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(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 徐州 221116)

3種抗生素對白菜種子萌發(fā)的影響

李萌，楊磊，季劍南，馮小娜，黃榮，溫洪宇，高霞莉，曹露芬

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 徐州 221116)

以白菜種子為試材，采用保濕培養(yǎng)法，研究金霉素、土霉素和氯霉素3種抗生素在不同濃度下對白菜種子萌發(fā)率、根長和抗氧化酶活力的影響。結(jié)果表明，在0.5～50 mg/L抗生素作用下，白菜種子萌發(fā)率無顯著變化，500 mg/L抗生素顯著抑制白菜種子萌發(fā)率?？股貪舛扰c白菜根長抑制率之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。3種抗生素對白菜種子萌發(fā)的抑制作用大小依次為：氯霉素gt;金霉素gt;土霉素。抗生素濃度對白菜幼苗的抗氧化酶活性的影響表現(xiàn)為低濃度促進而高濃度抑制。

白菜種子； 抗生素； 發(fā)芽率； 根長； 抗氧化酶

抗生素是微生物次級代謝產(chǎn)生的具有殺滅病原微生物作用的化學(xué)物質(zhì)，在感染治療與預(yù)防中有顯著效果[1]。自20世紀弗萊明發(fā)明青霉素以來，抗生素對人類生命健康和社會發(fā)展做出卓越的貢獻。由于抗生素具有促進農(nóng)作物生長的功能而被大面積應(yīng)用于農(nóng)業(yè)。人們過度依賴抗生素防治病蟲害，且缺乏對抗生素合理使用的認識，導(dǎo)致抗生素使用量和使用濃度大大增加[2]。中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所發(fā)布的一項研究顯示，2013年中國總的抗生素生產(chǎn)量24.8萬t，其中抗生素使用量高達16.2萬t，約占世界使用量的一半左右，人均使用量是西方的5～8倍。與西方國家相比，我國已經(jīng)成為世界上濫用抗生素最為嚴重的國家之一[3]?？股亟?jīng)過動物等生物體生物代謝后，大多以原形排出[4]。在自然界, 抗生素可通過多種途徑如土壤、微生物、動植物進行傳遞[5-6]，再經(jīng)過一系列生理生化過程，直接或間接地對環(huán)境和動植物造成不利影響。

王朋等[7]通過發(fā)芽試驗發(fā)現(xiàn)，玉米對環(huán)丙沙星的吸收量隨培養(yǎng)液中環(huán)丙沙星濃度的增加而上升，環(huán)丙沙星使玉米幼苗的生長受到不同程度抑制，玉米根中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活力發(fā)生明顯變化。魏塞金等[8]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度農(nóng)抗702使種子中的淀粉酶活性和蛋白質(zhì)含量降低。魏子艷等[9]采用水培法研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中金霉素濃度為70 mg/L時，顯著抑制黃瓜芽長。鮑艷宇等[10]研究四環(huán)素類抗生素對小麥種子萌發(fā)的影響，小麥根伸長抑制率隨抗生素濃度升高呈上升趨勢。

在充分掌握抗生素對農(nóng)作物生長機制影響的基礎(chǔ)上，人們才能合理使用抗生素，減少過量使用抗生素帶來的危害。目前關(guān)于抗生素對蔬菜種子萌發(fā)的生態(tài)毒理機制尚未明確，因此開展此類研究很有必要?；谏鲜鲈?，本試驗以白菜種子為試材，研究金霉素、土霉素和氯霉素3種常用的抗生素對白菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長及其體內(nèi)抗氧化酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗使用的“豐抗80”白菜種子由萊州金源種子有限公司生產(chǎn)，采購于江蘇省徐州市食品城種子批發(fā)市場。鹽酸金霉素(純度gt;95%，Cas：64-72-2)，土霉素(純度gt;95%，Cas：79-57-2)，氯霉素(純度gt;99%，Cas：56-75-7)。

1.2 方法(保濕培養(yǎng)法)

配制1/2 Hoagland溶液，并以此溶液配制不同濃度的抗生素溶液。每種抗生素均設(shè)置9種濃度，分別為0，0.5，5，10，20，30，40，50，500 mg/L。選取結(jié)構(gòu)完整、均勻飽滿的白菜種子，經(jīng)過10%的次氯酸鈉浸泡10 min，用去離子水清洗3次。

表1 抗生素對白菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

處理濃度(mg/L) 氯霉素 金霉素 土霉素 發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(%)發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(%)發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(%)087．33+0．0977．33+0．4987．33+0．0977．33+0．4987．33+0．0977．33+0．490．584．67+0．0980．67+0．0184．00+0．1676．00+0．4886．00+0．0980．67+0．09585．33+0．0976．67+0．3786．67+0．0981．33+0．0587．33+0．0980．00+0．041084．00+0．0080．67+0．0986．67+0．0183．33+0．4188．67+0．0482．00+0．282084．00+0．2874．67+0．0186．00+0．0480．00+0．1688．00+0．2582．67+0．213083．33+0．0175．33+0．4985．33+0．0980．00+0．0487．33+0．0180．67+0．414082．67+0．0976．00+1．2486．00+0．0481．33+0．0186．67+0．0178．00+0．045083．33+0．0974．67+0．3785．33+0．0983．33+0．0986．67+0．0983．33+0．1750068．67+0．09??64．67+0．17?70．00+0．04?64．00+0．12?73．33+0．09??68．00+0．04

注：“*”plt;0.05，“**”plt;0.01。

1) 在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中平鋪2層濾紙，加入適量新配制抗生素溶液。在培養(yǎng)皿中均勻放入50粒處理后的白菜種子，蓋上皿蓋，每個處理重復(fù)3次[11]。在溫度為(25±1)℃的培養(yǎng)箱中，12 h暗培養(yǎng)，12 h光照培養(yǎng)，每天定時記錄萌發(fā)種子粒數(shù)，并適當補充抗生素溶液，保持濾紙和種子濕潤，每2 d更換抗生素溶液和濾紙，7 d后結(jié)束培養(yǎng)[12-13]。測定在不同抗生素的不同濃度溶液作用下，白菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及抗氧化酶活性。

2) 打開種子萌發(fā)袋折槽，在種子萌發(fā)袋上方紙芯形成的20個凹槽中放置20粒處理后的白菜種子，加入適量新配制的抗生素溶液，將種子萌發(fā)袋垂直放置在相應(yīng)支架上。在溫度為(25±1)℃的培養(yǎng)箱中，12 h暗培養(yǎng)，12 h光照培養(yǎng)，每2 d向萌發(fā)袋內(nèi)適當補充抗生素溶液，保持紙芯和種子濕潤，7 d后結(jié)束培養(yǎng)。計算在不同抗生素的不同濃度溶液作用下，白菜種子根伸長抑制率。

1.3 分析方法

1.3.1 白菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及根伸長抑制率的測定

發(fā)芽率(%)=供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(%)=3 d內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%[11]；

根伸長抑制率(%)=(對照組-處理組)/對照組×100%。

1.3.2 酶液的提取

取代表性處理白菜幼苗，用去離子水清洗3次后用液氮冷凍，加入適量預(yù)冷至4 ℃的Tris-HCl緩沖液(pH=7.0，內(nèi)含1 mmol/L EDTA)研磨成勻漿后，置于4 ℃冷凍離心機中，12 000 r/min離心25 min。取其上清液即得粗酶液，用于CAT、SOD、APX、GR活性測定[14-15]。

1.3.3 白菜種子CAT、SOD、APX、GR活性測定

過氧化氫酶(catalase，CAT，EC 1.11.1.6)活性采用紫外可見分光光度法進行測定[16]，30 s讀取OD 240 nm值1次，在240 nm處以每分鐘吸光值減少0.1的酶量為一個酶活單位[U/(g·min)]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，EC 1.1.15.1.1)活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定[16]，在560 nm處以抑制NBT光化還原50%為一個酶活單位(U/g)。測定抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX，EC 1.11.1.11)活力時[14,16]，每隔10 s在290 nm處測定一次吸光值，反應(yīng)時間為30 s，以每分鐘氧化1μmol ASA的酶量為一個酶活單位[μmol/(g·min)]。測定谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR，EC 1.6.4.2)活力時[14,16]，每隔30 s測定OD 340 nm值1次，以每分鐘消耗1μmol NADPH的酶量為1個酶活單位[μmol/(g·min)]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010軟件對實驗測得數(shù)據(jù)進行處理，并對數(shù)據(jù)進行單因素方差顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對白菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

由表1可看出，3種抗生素濃度≤50 mg/L時，白菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢無明顯變化，即在該實驗濃度范圍內(nèi)，3種抗生素對白菜種子萌發(fā)無明顯抑制或促進作用。由表1可知，用500 mg/L氯霉素處理后，白菜種子發(fā)芽率與對照組相比差異極顯著，發(fā)芽勢與對照組相比達差異顯著水平。用500 mg/L金霉素處理后，白菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢與對照組相比均達到差異顯著水平。用500 mg/L土霉素處理后，白菜種子發(fā)芽率與對照組相比達到差異極顯著水平，發(fā)芽勢與對照組相比差異不顯著。

2.2 抗生素對白菜種子根伸長的影響

從圖1可以看出，不同濃度、不同種類的抗生素對白菜種子根伸長抑制作用不同。0.5 mg/L氯霉素、0.5 mg/L金霉素、0.5～5 mg/L土霉素對根伸長有促進作用。5 mg/L氯霉素、金霉素開始抑制白菜根伸長，抑制率分別為12.0%、6.0%。在實驗濃度范圍內(nèi)，抗生素濃度越大，對白菜根伸長的抑制作用越大。以抗生素濃度為橫坐標，以白菜種子根伸長抑制率為縱坐標，得抗生素的回歸方程(見表2)。從表2可以看出，抗生素濃度對白菜根伸長抑制率之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。通過對比3種抗生素對白菜種子根伸長抑制率，可知3種抗生素對白菜種子萌發(fā)根伸長的抑制作用強弱順序為：氯霉素gt;金霉素gt;土霉素(圖1)。

圖1 抗生素對白菜種子根伸長抑制率的影響

表2 抗生素與小白菜種子根伸長抑制率的相關(guān)性

抗生素根伸長抑制率回歸方程R2p氯霉素I=0．1417C?0．1210．8557??金霉素I=0．0682C?0．24120．8753??土霉素I=0．054C?0．19870．8083?

注：I表示根長抑制率，C表示抗生素濃度，“*”plt;0.05，

“**”plt;0.01。

2.3 抗生素對白菜幼苗抗氧化酶活性的影響

白菜幼苗體內(nèi)CAT、SOD、APX、GR 4種抗氧化酶活性測定結(jié)果如圖2所示，同一抗生素不同濃度處理之間抗氧化酶活性差異顯著(plt;0.05，數(shù)據(jù)未列出)。氯霉素和土霉素在低于50 mg/L的濃度范圍內(nèi)，隨著抗生素濃度增加，白菜幼苗體內(nèi)CAT、SOD、APX、GR的活性呈現(xiàn)上升趨勢，當抗生素濃度為500 mg/L時，CAT、SOD、APX、GR的活性顯著下降，組間處理差異顯著。隨著土霉素濃度增加，白菜幼苗體內(nèi)SOD活力呈現(xiàn)下降趨勢，而CAT、APX、GR活力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。

3 討 論

采用保濕培養(yǎng)法，通過測定在不同濃度的氯霉素、金霉素和土霉素作用下，白菜種子萌發(fā)情況及白菜幼苗體內(nèi)的抗氧化酶活力，觀察抗生素對白菜種子萌發(fā)期的影響。結(jié)果表明，3種抗生素濃度為0.5～50 mg/L時，對白菜種子發(fā)芽率無明顯抑制或促進作用，當抗生素濃度升高至500 mg/L時，種子發(fā)芽率受到明顯抑制。3種抗生素濃度為0.5～50 mg/L時，對白菜種子發(fā)芽勢無明顯影響，在抗生素濃度為500 mg/L時，種子發(fā)芽勢才受到抑制。

圖2 抗生素污染對小白菜體內(nèi)抗氧化酶的影響

種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢可以作為研究抗生素對種子萌發(fā)影響的表觀參數(shù)，但不能全面反映種子萌發(fā)過程中的生理活性變化。白菜種子的根長可以作為種子生長的表觀參數(shù)，白菜幼苗根部直接與外部環(huán)境接觸，對其中的污染物響應(yīng)較為迅速，因此，種子萌發(fā)實驗經(jīng)常將根長作為衡量植物受外界污染物脅迫的表觀生理參數(shù)[17-19]。較低濃度的抗生素(0.5 mg/L氯霉素、0.5 mg/L金霉素、0.5～5 mg/L土霉素)對種子根伸長有一定促進作用，這與林琳等[20]的實驗結(jié)果有一定相似性。當抗生素濃度在白菜種子體內(nèi)的積累超出其生理承受范圍，白菜種子根伸長受到明顯抑制，且根伸長抑制率隨抗生素濃度增大而升高。由抗生素濃度和種子根伸長抑制率之間的回歸方程可知，抗生素濃度對白菜根伸長抑制率之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，此外，由于3種抗生素的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)之間存在差異，它們對白菜種子的影響機理不同。3種抗生素對白菜種子根伸長抑制作用的強弱順序為：氯霉素gt;金霉素gt;土霉素。

植物體在其正常代謝過程中會產(chǎn)生活性氧(ROS)，許多環(huán)境因子可誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧濃度改變，植物的抗逆性和抗氧化能力與植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)的保護功能有密切的關(guān)系[21]。CAT、SOD、APX和GR是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶保護系統(tǒng)中的主要酶類。CAT可以清除ROS[14,22]。SOD能夠清除氧自由基，與CAT共同作用保護植物免受損傷[14,23]。APX在抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中有重要的調(diào)節(jié)H2O2作用[24]。谷胱甘肽還原酶可以維持植物體內(nèi)還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽相對含量[25]，并與APX共同作用清除H2O2。通過測定3種抗生素在實驗設(shè)置濃度范圍內(nèi)的白菜幼苗抗氧化酶活性，發(fā)現(xiàn)抗生素濃度對白菜幼苗的抗氧化酶活力的影響表現(xiàn)為低濃度促進而高濃度抑制。由此說明，在低濃度抗生素溶液的誘導(dǎo)下，植物本身的抗氧化酶系統(tǒng)被激活，從而減少ROS對機體的損傷。但隨著抗生素濃度增大，植物體內(nèi)的抗氧化酶活性受到抑制，原因可能是抗生素濃度超出植物體的承受范圍，使植物體的抗氧化酶系統(tǒng)受到不同程度的破壞，降低了抗氧化酶活力，從而影響植物體的正常生長。

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(本欄目責任編輯：曾 勇)

Effect of Three Kinds of Antibiotics on the Germination ofChinese Cabbage Seeds

LIMeng,YANGLei,JIJiannan,FENGXiaona,HUANGRong,WENHongyu,GAOXiali,CAOLufen

2016-10-27

李 萌(1994—)，女，江蘇徐州人；本科在讀，研究方向：植物生理學(xué)；E-mail:2057680405@qq.com。

溫洪宇(1973—)，男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究；E-mail:wenhy2007@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.102

S 634

A

1001-4705(2017)03-0102-04