hordeumvulgaresubsp.Vulgare)和小麥(Triticumaestivum)蛋白相似性分別為99 %、90 %、90 %、81 %。83 %、80 %和80 %。SbWRKY2蛋白與高粱、芒草(Miscanthuslutarioriparius)、谷子、玉米、短柄草、短花藥野生稻(Oryzabrachyantha)和小麥蛋白相似性分別為99 %、86 %、84 %、82 %、69 %、68

圖7 SbWRKY1蛋白與其他WRKY蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.7 Phylogenetic tree of SbWRKY1 protein and other WRKY proteins

圖8 SbWRKY2蛋白與其他WRKY蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.8 Phylogenetic tree of SbWRKY2 protein and other WRKY proteins

和60 %。利用Mega 4.1軟件，采用鄰接法構(gòu)建分子進(jìn)化樹(Bootstrap值設(shè)為1000次)，由圖7可知，甜高粱SbWRKY1蛋白與高粱、玉米和谷子WRKY蛋白聚為一類。 甜高粱SbWRKY2蛋白與高粱、芒草和玉米WRKY蛋白聚為一類。SbWRKY1蛋白和SbWRKY2蛋白均與高粱WRKY蛋白親緣關(guān)系最近(圖8)。

3 討論與結(jié)論

本研究基于已知玉米和谷子WRKY蛋白氨基酸序列，通過Blast比對分析，以高粱基因cDNA序列為模板，設(shè)計跨編碼區(qū)的巢式引物，通過RT-PCR驗證，在甜高粱中成功克隆到2個WRKY基因。SbWRKY1 cDNA全長1059 bp，編碼352個氨基酸。SbWRKY2 cDNA全長750 bp，編碼238個氨基酸。蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明，預(yù)測的SbWRKY1和SbWRKY2蛋白均具有WRKY保守結(jié)構(gòu)域。

隨著基因組測序與注釋工作不斷完善，有利于在參考基因組物種中克隆目標(biāo)基因，目前，高粱基因組注釋版本已更新至V3.1。為成功克隆目標(biāo)基因，本研究設(shè)計了特異性較強(qiáng)的巢式引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得2條目標(biāo)基因。盡管WRKY結(jié)構(gòu)域的核心序列“WRKYGQK”是高度保守的，但水稻有19個WRKY基因編碼的核心序列發(fā)生變異，類型為：WRKYGEK、WRKYGKK、WRICGQK、WRMCGQK、WKKYGQK、WIKYGQK、WKRYGQK、WSKYEQK和WRKYSEK[22]。本研究克隆的2條WRKY基因均具有保守的“WRKYGQK”7肽序列，沒有發(fā)生序列變異。前人研究標(biāo)明，WRKY基因參與干旱、高鹽和高溫等非生物脅迫調(diào)控進(jìn)程。水稻OsWRKY11基因受干旱和高溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)試驗證明該基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱和耐高溫抗性[23]。在馬鈴薯中過表達(dá)辣椒CaWRKY1基因，可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的耐旱性[24]。羊草LcWRKY5基因受干旱脅迫和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步通過擬南芥轉(zhuǎn)基因試驗證明該基因能夠增強(qiáng)植株耐失水脅迫壓力[25]。本研究克隆的SbWRKY1和SbWRKY2基因在干旱脅迫條件下呈上調(diào)表達(dá)特征，這與OsWRKY11和LcWRKY5的表達(dá)模式類似，推測這2條基因在應(yīng)對干旱脅迫中可能發(fā)揮一定作用。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

CloningandExpressionAnalysisofWRKYTranscriptionFactorGeneinSweetSorghum

XU Lei, HU Xiao-wen, YAO Yan-li, XING Shu-lian, LIU Yang*

(Guangdong Engineering Technology Research Center for Dryland Water-saving Agriculture, Zhanjiang Experiment Station , Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Guangdong Zhanjiang 524013, China)

【Objective】The objective of this study was to cloneWRKYgenes from sweet sorghum and analyzed their sequence characteristics and expression patterns, which would provided the source of gene in sweet sorghum breeding for drought resistance.【Method】Taken seedlings RNA of sweet sorghum cultivar M81-E as tested materials,WRKYgenes from sweet sorghum by RT-PCR were cloned, their characteristics of sequences with bioinformatics softwares and their expression patterns by real-time PCR were analyzed, and twoWRKYgenes from sweet sorghum were cloned, which were namedSbWRKY1 (Genebank accession number: KY231904) andSbWRKY2 (Genebank accession number: KY231905). 【Result】The cDNA full length ofSbWRKY1 was 1086 bp with a 1059 bp open reading frame, which encoded 352 amino acids. The cDNA full length ofSbWRKY2 was 750 bp with a 717 bp open reading frame, which encoded 238 amino acids. The two genes encoding proteins had WRKY core sequence ‘WRKYGQK’ and zinc finger structure model ‘C-X4-5-C-X22-23 -H-X1-H’. The predicted protein molecular formula of SbWRKY1 was C1628H2619N509O504S16, the molecular mass was 37.89 kDa, and the PI was 9.78. The predicted protein molecular formula of SbWRKY2 was C1131H1752N326O344S21, the molecular mass was 26.09 kDa, and the PI was 8.43. Phylogenetic analysis indicated that SbWRKY1 protein was close to WRKY proteins ofSorghumbicolor,ZeamaysandSetariaitalica, and SbWRKY2 protein was close to WRKY proteins ofSorghumbicolor,MiscanthuslutarioripariusandZeamays. Real-time PCR results showed that theSbWRKY1 andSbWRKY2 gene were up-regulated expression with the time of drought stress. 【Conclusion】These results demonstrated thatSbWRKY1 andSbWRKY2 might play a role in response to drought stress in sweet sorghum.

Sweet sorghum; Transcription factor; WRKY; RT-PCR

S514.03；Q943

A

1001-4829(2017)11-2429-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.007

2016-11-15

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實驗站科研啟動專項資金項目(zjky201504);中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目(17CXTD-07)

徐 磊(1984-)，男，河南信陽人，碩士，主要從事作物品種改良，E-mail:xulei00100@163.com，Tel：0759-2161106，*為通訊作者：劉 洋，E-mail:lyfull@163.com。