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(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系， 貴陽(yáng) 550025)

白刺花染色體壓片技術(shù)優(yōu)化及核型分析

雷文英，趙麗麗，簡(jiǎn)忠領(lǐng)，陳超，宋高翔

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系， 貴陽(yáng) 550025)

以貴州白刺花(Sophoradavidii)根尖為試材，從取材時(shí)間、預(yù)處理方法、解離時(shí)間3個(gè)方面改進(jìn)白刺花染色體常規(guī)壓片技術(shù)，并對(duì)白刺花染色體進(jìn)行核型分析。結(jié)果表明，白刺花染色體壓片最佳取材時(shí)間為09：00-10：00時(shí)，根尖用冰水混合物在4 ℃冰箱里預(yù)處理24 h為宜，卡諾固定液(無(wú)水酒精∶冰醋酸=3∶1)固定24 h，解離用1 mol/L鹽酸在60 ℃水浴下解離8 min最好。核型分析結(jié)果表明，白刺花染色體基數(shù)為x=9，染色體數(shù)目2 n=18，染色體核型公式為2 n=2 x=2 M+16 m，染色體相對(duì)長(zhǎng)度為2 n=2 x=18=2 S+10 M 1+6 M 2。白刺花的染色體屬于1 A型。

白刺花； 染色體壓片； 染色體數(shù)目； 核型分析

白刺花為我國(guó)原產(chǎn)植物，主要分布于華北、西北、西南，是豆科槐屬落葉灌木，也叫苦刺花、馬蹄針、狼牙刺等[1-2]。白刺花具有清熱、解毒涼血、消腫利濕等藥用價(jià)值，主要用于治療咽喉腫痛、肝炎、水腫、熱毒瘡瘍等常見(jiàn)癥狀[3-4]。白刺花同時(shí)是主要蜜源植物之一。其蜂蜜又叫狼牙刺蜜，屬于一等蜜，是平喘、祛痰、利氣的理想輔助食品[5-7]。白刺花幼嫩枝葉適口性較好，可刈割青飼和調(diào)制青貯飼料[8]；其適應(yīng)性較強(qiáng)、耐踩踏、耐刈割、再生性好，可直接放牧山羊[9]。白刺花根系發(fā)達(dá)(當(dāng)莖的測(cè)量高度為40 cm時(shí)，白刺花的主根地下深處可高達(dá)100 cm，其側(cè)根主要集中在30 cm土層處分布)[10]，防風(fēng)固沙能力強(qiáng)[11-12]。白刺花具有較強(qiáng)的干旱脅迫適應(yīng)能力[13]，在惡劣條件下仍能生長(zhǎng)?？傊?，白刺花在石漠化的生態(tài)環(huán)境中具有較好的資源優(yōu)勢(shì)，特別是在生態(tài)畜牧業(yè)建設(shè)中起到較重要的作用。但在利用的過(guò)程中，白刺花育成品種缺乏，種源難以保證，嚴(yán)重限制了該優(yōu)良種質(zhì)的利用。因此，了解白刺花種質(zhì)材料的遺傳背景，加快新品種培育至關(guān)重要。

植物染色體是基因的主要載體，基因控制植物性狀。染色體的觀察是探索生物系統(tǒng)發(fā)生、遺傳規(guī)律和育種的基礎(chǔ)，是選擇、識(shí)別和繁殖親本材料的重要技術(shù)環(huán)節(jié)[14]。直接鑒定法是目前染色體倍性鑒定常用的方法，也被稱為染色體計(jì)數(shù)法，這是確定倍性最基本和最精確的方法[15]。根尖壓片技術(shù)在甘蔗、姜科植物、蔬菜、糧食作物等的染色體研究中得到廣泛應(yīng)用，過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同取材時(shí)間、不同預(yù)處理方法、不同解離時(shí)間對(duì)制片效果的影響較大。但目前關(guān)于白刺花染色體倍性研究的報(bào)道較少，本研究擬利用常規(guī)壓片技術(shù)，研究白刺花壓片技術(shù)的取材時(shí)間、預(yù)處理試劑、解離時(shí)間等，優(yōu)化白刺花染色體常規(guī)壓片技術(shù)，并對(duì)白刺花染色體數(shù)目和核型進(jìn)行鑒定研究，了解白刺花的遺傳背景，為利用白刺花種質(zhì)資源開(kāi)展育種工作，培育出適于推廣，具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的白刺花品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為白刺花根尖。白刺花種子采自貴州省水城縣(104°44′13″E，26°17′08″N，海拔1 140 m)。選擇飽滿且大小一致的白刺花種子用砂紙打磨，自來(lái)水沖洗干凈后，放置于裝有蒸餾水的燒杯中浸泡24 h，將浸泡后的種子放入鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中并加入蒸餾水潤(rùn)濕。然后將培養(yǎng)皿置于20～25 ℃的條件下進(jìn)行種子萌發(fā)并觀察萌發(fā)情況。待種子萌發(fā)后胚根生長(zhǎng)至0.8～1 cm時(shí)取出根尖，截取根尖進(jìn)行試驗(yàn)操作。

1.2 方 法

1.2.1 染色體壓片技術(shù)

本試驗(yàn)參照李國(guó)珍[26]、劉祖洞[16]等的研究方法，從取材時(shí)間、預(yù)處理方法和解離時(shí)間3個(gè)方面進(jìn)行條件優(yōu)化，具體處理如下：

1) 取材：設(shè)置08：00時(shí)以前、08：00—09：00時(shí)、09：00—10：00時(shí)這3個(gè)時(shí)間段取材，取萌發(fā)好的白刺花根尖為材料。

2) 預(yù)處理：分別將材料放在①冰水混合物置于4 ℃冰箱中處理24 h；②0.002 mol/L的秋水仙素在4 ℃冰箱中處理3.5 h，通過(guò)對(duì)比分析，選擇最優(yōu)處理方式。

3) 解離：把保存在70%乙醇里的材料取出并用蒸餾水漂洗2次，移置于在60 ℃恒溫水浴鍋里預(yù)熱的放有1 mol/L鹽酸的試管中解離[17]，解離時(shí)間為3 min和8 min。

1.2.2 染色體鏡檢和核型分析

利用光學(xué)電子顯微鏡進(jìn)行觀察。選擇20個(gè)染色體形狀良好，均勻分散，并且條數(shù)清晰的細(xì)胞，以確定材料染色體的數(shù)量。取3個(gè)處于有絲分裂中期并且染色體分散良好的細(xì)胞進(jìn)行觀察，核型平均數(shù)按照李懋學(xué)等[18]的方法計(jì)算，根據(jù)Levan[19]的方法求出核型公式，確定染色體類型，根據(jù)Arano[20]和Stebbins[21]的方法計(jì)算核型不對(duì)稱系數(shù)，并進(jìn)行分類。

1.3 數(shù)據(jù)及圖像處理

利用SPSS、EOS Utility、Photoshop_CS 5_CHS&ENG、WPS Microsoft Excel 97-2003對(duì)數(shù)據(jù)及圖像進(jìn)行處理。相關(guān)公式如下：

染色體臂比=長(zhǎng)臂(L)/短臂(S)；

染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)(%)=染色體長(zhǎng)度/全組染色體平均數(shù)×100%;

染色體相對(duì)長(zhǎng)度(%)=染色體長(zhǎng)度/染色體組總長(zhǎng)度×100%;

核型不對(duì)稱系數(shù)(%)=長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體制片方法

2.1.1 取材時(shí)間對(duì)白刺花染色體制片的影響

對(duì)于白刺花的染色體制片，取材時(shí)間關(guān)系到能否大量觀察到分裂中期相，試驗(yàn)分別在08：00時(shí)以前、08：00—09：00時(shí)、09：00—10：00時(shí)3個(gè)時(shí)段取材，由圖2 A觀察發(fā)現(xiàn)，08：00時(shí)以前取材，可觀察到染色體，少數(shù)細(xì)胞處于分裂中期相，中期分裂相細(xì)胞比例為13.2%(圖1)。由圖2 B觀察發(fā)現(xiàn)，08：00—09：00時(shí)取材，可觀察到染色體，少數(shù)細(xì)胞處于分裂中期相，中期分裂相細(xì)胞比例為38.9%(圖1)。由圖2 C觀察發(fā)現(xiàn)，09：00—10：00時(shí)可觀察到染色體，多數(shù)細(xì)胞處于分裂中期相，中期分裂相細(xì)胞比例為62.4%(圖1)，3個(gè)取材時(shí)間獲得的中期分裂相細(xì)胞比例存在顯著差異。因此，09：00—10：00時(shí)是白刺花染色體制片較好的取材時(shí)段。

圖2 不同取材時(shí)間下染色體的形態(tài)

注：A為秋水仙素處理時(shí)間超過(guò)3.5 h，解離3 min；B為秋水仙素處理時(shí)間超過(guò)3.5 h，解離8 min； C為冰水混合物預(yù)處理24 h，解離3 min；D為冰水混合物處理24 h，解離8 min。圖3 預(yù)處理試劑及不同解離時(shí)間對(duì)白刺花染色體制片的影響

圖4 白刺花染色體核型圖

圖1 不同取材時(shí)間對(duì)中期分裂相細(xì)胞比例的影響

2.1.2 不同預(yù)處理試劑及不同解離時(shí)間對(duì)白刺花染色體制片的影響

將材料用秋水仙素處理3.5 h，染色體開(kāi)始粘連，解離3 min，染色2 h，染色體形態(tài)模糊，染色較淺，如圖3 A；解離8 min，染色2 h，染色體形態(tài)模糊，染色較深，如圖3 B。用冰水混合物處理24 h，染色同樣都是2 h，但分別解離3 min和8 min。解離3 min，染色體條形清晰但染色較淺，如圖3 C；解離8 min染色較深，條形清晰，如圖3 D。

2.2 白刺花染色體核型分析

選擇20個(gè)染色體形態(tài)分散良好的細(xì)胞，計(jì)數(shù)的染色體條數(shù)均為18條，記為2 n=18條(見(jiàn)圖4)。白刺花染色體的參數(shù)與核型分析見(jiàn)表1，白刺花染色體核型模式圖見(jiàn)圖5。

表1 白刺花染色體核型參數(shù)

染色體編號(hào)染色體長(zhǎng)(μm)短臂長(zhǎng)臂全長(zhǎng)臂比相對(duì)長(zhǎng)度(%)相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)(%)類型LevanbKuoc12．88±0．64a3．76±0．826．63±1．281．33±0．3115．83±0．091．43±0．01MM222．45±0．703．44±0．945．89±1．631．40±0．0813．90±1．301．25±0．12mM132．31±0．553．03±0．795．34±1．351．31±0．0312．66±0．931．14±0．09mM242．25±0．572．94±0．795．20±1．301．32±0．2112．33±0．981．11±0．09mM252．11±0．232．31±0．394．43±0．601．09±0．1010．65±0．750．96±0．07mM161．90±0．322．44±0．494．34±0．691．29±0．2610．41±0．680．94±0．06mM171．61±0．132．22±0．243．83±0．251．39±0．219．30±1．270．84±0．11mM181．63±0．221．91±0．363．55±0．531．17±0．178．52±0．590．77±0．05mM191．15±0．291．54±0．372．69±0．621．35±0．226．39±0．270．58±0．03mS染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成2n=2x=18=2S+10M1+6M2核型公式2n=2x=2M+16m核型類型1A核型不對(duì)稱系數(shù)(%)0

注：“a”為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;“b、c”為染色體類型分別按照Levan等[19]和Kuo等[22]的方法劃分。

圖5 白刺花染色體核型模式圖

由表1和圖5可知，白刺花的染色體臂比范圍為1.09～1.40，長(zhǎng)短臂相差較小；相對(duì)長(zhǎng)度范圍為6.39%～15.83%，相對(duì)長(zhǎng)度組成為2 n=2 x=18=2 S+10 M 1+6 M 2。綜合分析其核型公式為2 n=2 x=2 M+16 m。

各染色體的臂比值均小于2∶1，比例達(dá)到100%，無(wú)核型不對(duì)稱染色體，因此白刺花的染色體屬于1 A型。

白刺花的9對(duì)染色體中，主要分為兩類：中部著絲點(diǎn)的染色體(m)和正中部著絲粒染色體(M)；其中，中部著絲點(diǎn)的染色體為8對(duì)，占總?cè)旧w數(shù)的88.9%；正中部著絲粒染色體為1對(duì)，占細(xì)胞里總?cè)旧w數(shù)的11.1%。由此可看出，白刺花染色體的核型種類為中等的對(duì)稱核型。

3 討論與結(jié)論

3.1 高質(zhì)量染色體制片技術(shù)的探討

在白刺花染色體制片的過(guò)程中，正確的取材時(shí)間是保證看到大量中期分裂相的關(guān)鍵。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在09：00—10：00時(shí)均可以找到較多細(xì)胞分裂旺盛的中期相，這與汪祥等[23]對(duì)中華蚊母樹(shù)染色體制片最佳取材時(shí)間的研究結(jié)果相一致。取材之后的預(yù)處理亦是染色體制片最重要的步驟，冰水混合物和秋水仙素均能抑制紡錘絲形成，促使染色體縮短變粗，便于觀察到形態(tài)清晰的染色體。試驗(yàn)結(jié)果表明，秋水仙素處理的時(shí)間控制較為重要，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致染色體粘連，形態(tài)難以辨別。當(dāng)處理時(shí)間適宜時(shí)，染色體形態(tài)比較好，但因藥品價(jià)格昂貴且有劇毒，對(duì)于白刺花染色體制片不建議使用。本試驗(yàn)中，冰水混合物處理白刺花根尖24 h后，獲得的染色體形態(tài)良好，污染少、無(wú)毒、制作方便、經(jīng)濟(jì)，建議使用。

材料在預(yù)處理后要進(jìn)行固定，固定步驟的質(zhì)量會(huì)直接影響到制片的效果，卡諾固定液能使染色體收縮程度相對(duì)適中，便于染色體數(shù)目的計(jì)數(shù)和染色體長(zhǎng)度測(cè)量與核型分析[23]。另外，固定好的材料如果不能及時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，要把根尖放于70%酒精中置于4 ℃的冰箱中保存。

解離主要是軟化細(xì)胞，破壞細(xì)胞的細(xì)胞壁。解離的時(shí)間過(guò)短，會(huì)造成細(xì)胞壁未完全消化，染色體重疊，出現(xiàn)染色體難以著色，不利于觀察等問(wèn)題；但解離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)染色體受損等問(wèn)題。本試驗(yàn)研究表明，1 mol/L鹽酸解離8 min,染色體著色較好，解離3 min和5 min，著色較淺并且不易著色，這與涂紅艷等[24]、孫勃等[25]、汪祥等[23]對(duì)其他植物染色體制片最佳解離時(shí)間的研究結(jié)果相一致。根尖染色的時(shí)間在0.5～2 h最佳。時(shí)間過(guò)短，染色體著色過(guò)淺不便觀察，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)根尖容易軟以及變爛[26]。

綜上，白刺花染色體制片最佳的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案為：取材時(shí)間為09：00—10：00時(shí)，預(yù)處理方法為冰水混合物處理24 h，之后在60 ℃水浴下用1 mol/L鹽酸解離8 min，卡諾固定液固定，改良石碳酸品紅染色液染色0.5～2 h，敲片后鏡檢。

3.2 白刺花核型分析

本試驗(yàn)結(jié)果表明，白刺花的體細(xì)胞染色體數(shù)目為2 n=2 x=18，染色體基數(shù)x=9，其染色體的核型公式為2 n=2 x=2 M+16 m，白刺花的染色體中有16條中部著絲粒染色體，2條為正中部著絲粒染色體。白刺花染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2 n=2 x=18=2 S+10 M 1+6 M 2，無(wú)核型不對(duì)稱染色體，染色體類型為1 A型。根據(jù)Stebbins[21]和Levitzky[27]的觀點(diǎn)，白刺花核型對(duì)稱程度很高，在進(jìn)化的過(guò)程中處于比較原始的類型。本試驗(yàn)主要針對(duì)貴州地區(qū)白刺花染色體核型進(jìn)行分析，探索了其最佳制片技術(shù)，同時(shí)為貴州石漠化山區(qū)白刺花基因組特征、染色體核型研究、遺傳育種、品種分類鑒定、新品種的培育提供了科學(xué)依據(jù)。

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Optimization of Chromosome Preparation and Karyotype Analysis ofSophoradavidii

LEIWenying,ZHAOLili,JIANZhongling,CHENChao,SONGGaoxiang

(Department of Grassland Science,College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025，China)

To optimize the chromosome preparation procedure and investigate the karyotype ofSophoradavidii.The root ofSophoradavidiigrowing in Guizhou was used as plant material.Factor affected chromosome preparation including sampling time,pretreatment and dissociation durations were investigated.Results showed that,The best compression technique forSophoradavidiichromosome was as follows:sampling time for 09：00-10：00 in the morning,24 hour pretreatment using mixture of ice and water in the refrigerator at 4 ℃,8 minute dissociation at 60 ℃ using hydrochloric acid 1 mol/L.The basic chromosome number was x=9,Sophoradavidiiwas diploid and the chromosome number was 2 n=18,the chromosome karyotype formula was 2 n=2 x=2 M+16 m,the relative length of the chromosome was 2 n=2 x=18=2 S+10 M 1+6 M 2.The chromosome ofSophoradavidiibelongs to 1 A type.

Sophoradavidii； chromosome preparation； chromosome number； karyotype analysis

2017-02-26

貴州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(創(chuàng)新020)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2014 BAD 23 B 03)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560664)；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合支撐[2016]2516號(hào)、黔科合NY字[2014]3048號(hào))；黔南州社會(huì)發(fā)展科技項(xiàng)目(喀斯特石漠化林草牧綜合治理技術(shù)研究與示范)。

雷文英(1992—)，女，學(xué)士，研究方向：草業(yè)科學(xué)；E-mail：1531497269@qq.com。

趙麗麗(1981—)，女，博士，副教授，主要從事草種質(zhì)資源及育種；E-mail：zhaolili0508@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.08.005

S 793.2

A

1001-4705(2017)08-0005-05