高 利， 郭 岑， 李欣然， 朱漢民， 陳宇航， 張思學(xué)

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030； 2.內(nèi)蒙古扎魯特旗農(nóng)牧業(yè)局北鎮(zhèn)獸醫(yī)院 ， 內(nèi)蒙古 通遼 028000)

咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)影響的研究

高 利1， 郭 岑1， 李欣然1， 朱漢民1， 陳宇航2， 張思學(xué)1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030； 2.內(nèi)蒙古扎魯特旗農(nóng)牧業(yè)局北鎮(zhèn)獸醫(yī)院 ， 內(nèi)蒙古 通遼 028000)

為了研究咪達(dá)唑侖對(duì)山羊各腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討咪達(dá)唑侖的作用部位及機(jī)制。將25只山羊隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組、誘導(dǎo)組、麻醉組、恢復(fù)Ⅰ組和恢復(fù)Ⅱ組。連續(xù)觀察山羊行為學(xué)變化，并于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采取腦組織，通過高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)的含量。結(jié)果顯示，咪達(dá)唑侖主要作用部位是大腦和腦干，使5-HT和5-HIAA的含量升高，NE和DA的含量降低。

咪達(dá)唑侖 ； 山羊 ； 5-HT ； 5-HIAA ； NE ； DA

咪達(dá)唑侖(Midazolam)作為新一代苯二氮卓類藥物，臨床療效好，不良反應(yīng)輕，成為目前發(fā)展較快的一類藥物，常用作抗焦慮、催眠、鎮(zhèn)靜[1]，在獸醫(yī)臨床多與其他藥物合用來增強(qiáng)效果[2-3]。咪達(dá)唑侖的治療效果和副作用是因?yàn)閷?duì)GABAA受體的作用，但咪達(dá)唑侖并不直接激活GABAA受體，和其他苯二氮卓類藥物一樣，它增強(qiáng)了神經(jīng)遞質(zhì)GABA對(duì)GABAA受體的作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了抑制效應(yīng)。5-HT、5-HIAA、DA和NE是機(jī)體內(nèi)重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用。反芻動(dòng)物腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定，對(duì)臨床診斷和基礎(chǔ)生理研究具有重要意義[4]。試驗(yàn)以山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，旨在研究咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，根據(jù)不同腦區(qū)內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在麻醉過程中的變化趨勢(shì)，探討咪達(dá)唑侖的作用部位及機(jī)制，為臨床麻醉中合理有效地配伍麻醉藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 臨床檢查健康的山羊25只，體重為12～16 kg，雌雄不限，購自哈爾濱市香坊區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，嚴(yán)格按照試驗(yàn)動(dòng)物要求進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

1.2 試驗(yàn)儀器及藥品 Waters 600高效液相色譜儀，Waters 2489UV檢測(cè)器，Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱，購自美國Waters公司；5-HT、5-HIAA、NE、DA、色譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)乙腈，均購自Sigma公司；純度≥98.0%；咪達(dá)唑侖，純度：99.8%，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室提供。

1.3 試驗(yàn)分組 將山羊隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、誘導(dǎo)組、麻醉組、恢復(fù)Ⅰ組和恢復(fù)Ⅱ組，每組5只。除對(duì)照組外的山羊按體重肌肉注射咪達(dá)唑侖14 mg/kg體重，對(duì)照組山羊按體重肌肉注射生理鹽水1.31 mL/kg體重。行為學(xué)變化分組標(biāo)準(zhǔn)：誘導(dǎo)期組：站立不穩(wěn)，倒地，翻正反射即將消失；麻醉期組：將動(dòng)物腹面朝上放置，給予輕微刺激，動(dòng)物仍不能翻回者為翻正反射消失；恢復(fù)Ⅰ期組：對(duì)麻醉后翻正反射消失的動(dòng)物，給予輕微的刺激，動(dòng)物即能自主翻回者，為翻正反射恢復(fù)；恢復(fù)Ⅱ期組：為翻正反射恢復(fù)后6 h。該期動(dòng)物基本蘇醒，能夠自由走動(dòng)，并主動(dòng)飲水和覓食。

1.4 腦組織樣品采取 處死山羊后，剪開頭皮，同時(shí)除去硬腦膜并鋸開頭蓋骨，小心分離出完整的腦組織，用4 ℃生理鹽水沖洗，除去附著的血液。在冰板上快速取雙側(cè)大腦皮層、小腦、丘腦、腦干和海馬，用濾紙吸干水分后放入凍存管中稱重，然后-80 ℃冰箱中保存。

1.5 定量方法 采用RP-HPLC外標(biāo)法測(cè)定，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可自動(dòng)計(jì)算峰面積或根據(jù)具體峰形進(jìn)行手動(dòng)積分。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將每個(gè)待測(cè)樣品的峰面積的平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可算出各自的濃度。

1.6 線性范圍和相關(guān)系數(shù) 精密量取單胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用提取液分別稀釋成2、5、10、50、100、200、500 ng/mL的對(duì)照液。取20 μL進(jìn)樣。以吸收峰的峰面積對(duì)應(yīng)含量作線性回歸，求得4種遞質(zhì)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.7 加樣回收率 取1份已知濃度的丘腦組織勻漿液樣品分成3份，分別加入等體積的低、中、高3種濃度單胺類混合標(biāo)準(zhǔn)液，按樣品的處理方法制樣并測(cè)定，所得的峰面積帶入到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，得到所測(cè)單胺濃度，按下面公式計(jì)算各相應(yīng)濃度的回收率：回收率(%)=測(cè)后單胺組織濃度/已知單胺組織濃度×100%。

1.8 精密度 (1)日內(nèi)差測(cè)定：同一濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液于1 d內(nèi)分別進(jìn)行4次重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定峰面積和變異系數(shù)；(2)日間差測(cè)定：對(duì)同一濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液分4 d 4次進(jìn)樣測(cè)定峰面積和變異系數(shù)。

1.9 最低檢測(cè)限的測(cè)定 取空白樣品，按照樣品處理程序處理后上機(jī)測(cè)定。另取多份空白樣品，分別加入不同的較低濃度(如0.25、0.5、1、2、5 ng/mL)的單胺混合標(biāo)準(zhǔn)液，按照樣品處理程序處理后上機(jī)測(cè)定，對(duì)比兩者，即可得出樣品中各單胺遞質(zhì)的最低檢測(cè)限。

1.10 數(shù)據(jù)分析 用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)。所有結(jié)果通過SPSS 19軟件數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)做單因素方差分析，Pgt;0.05為差異不顯著，Plt;0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)分離結(jié)果 在規(guī)定色譜條件下，4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)得到有效分離，保留時(shí)間為：NE(4.05 min)、DA(6.92 min)、5-HT(11.03 min)、5-HTAA(14.21 min)。各峰無干擾及拖尾現(xiàn)象。所得標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及樣品色譜圖見圖1和圖2。

圖1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 丘腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)樣品色譜圖

2.2 線性范圍 按指定色譜條件進(jìn)樣，以峰面積(Y)與標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程Y=aX+b。結(jié)果表明，4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在2-500 ng/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)0.99。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果如下。

表1 線性方程和相關(guān)系數(shù)(R2)

2.3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 回收率是反映從制樣到HPLC測(cè)量等環(huán)節(jié)誤差大小及間接反映測(cè)定準(zhǔn)確程度的一個(gè)重要指標(biāo)。由表中數(shù)據(jù)可知，NE、DA、5-HT和5-HTAA的平均回收率分別為94.73%、96.24%、100.23%和95.40%。結(jié)果表明，采用本試驗(yàn)的樣品處理方法，回收率高且穩(wěn)定，色譜條件可靠，符合試驗(yàn)要求。

2.4 最低檢測(cè)濃度 以引起3倍基線噪音的含量為最低檢測(cè)限，4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT、5-HIAA的最低檢測(cè)限分別是2 ng/mL、5 ng/mL、5 ng/mL和5 ng/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明，NE、DA、5-HT和5-HIAA 4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)日內(nèi)差變異系數(shù)分別為3.2%、3.5%、2.8%和3.7%；日間差變異系數(shù)分別為3.5%、3.1%、2.7%和3.8%。變異系數(shù)均在4.0%以下，表明該檢測(cè)方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好。

表2 加樣回收率結(jié)果

2.6 咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)5-HT的影響 如表3所示，山羊肌肉注射咪達(dá)唑侖后麻醉組大腦和腦干內(nèi)5-HT含量均顯著升高，與對(duì)照組比較分別升高了42.55%(Plt;0.01)和46.58%(Plt;0.01)；在恢復(fù)Ⅰ期和恢復(fù)Ⅱ期時(shí)，大腦和腦干內(nèi)5-HT含量均顯著恢復(fù)，同時(shí)與麻醉期比較差異顯著或極顯著(Plt;0.05或Plt;0.01)。其他腦區(qū)內(nèi)5-HT含量無顯著變化。

表3 咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)5-HT的影響 (n=5，ng/mL)

注：a **：與對(duì)照組比較Plt;0.01， 差異極顯著； *：與對(duì)照組比較Plt;0.05，差異顯著；b ##：與麻醉期比較Plt;0.01，差異極顯著； #：與對(duì)照組比較Plt;0.05，差異顯著，下表同

2.7 咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)5-HIAA的影響 如表4所示，山羊肌肉注射咪達(dá)唑侖后麻醉組大腦和腦干內(nèi)5-HIAA含量均顯著升高，與對(duì)照組比較分別升高了37.19%(Plt;0.01)和51.73%(Plt;0.01)；在恢復(fù)Ⅰ期和恢復(fù)Ⅱ期時(shí)，大腦和腦干內(nèi)的5-HIAA含量均顯著恢復(fù)，同時(shí)與麻醉期比較差異顯著或極顯著(Plt;0.05或Plt;0.01)。其他腦區(qū)內(nèi)5-HIAA含量無顯著變化。

表4 咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)5-HIAA的影響 (n=5，ng/mL)

2.8 咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)NE的影響 如表5所示，山羊肌肉注射咪達(dá)唑侖后，麻醉組大腦和腦干內(nèi)NE含量均顯著降低，與對(duì)照組比較分別降低了37.71%(Plt;0.01)和31.92%(Plt;0.01)；在恢復(fù)Ⅰ期和恢復(fù)Ⅱ期時(shí)，大腦和腦干內(nèi)NE的含量均顯著恢復(fù)，同時(shí)與麻醉組比較差異極顯著(Plt;0.01)。其他腦區(qū)內(nèi)NE含量無顯著變化。

表5 咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)NE的影響 (n=5，ng/mL)

2.9 咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)DA的影響 如表6所示,山羊肌肉注射咪達(dá)唑侖后，麻醉組大腦和腦干內(nèi)DA含量均顯著降低，與對(duì)照組比較分別降低了44.80%(Plt;0.01)和35.81%(Plt;0.05)；在恢復(fù)Ⅰ期和恢復(fù)Ⅱ期時(shí)，大腦和腦干內(nèi)DA含量均顯著恢復(fù)，同時(shí)與麻醉組比較差異極顯著(Plt;0.01)。其他腦區(qū)內(nèi)DA含量無顯著變化。

表6 咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)DA的影響 (n=5，ng/mL)

3 討論

組織液和體液中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的含量，能反映出生理和疾病的狀態(tài)，而腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定，對(duì)臨床診斷和基礎(chǔ)生理研究具有重要意義[4,5]。5-HT在大腦皮層、基底節(jié)和下丘腦的部分神經(jīng)元上起抑制作用，而對(duì)深部的神經(jīng)元常起到興奮作用。其參與痛覺調(diào)節(jié)、覺醒-睡眠周期調(diào)節(jié)和下丘腦-垂體的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等多種活動(dòng)。姚尚龍[6]等研究異丙酚不同麻醉深度下兔腦5-HT代謝水平的改變，結(jié)果顯示，大腦5-HT水平在麻醉后顯著增加。上述研究與本試驗(yàn)麻醉期腦組織中5-HT含量的變化趨勢(shì)相似。在恢復(fù)II期時(shí)腦組織中5-HT含量恢復(fù)至正常水平，推測(cè)咪達(dá)唑侖的作用時(shí)間短和順行性遺忘作用與其相關(guān)。有研究表明，給予大鼠嗎啡可使中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT的含量增加50%，阿片類藥物可以阻礙GABA能神經(jīng)元對(duì)于5-HT神經(jīng)元的抑制，從而導(dǎo)致5-HT釋放增多。但關(guān)于苯二氮卓類藥物對(duì)5-HT的影響變化未見報(bào)道，所以本試驗(yàn)中咪達(dá)唑侖使5-HT含量升高原因是否與5-HT受體有聯(lián)系尚需進(jìn)一步研究。

腦內(nèi)5-HIAA是由5-HT經(jīng)單胺氧化酶的氧化作用生成，在體內(nèi)5-HIAA隨著5-HT含量的變化呈現(xiàn)一定規(guī)律性的變化。劉紅亮[7]等應(yīng)用全麻藥異丙酚麻醉大鼠，觀察大腦皮層5-HT和其代謝產(chǎn)物5-HIAA的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，持續(xù)靜脈注射異丙酚可引起5-HT和5-HIAA的升高，停止注射后又很快降至用藥前的基礎(chǔ)水平。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，麻醉期5-HIAA在大腦和腦干中的含量顯著升高，恢復(fù)II期時(shí)5-HIAA含量恢復(fù)至正常水平。不同的麻醉鎮(zhèn)靜藥物如嗎啡、羥甲芬太尼等對(duì)腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響研究多證明麻醉藥物可使腦內(nèi)5-HIAA的含量升高。結(jié)合本次研究我們認(rèn)為咪達(dá)唑侖可增加大腦和腦干中5-HIAA的釋放作用，并提高神經(jīng)元興奮性，但作用機(jī)制是否與BZ受體激動(dòng)劑激活單胺氧化酶的活性有關(guān)還需進(jìn)一步的研究。

NE主要由交感節(jié)后神經(jīng)元和腦內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)末梢合成和分泌，主要激動(dòng)α受體，具有很強(qiáng)的血管收縮作用，可保證對(duì)重要器官的血液供應(yīng)。山羊肌肉注射咪達(dá)唑侖后，山羊大腦和腦干NE的含量在麻醉期顯著降低，在恢復(fù)II期時(shí)恢復(fù)至正常水平，其他腦區(qū)NE的含量沒有顯著變化。沈浩等[8]研究咪唑安定、丙泊酚對(duì)下丘腦室旁核去甲腎上腺素釋放和心率變異性的影響，發(fā)現(xiàn)可引起NE含量的顯著下降。本試驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相似，咪達(dá)唑侖可降低山羊大腦和腦干中NE的含量，分析原因可能是咪達(dá)唑侖作用于藍(lán)斑核的GABAA受體，導(dǎo)致NE能神經(jīng)元受到抑制，從而使NE釋放減少。

DA是一種神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，用來幫助細(xì)胞傳送脈沖的化學(xué)物質(zhì)，其參與調(diào)節(jié)肌緊張以及精神活動(dòng)。DA是合成NE的前體，抑制DA的釋放會(huì)導(dǎo)致NE的合成減少。山羊肌肉注射咪達(dá)唑侖后，大腦和腦干DA的含量在麻醉期顯著降低，此變化趨勢(shì)與張燕等[9]報(bào)道的小型豬復(fù)合麻醉劑對(duì)大鼠腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響相似。在恢復(fù)I期時(shí)大腦和腦干內(nèi)DA的含量都恢復(fù)至正常水平，其恢復(fù)的原因可能是由于BZ(苯=氮卓類化合物)受體激動(dòng)劑與神經(jīng)元中的Cl-同時(shí)作用于離子通道靶位，并加快藥物進(jìn)出于離子通道的速率所導(dǎo)致。

4結(jié)論

咪達(dá)唑侖的作用部位主要是在大腦和腦干，使大腦和腦干內(nèi)5-HT和5-HIAA的含量升高，大腦和腦干內(nèi)NE和DA的含量降低，提示單胺類神經(jīng)遞質(zhì)參與咪達(dá)唑侖全身麻醉作用的調(diào)控。

[1] Rajeev J, Rajeev K Y. Voltammetric behavior of sedative drug midazolam at glassy carbon electrode in solubilized systems[J].J Pharm Anal, 2012,2: 123-129.

[2] 陳鴻，潘寧玲. 全身麻醉誘導(dǎo)時(shí)咪唑安定與氯胺酮催眠相互作用的研究[J]. 臨床麻醉學(xué)雜志，2010,26(10):851-853.

[3] 李強(qiáng)，張衛(wèi)，謝積勝. 咪達(dá)唑侖聯(lián)合氯胺酮在巴馬香豬腮腺核磁共振檢查中的麻醉效果[J]. 廣西醫(yī)學(xué)，2015,37(9):1 219-1 221

[4] Chen P E, Geballe M T, Stansfeld P J,etal. Structural features of the glutamate binding site in recombinant NR1/NR2A N-methyl-D-aspartate receptors determined by site-directed mutagenesis and molecular modeling[J]. Mol Pharmacol,2005,67(5): 1 470-1 484．

[5] Gonzalez M M，Aston-Jones G. Light deprivation damages monoamine neurons and produces a depressive behavioral phenotype in rats[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(12): 4 898．

[6] 姚尚龍, 陳建顏. 不同麻醉深度下兔腦5-羥色胺代謝水平的變化[J]. 中華麻醉學(xué)雜志, 2003, 23(5): 358-360.

[7] 劉紅亮. 異丙酚中樞神經(jīng)遞質(zhì)作用機(jī)制[J]. 國外醫(yī)學(xué)麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊(cè), 2003, 19(2): 337-340.

[8] 沈浩, 龔蔚, 等. 咪唑安定、丙泊酚對(duì)下丘腦室旁核去甲腎上腺素釋放和心率變異性的影響[J]. 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2009, 2, 44-47.

[9] 張燕, 王洪斌, 范宏剛. 噻環(huán)乙胺及小型豬復(fù)合麻醉劑(XFM)對(duì)大鼠不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2010, 40(1): 93-97.

Effectsofmidazolamonmonoamineneurotransmittersindifferentencephalicregionsofgoats

GAO Li1, GUO Cen1, LI Xin-ran1, ZHU Han-min1, CHEN Yu-hang2, ZHANG Si-xue1

(1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China ； 2.Veterinary Hospital of north village, husbandry bureau of Jarud Banner， inner Mongolia，Tongliao 028000,China)

To study the effects of midazolam on monoamine neurotransmitters in different encephalic regions of goats, and then investigate the anesthetic mechanism of midazolam on the brain, 25 goats were divided randomly into control group, induction group, maintenance of anesthesia group, recovery-from-anesthesia I group, recovery-from-anesthesia II group. In different anesthetic periods, and the content of amino acid neurotransmitters in different encephalic regions of goats were detected by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that midazolam main site of the brain and brain stem, and the content of 5-HT and 5-HIAA was increased, and reducing the content of NE and DA was reduced.

Midazolam ; Goats ; 5-HT ; 5-HIAA ; NE ; DA

S857.144

A

0529-6005(2017)10-0102-05

2017-04-10

黑龍江省教育廳項(xiàng)目(12531016)

高利(1972-)，男，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物臨床麻醉，E-mail：gaoli43450@163.com