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(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

NaN3誘變處理對苜蓿愈傷組織抗旱及鹽生理的響應(yīng)

李波，馬赫

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

采用植物組織培養(yǎng)和疊氮化鈉(NaN3)誘變方法，對2種苜蓿愈傷組織進(jìn)行誘變和NaCl、PEG、混合脅迫處理，測定NaN3誘變對苜蓿愈傷組織5項生理指標(biāo)的變化。結(jié)果表明：隨著NaN3誘變和脅迫處理濃度的增加，苜蓿愈傷組織的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈上升的趨勢，電導(dǎo)率和丙二醛含量呈下降的趨勢，NaN3誘變+混合脅迫處理可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量積累最多，電導(dǎo)率和丙二醛含量最少。

紫花苜蓿； 愈傷組織； NaN3； 旱和鹽脅迫； 生理指標(biāo)

表1 脅迫和誘變處理苜蓿愈傷組織的材料編號

編號龍牧801編號圖牧2號A1對照A2對照B1PEG(LC50)B2PEG(LC50)C1NaCl(LC50)C2NaCl(LC50)D1NaN3(LC50)D2NaN3(LC50)E1NaN3(LC50+PEG(LC100)E2NaN3(LC50+PEG(LC100)F1NaN3(LC50+NaCl(LC100)F2NaN3(LC50+NaCl(LC100)G1NaN3(LC50+NaCl(LC100)+PEG(LC100)G2NaN3(LC50+NaCl(LC100)+PEG(LC100)

注：LC50為各濃度的半致死濃度；LC100為各濃度的致死濃度。

紫花苜蓿是豆科多年生草本植物，耐寒、耐旱且適應(yīng)性強(qiáng)，草質(zhì)優(yōu)良，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營養(yǎng)元素，廣泛種植作為飼料與牧草,然而高鹽和干旱等自然因素限制紫花苜蓿的生長。因此，提高苜蓿的抗旱和抗鹽能力具有重要的意義[1-2]。我國牧草育種起步較晚，種質(zhì)資源匱乏，迫切需要具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的種質(zhì)材料。通過誘變育種技術(shù)能誘發(fā)大量有利用價值的突變基因，產(chǎn)生一般常規(guī)方法難以獲得的牧草新類型和特殊性狀[3]，培育出更多優(yōu)異的苜蓿，為牧草育種提供寶貴的材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試苜蓿種子為龍牧801和圖牧2號，均由黑龍江省畜牧研究所提供，對2種苜蓿種子進(jìn)行無菌苗培養(yǎng)和莖段的愈傷組織誘導(dǎo)，脅迫和誘變處理。苜蓿愈傷組織的材料編號見表1。

1.2 方 法

1.2.1 苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿的2種苜蓿種子,0.1%的升汞溶液消毒 10 min ,無菌水沖洗 3～4次,植入 1/2 MS 基本培養(yǎng)基中,于(23±2)℃的條件下培養(yǎng),培養(yǎng)1～2周后即可得到無菌幼苗。切取其幼嫩莖段0.4～0.6 cm接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+30 g蔗糖+8.5 g瓊脂，pH=5.8)，于(23±2)℃的條件下培養(yǎng),培養(yǎng)20 d 左右即可得到愈傷組織，將愈傷組織切割成0.4～0.6 cm3小塊，轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中(同誘導(dǎo)培養(yǎng)基)即可獲得A 1和A 2類型苜蓿愈傷組織。

1.2.2 愈傷組織NaN3誘變

將2種苜蓿愈傷組織分別置于含有NaN3半致死濃度為4.0×10-3mol/L(用pH=7.0，0.2 mol/L磷酸緩沖液配制)的處理液中，置于恒溫?fù)u床中(110 r/min，25 ℃)，震蕩4 h后用無菌水沖洗3～5次，用無菌濾紙將愈傷組織表面水分吸干，再將愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25 d。龍牧801和圖牧2號苜蓿愈傷組織在NaN3的半致死濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘變處理，即可獲得D 1和D 2苜蓿愈傷組織。

1.2.3 苜蓿愈傷組織旱和鹽脅迫

將愈傷組織置于1.5% NaCl培養(yǎng)基中(成分同前)進(jìn)行脅迫處理8 d，對存活的愈傷組織繼代培養(yǎng)即可獲得B 1和B 2類型苜蓿愈傷組織。將愈傷組織置于25% PEG(PEG-6000)液體培養(yǎng)基中(成分同前)進(jìn)行脅迫處理6 d，對存活的愈傷組織繼代培養(yǎng)即可獲得C 1和C 2類型苜蓿愈傷組織。

將NaN3誘變處理后生長良好的愈傷組織接種在含2.0% NaCl和30% PEG的致死濃度培養(yǎng)基中，分別脅迫處理12 d和10 d，存活的愈傷組織繼代培養(yǎng)基，即可獲得E 1、E 2、F 1、F 2類型的愈傷組織。繼代培養(yǎng)2～3次后，將2.0% NaCl處理的每種材料中的一部分接入含30% PEG的培養(yǎng)基中進(jìn)行混合脅迫處理10 d，生長良好的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基中，即可獲得G 1和G 2類型的愈傷組織。

1.2.4 生理指標(biāo)的測定

丙二醛(MDA)含量采取硫代巴比妥酸法，可溶性糖含量采用蒽酮法測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定，游離脯氨酸含量采用茚三酮法測定，相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率法測定[4-5]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用隸屬法對不同處理的苜蓿愈傷組織的抗逆性進(jìn)行綜合評價。

隸屬函數(shù)值計算公式：

R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

……(1)

反隸屬函數(shù)值計算公式：

R(Xi) =1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

……(2)

式中，Xi為指標(biāo)測定值，Xmin、Xmax為所有實驗材料某項指標(biāo)的最小值和最大值。

將抗性隸屬值進(jìn)行累加求出平均數(shù)，公式如下：

X=∑U(Xi) /n

……(3)

在公式(3)中，X是所求平均抗性的隸屬值。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaN3誘變處理苜蓿愈傷組織MDA含量的變化

不同脅迫和誘變處理均使苜蓿愈傷組織的MDA含量下降(見圖1)。龍牧801和圖牧2號2種苜蓿愈傷組織經(jīng)PEG脅迫處理與對照組比較(0%PEG、0%NaCl) MDA含量分別下降了33.12%和25.23%，經(jīng)NaCl脅迫處理，MDA含量分別下降了46.13%和40.48%。

注：A 1、B 1、C 1、D 1、E 1、F 1、G 1為龍牧801的對照、PEG、NaCl、 NaN3、NaN3+PEG、NaN3+ NaCl、NaN3+ NaCl+PEG；A 2、B 2、 C 2、D 2、E 2、F 2、G 2為圖牧2號的對照、PEG、NaCl、NaN3、 NaN3+PEG、NaN3+ NaCl、NaN3+ NaCl+PEG。下同。圖1 苜蓿愈傷組織MDA含量的變化

經(jīng)NaN3誘變處理后，降低了2種苜蓿愈傷組織的MDA含量。龍牧801苜蓿愈傷組織的MDA含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同處理組與對照組(0%PEG、0%NaCl)相比分別下降了46.13%、48.84%、52.19%和79.38%；圖牧2號苜蓿愈傷組織的MDA含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同處理組與對照組(0%PEG、0%NaCl)相比分別下降了40.48%、43.96%、46.37%和70.54%。

2.2 NaN3誘變處理苜蓿愈傷組織可溶性糖含量的變化

不同脅迫和誘變處理均使苜蓿愈傷組織的可溶性糖含量增加(見圖2)。龍牧801和圖牧2號2種苜蓿愈傷組織經(jīng)PEG脅迫處理與對照組比較(0% PEG、0% NaCl)，可溶性糖含量分別增加了45.48%和27.07%，經(jīng)NaCl脅迫處理，可溶性糖含量分別增加了58.25%和34.27%。

經(jīng)NaN3誘變處理后，增加了2種苜蓿愈傷組織的可溶性糖含量。龍牧801苜蓿愈傷組織的可溶性糖含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同處理組與對照組(0%PEG、0%NaCl)相比分別增加了74.47%、82.54%、80.73%和86.65%；圖牧2號苜蓿愈傷組織的可溶性糖含量NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同處理組與對照組(0%PEG、0%NaCl)相比分別增加了43.79%、73.19%、63.00%和79.28%。

圖2 苜蓿愈傷組織可溶性糖含量的變化

2.3 NaN3誘變處理苜蓿愈傷組織相對電導(dǎo)率的變化

不同脅迫和誘變處理均使苜蓿愈傷組織的相對電導(dǎo)率下降(見圖3)。龍牧801和圖牧2號2種苜蓿愈傷組織經(jīng)PEG脅迫處理與對照組比較(0% PEG、0% NaCl)，相對電導(dǎo)率分別下降了33.12%和25.23%，經(jīng)NaCl脅迫處理，相對電導(dǎo)率分別下降了46.13%和40.48%。

圖3 NaN3誘變苜蓿愈傷組織相對電導(dǎo)率的變化

經(jīng)NaN3誘變處理后，降低了2種苜蓿愈傷組織的相對電導(dǎo)率。龍牧801苜蓿愈傷組織的相對電導(dǎo)率在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同處理組與對照組(0%PEG、0%NaCl)相比分別下降了17.64%、26.65%、31.37%和37.64%；圖牧2號苜蓿愈傷組織的相對電導(dǎo)率在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同處理組與對照組(0%PEG、0%NaCl)相比分別下降了12.82%、20.40%、17.15和39.62%。

表2 5項生理指標(biāo)隸屬函數(shù)值

材料處理 可溶性糖 可溶性蛋白 脯氨酸 丙二醛 相對電導(dǎo)率 平均隸屬值 龍牧801圖牧2號龍牧801圖牧2號龍牧801圖牧2號龍牧801圖牧2號龍牧801圖牧2號龍牧801圖牧2號對照0．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．000PEG0．1280．0970．360．0950．3050．2940．4170．3580．1550．0730．2730．183NaCl0．2150．1360．4510．1370．3780．3880．4980．4350．1610．0210．3410．223NaN30．4490．2040．6420．4940．5140．4190．5810．5740．5290．3730．5430．413NaN3+PEG0．7280．7140．8180．6270．7900．6040．6150．6230．7200．5500．7340．624NaN3+NaCl0．6450．4450．9430．7610．7870．8510．6570．6570．8200．4740．7710．638NaN3+NaCl+PEG1．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000

2.4 NaN3誘變處理苜蓿愈傷組織可溶性蛋白含量的變化

不同脅迫和誘變處理均使苜蓿愈傷組織的可溶性蛋白含量增加(見圖4)。龍牧801和圖牧2號2種苜蓿愈傷組織經(jīng)PEG脅迫處理與對照組比較(0%PEG、0%NaCl)，可溶性蛋白含量分別增加了29.69%和10.43%，經(jīng)NaCl脅迫處理，可溶性蛋白含量分別增加了36.61%、14.38%。

圖4 NaN3誘變苜蓿愈傷組織可溶性蛋白含量的變化

經(jīng)NaN3誘變處理后，增加了2種苜蓿愈傷組織的可溶性蛋白含量。龍牧801苜蓿愈傷組織的可溶性蛋白含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同處理組與對照組(0%PEG、0%NaCl)相比分別增加了42.93%、48.96%、52.52%和53.97%；圖牧2號苜蓿愈傷組織的可溶性蛋白含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同處理組與對照組(0%PEG、0%NaCl)相比分別增加了37.73%、43.44%、48.24%和55.06%。

2.5 NaN3誘變處理苜蓿愈傷組織脯氨酸含量的變化

不同脅迫和誘變處理均使苜蓿愈傷組織的脯氨酸含量增加(見圖5)。經(jīng)PEG、NaCl脅迫處理使龍牧801和圖牧2號苜蓿愈傷組織脯氨酸含量均上升，分別上升44.14%、49.42%、29.52%、35.64%。經(jīng)NaN3處理使龍牧801和圖牧2號苜蓿愈傷組織脯氨酸含量均上升，分別上升57.05%、37.41%。經(jīng)NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl脅迫處理使龍牧801和圖牧2號苜蓿愈傷組織脯氨酸含量均上升，分別上升23.49%、23.27%、35.05%、14.15%、27.83%、34.13%。

圖5 NaN3誘變苜蓿愈傷組織脯氨酸含量的變化

2.6 抗逆性綜合分析

可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、電導(dǎo)率和丙二醛含量5項生理指標(biāo)的隸屬值如表2所示，隸屬函數(shù)的綜合分析可知，NaN3誘變提高了2種苜蓿愈傷組織的抗旱和抗鹽能力，龍牧801和圖牧2號抗旱和鹽順序由強(qiáng)到弱依次為：NaN3+NaCl+PEG>NaN3+NaCl>NaN3+PEG>紫外線，隸屬函數(shù)值綜合評價值越大，表明NaN3對苜蓿愈傷組織干旱和鹽堿的生理的影響就越大，則其抗旱和耐鹽性越強(qiáng)。

3 討 論

植物組織培養(yǎng)過程中存在著廣泛的變異,若用誘變劑處理則可大大提高變異發(fā)生的頻率[6]，試驗中所用誘變劑為NaN3的半致死濃度，采用懸浮處理的方法較易使誘變劑滲入組織細(xì)胞。再加上一定的PEG，

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NaCl和PEG與NaCl交替混合處理，增加了苜蓿愈傷組織突變體選擇的定向性。

干旱和鹽堿逆境對植物造成的傷害主要是滲透脅迫和離子脅迫。在滲透脅迫下,植物通過滲透調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境變化,主要是指細(xì)胞中合成和積累的有活性并且無毒害作用的溶質(zhì)的過程，這些物質(zhì)包括無機(jī)離子和有機(jī)物。在逆境脅迫下,植物體內(nèi)會通過合成或降解更多的可溶性糖、蛋白質(zhì)和脯氨酸來提高細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度,進(jìn)而增加細(xì)胞的滲透勢并提高植物對逆境的適應(yīng)性[7-8]。從可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸的含量來看，這3項指標(biāo)變化情況基本一致，在PEG、NaCl和NaN3誘變脅迫下苜蓿愈傷組織中3種指標(biāo)均呈現(xiàn)上升趨勢，說明一定的誘變和脅迫可以增強(qiáng)可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量，以提高機(jī)體的抵抗能力，這與李紅等[9]、馬玉涵等[10]研究結(jié)果一致。

干旱和鹽脅迫對植物最明顯的傷害之一就是質(zhì)膜結(jié)構(gòu)及生理功能的破壞，質(zhì)膜受到損傷引起質(zhì)膜透性增大，丙二醛是膜脂過氧化作用的終產(chǎn)物之一，其含量可反映植物遭受境傷害的程度。實驗發(fā)現(xiàn)，NaN3誘變后的苜蓿愈傷組織的相對電導(dǎo)率和丙二醛的含量均呈下降趨勢，說明一定的NaN3誘變通過降低相對電導(dǎo)率和丙二醛的含量來減少對苜蓿愈傷組織對逆境的傷害，增加其抗逆性。因此，期望利用NaN3的高效誘變效應(yīng)，通過對苜蓿愈傷組織的誘變效應(yīng)的研究，為苜蓿生物學(xué)研究和育種提供資源材料。

[1]He S B,Liu G L,Yang H M.Water use efficiency by alfalfa:mechanisms involvinganti-oxidation and osmotic adjustment under drought[J].Russian Journal of Plant Physiology,2012,59(3):348-355.

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(本欄目責(zé)任編輯：周介雄)

Response of Physiology to Drought and Salt Tolerance of Alfalfa Callus by NaN3Mutation

LIBo，MAHe

(College of Agriculture，F(xiàn)orestry and Life Sciences，Qiqihar University，Qiqihar Heilongjiang 161006，China)

Experiment the method of plant tissue culture and NaN3mutagenesis were adopted to induced and treated with hybrid stress of NaCl and PEG the two kinds of alfalfa callus,Alfalfa callus five changes of physiological indexes were determined under NaN3mutagenesis.The results showed that with the increase of ultraviolet mutagenesis and stress alfalfa,callus of soluble sugar,soluble protein and proline content present a rise of change trend,conductivity and malondialdehyde content showed a downward trend.NaN3mutagenesis+hybrid stress dealing with soluble sugar,accumulation of soluble protein and proline was most,conductivity and malondialdehyde content was least.

alfalfa； callus； NaN3； drought and salt stress； physiological index

2017-01-09

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃重大項目(GA 15 B 105-5)；齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計劃項目(NYGG-201518)。

李 波(1962—)，女，遼寧鞍山人；教授，主要從事細(xì)胞生物學(xué)的教學(xué)和科研工作；E-mail：libo1962@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.08.047

S 551+.7

A

1001-4705(2017)08-0047-05