趙瑞宏 ， 張丹俊 ， 戴 銀 ， 沈?qū)W懷 ， 潘孝成 ， 胡曉苗 ， 侯宏艷 ， 周學(xué)利

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

禽腺病毒AH株的分離與鑒定

趙瑞宏 ， 張丹俊 ， 戴 銀 ， 沈?qū)W懷 ， 潘孝成 ， 胡曉苗 ， 侯宏艷 ， 周學(xué)利

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

為獲得禽腺病毒毒株，將臨床疑似Ⅰ群禽腺病毒感染病例的肝組織，通過接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，用PCR方法對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，對(duì)測(cè)定的序列在NCBI網(wǎng)上進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，從病料可分離出病毒，用PCR方法特異性地?cái)U(kuò)增出了與設(shè)計(jì)片段大小相一致的片段，序列分析表明，分離株序列與禽腺病毒SD1-15分離株序列同源性99%，說明分離株為Ⅰ群禽腺病毒血清4型。

禽腺病毒 ； 分離 ； 鑒定

Ⅰ群禽腺病毒病最早于1987年發(fā)生于臨近巴基斯坦卡拉奇的安格拉地區(qū)，因此又稱“安格拉病”。在短短一年內(nèi)，本病迅速傳播到巴基斯坦地區(qū)的多數(shù)肉仔雞群。我國(guó)1988年山東即有Ⅰ群禽腺病毒的報(bào)道[1]，近兩年病毒毒力增強(qiáng)，能引起3～6周齡雞群發(fā)病，病死率超過30%，2015年，安徽淮北發(fā)現(xiàn)有雞群感染Ⅰ群禽腺病毒，2016年蔓延至淮南、合肥等地區(qū)，現(xiàn)將該病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 UNlQ-10柱式病毒基因組DNA抽提試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；2×TaqMastermix和MarkerⅦ,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；0.22 μm一次性濾器，購(gòu)自Millipore公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。雞胚購(gòu)自山東無特定病原雞實(shí)驗(yàn)種雞場(chǎng)的SPF種蛋孵化至9～11日齡。20日齡SPF雞為SPF種蛋孵化后隔離飼養(yǎng)。

病料采自安徽省淮北、淮南和合肥等地區(qū)的多個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)病雞群。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀及剖檢觀察 記錄2015年11月以來，送檢至本所獸醫(yī)臨床診斷指導(dǎo)中心的發(fā)病雞的臨床癥狀及其病理變化。

1.2.2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè) 無菌采取病(死)雞的肝臟、脾臟、腎臟組織，接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、鮮血瓊脂平板等培養(yǎng)基，置37 ℃溫箱培養(yǎng)。

1.2.3 病料的采集與病毒分離[2]采集病雞肝臟、脾臟和腎臟，按1∶4加滅菌生理鹽水研磨成乳狀，凍融3次，8 000 r/min離心10 min，取上清，加入終濃度為2 000 IU/mL(μg)青霉素和鏈霉素 37 ℃作用1 h后，0.22 μm微孔濾膜除菌。尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，每胚接種0.2 mL，37 ℃孵化，收集24 h～120 h死亡雞胚的尿囊液。

1.2.4 分離毒血凝性測(cè)定 按文獻(xiàn)[3]介紹的方法對(duì)分離的雞胚尿囊液進(jìn)行血凝性測(cè)定。

1.2.5 病毒核酸的提取 分別取200 μl死亡雞胚尿囊液和對(duì)照雞胚尿囊液，按UNlQ-10柱式病毒基因組DNA抽提試劑盒說明書所述方法提取病毒DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 PCR檢測(cè)[4]參照GenBank上登錄的腺病毒SDSX-15株(登錄號(hào)：KU877435.1)的序列，應(yīng)用DNAStar設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-GATGCGCGGGTGGTCCTTC-3′，下游引物：5′-AGTTGTTGCGCACGGCTTCC-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增：取2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(20 mmol/L)各1.0 μL，病毒DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL混勻。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增效果。

1.2.7 序列測(cè)定與比對(duì) 將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進(jìn)行同源性檢索。

1.2.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn) SPF種蛋孵化后隔離飼養(yǎng)至20日齡分成兩組，每組10只，攻毒組經(jīng)肌肉注射接種雞胚尿囊液毒，對(duì)照組接種滅菌生理鹽水，接種劑量均為0.2 mL/只。觀察并記錄攻毒組和對(duì)照組雞群在接種后的精神狀態(tài)、采食量和死亡情況，剖檢并觀察死亡雞的病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床特征 主要臨床癥狀表現(xiàn)為：4-6周齡突然發(fā)病，精神沉郁，羽毛松亂，腹瀉，貧血，消瘦，最后死亡。

剖檢病變主要見于心臟和肝臟，表現(xiàn)心包積液，膠胨樣(見中插彩版圖1)，肝臟腫大、質(zhì)脆、易碎，有的會(huì)出現(xiàn)肝周炎；脾臟有白色壞死點(diǎn)，氣管常有較多黏液，肺臟淤血，腎呈樹枝狀充血；有的腺胃有出血點(diǎn)。

2.2 病毒分離 病料接種各種培養(yǎng)基平板，在 37 ℃培養(yǎng)72 h后，均無細(xì)菌生長(zhǎng)。病料接種雞胚后，雞胚在72 h后出現(xiàn)死亡，收集72 h～120 h死亡的雞胚尿囊液。將此分離毒株命名為Anhui(簡(jiǎn)稱AH)。

2.3 尿囊液血凝性測(cè)定 收獲的雞胚尿囊液作常規(guī)血凝試驗(yàn)(HA)，結(jié)果顯示,所收集的尿囊液均無血凝性，證明不是禽流感和新城疫等有血凝活性的病毒。

2.4 PCR檢測(cè) 用腺病毒特異性的的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1%瓊脂糖凝膠電泳，雞胚尿囊液和雞病料均可見1條大小約為500 bp的特異條帶(見圖2)。

圖2 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.5 序列測(cè)定與比對(duì) 將測(cè)得的基因序列用BLAST(http:// blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果表明,所測(cè)序列與腺病毒SD1-15株、SDXT4-15株和SDSX1株序列相似性為99%(見圖3)。

圖3 所測(cè)序列檢索結(jié)果

2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 攻毒組雞群第2天出現(xiàn)精神沉郁,羽毛蓬亂,采食量減少，第3天死亡2只，第4天死亡1只。對(duì)照組沒有死亡，精神正常，采食量未發(fā)生變化。剖檢死亡雞只可見心包積液，肝腫大、淤血,呈土黃色,質(zhì)脆易碎,與禽腺病毒感染雞剖檢病變一致。

3 討論

3.1 Ⅰ群禽腺病毒能引起鵪鶉支氣管炎以及雞包涵體肝炎[5-6]，也可以導(dǎo)致心包積水綜合征(HPS),在3～5周齡的肉雞中常出現(xiàn)[7-9]。Adrych K認(rèn)為,禽腺病毒有可能引起人以及動(dòng)物的肥胖[10-11]。我國(guó)1988年山東即有Ⅰ群禽腺病毒的報(bào)道[1]，近兩年病毒毒力增強(qiáng)，能引起3～6周齡雞群發(fā)病，病死率超過30%，2015年蔓延至安徽淮北地區(qū)，2016年淮南、合肥等地區(qū)均有發(fā)生，本研究通過細(xì)菌培養(yǎng)、雞胚接種、PCR鑒定和測(cè)序，說明所分離的病毒為Ⅰ群禽腺病毒血清4型，為Ⅰ群禽腺病毒疫苗的研制打下基礎(chǔ)。

3.2 在引物設(shè)計(jì)時(shí)，根據(jù)鄰近省份流行株進(jìn)行設(shè)計(jì)，由于分離株與流行株相近，故更容易擴(kuò)增出預(yù)期片段。同時(shí)由于分離株與流行株相近，用其生產(chǎn)滅活疫苗或培育弱毒疫苗用于免疫雞群，將會(huì)對(duì)雞群起到更好的保護(hù)作用。

3.3 從流行情況看，本次疫情擴(kuò)散快，流行范圍廣，在短短半年時(shí)間內(nèi)就迅速波及至全省，這也與新發(fā)病特點(diǎn)相符，由于雞體內(nèi)缺乏抵御新發(fā)病的中和抗體，一旦感染即會(huì)迅速傳播。從送檢的病例可以看出，本病一年四季均有發(fā)生，發(fā)病的主要是一些中小型企業(yè)及散養(yǎng)戶，說明中小型企業(yè)及散養(yǎng)戶在平時(shí)的飼養(yǎng)管理和生物安全方面重視不夠，仍需進(jìn)一步加強(qiáng)。

3.4 防控方面，從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所官網(wǎng)查詢可知，針對(duì)Ⅰ群禽腺病毒的疫苗，還無生產(chǎn)批文?？刂拼瞬≈饕揽可锇踩胧?一)控制人員和車輛流動(dòng)，加強(qiáng)雞場(chǎng)周圍及人員和車輛的衛(wèi)生消毒工作，努力把該病控制在雞場(chǎng)之外；(二)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好常規(guī)疫苗免疫工作，提高飼料營(yíng)養(yǎng)水平，增強(qiáng)雞體的抵抗力；(三)一旦發(fā)病，要立即采取隔離消毒措施，避免病毒在雞群中擴(kuò)散。

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IsolationandIdentificationofFowlAdenovirusAHStrain

ZHAO Rui-hong ， ZHANG Dan-jun ， DAI Yin ， SHEN Xue-huai ， PAN Xiao-cheng ， HU Xiao-miao ， HOU Hong-yan ， ZHOU Xue-li

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Anhui Academy of AgriculturalSciences, Hefei 230031,China)

In order to obtain the virus of fowl adenovirus,liver tissue collected from chicken with clinical suspected fowl adenovirus infection. we isolate virus throughinoculate collected specimens to SPF chicken embryo,and then identify the collected specimens and chicken embryo allantoic fluid using PCR. The PCR product was sequenced.The results showed that the allantoic fluid was PCR positive for duck flavivirus. The sequence was 99% identity between tested virus and fowl adenovirus 4 isolate SD1-15 hexon protein gene.This indicated that the isolated virus was fowl adenovirus.

fowl adenovirus ； isolation ； identification

ZHANG Dan-jun

S855.3

A

0529-6005(2017)10-0045-03

2016-12-19

國(guó)家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系合肥綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目(CARS-41-S13)

趙瑞宏(1973-)，男，副研究員，碩士，主要從事畜禽傳染病學(xué)研究,E-mail:zrhkdy@aliyun.com

張丹俊，E-mail: zhangdj694@sina.com