張 艷 ， 周慶民 ， 馮萬宇 ， 徐 馨 ， 黃 健 ， 王 新 ， 李蘭蘭 ，鄭曉星 ， 寧秀云 ， 李廣興

(1.黑龍江省獸醫(yī)科學研究所 ， 黑龍江 齊齊哈爾 161006 ；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 ，黑龍江 哈爾濱 150030 ；3.黑龍江省訥河市動物防疫站 ， 黑龍江 齊齊哈爾 161300)

重組產(chǎn)氣莢膜梭菌plc毒素基因植物乳酸桿菌的構(gòu)建

張 艷1,2， 周慶民1， 馮萬宇1， 徐 馨1， 黃 健1， 王 新1,2， 李蘭蘭2，鄭曉星2， 寧秀云3， 李廣興2

(1.黑龍江省獸醫(yī)科學研究所 ， 黑龍江 齊齊哈爾 161006 ；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 ，黑龍江 哈爾濱 150030 ；3.黑龍江省訥河市動物防疫站 ， 黑龍江 齊齊哈爾 161300)

依據(jù)乳酸菌的腸道益生作用，選擇產(chǎn)氣莢膜梭菌關(guān)鍵致病因子α毒素/磷脂酶C為抗原，構(gòu)建產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素去除信號肽的plc基因片段重組植物乳桿菌，利用植物乳酸菌穿梭載體pSIP409構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP409-plc，經(jīng)雙酶切鑒定和序列測定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞并進行SppIP誘導(dǎo)表達。Western Blot證明重組蛋白表達成功，并且主要以包涵體形式存在，plc重組蛋白相對分子質(zhì)量分別為40 kDa。重組質(zhì)粒pSIP409-plc分別電轉(zhuǎn)化植物乳桿菌NC8細胞，PCR和雙酶切鑒定正確后進行SppIP誘導(dǎo)表達。Western Blot和間接免疫熒光鑒定表明，構(gòu)建的重組植物乳酸桿菌具有誘導(dǎo)分泌plc蛋白的能力，可作為黏膜免疫的候選抗原。

產(chǎn)氣莢膜梭菌 ； plc基因 ； 植物乳酸桿菌 ； 表達

隨著養(yǎng)禽業(yè)中抗生素禁用，壞死性腸炎的發(fā)病率明顯上升，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失，所以本病預(yù)防變得尤為重要[1-2]。能導(dǎo)致家禽壞死性腸炎的產(chǎn)氣莢膜梭菌主要是A型和C型[3]，α毒素為所有類型產(chǎn)氣莢膜梭菌都分泌的外毒素，plc基因為α毒素去除信號肽的片段。α毒素可破壞細胞膜的完整性，主要是通過第二信使途徑最終使受感染的機體組織缺氧，營造適合菌體的生長的條件，導(dǎo)致腸道菌群失衡[4]。

同時，由于乳酸桿菌作為保護性抗原呈遞有效活載體不僅能夠誘發(fā)機體全身性免疫應(yīng)答，更為明顯的是能誘導(dǎo)機體的局部黏膜免疫[5]，所以本試驗依據(jù)植物乳桿菌的腸道益生作用，利用其作為呈遞產(chǎn)氣莢膜梭菌關(guān)鍵毒素抗原α毒素(plc)的載體，研制出口服重組活菌疫苗為NE疫苗早日應(yīng)用于實踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體LactobacillusplantarumNC8和穿梭表達載體pSIP409由吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院王春風教授饋贈；克隆宿主菌E.coliJM109、表達宿主菌E.coliBL21(DE3)、plc陽性質(zhì)粒pGEX-plc由本實驗室保存；鼠抗產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因單抗由本實驗室制備。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑ExTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、蛋白質(zhì)及核酸分子質(zhì)量標準，均購自寶生物工程(大連)有限公司；IPTG，購自Amresco公司；溴化乙錠、4-氯-1-萘酚、紅霉素，購自Sigma公司；HRP標記山羊抗兔IgG、FITC標記山羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；MRS培養(yǎng)基，購自北京索萊寶科技有限公司；SppIP由上海強耀公司合成；其他常規(guī)試劑為分析純。

1.3 重組體pSIP409-plc的構(gòu)建 采用HindIII和EcoRI分別雙酶切陽性克隆質(zhì)粒pGEX-plc和乳酸桿菌pSIP409載體質(zhì)粒，利用凝膠回收純化試劑盒對目的基因plc和載pSIP409片段分別回收純化后，以T4 DNA連接酶進行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109中，提取質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定，取適量經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定初步判定為陽性的重組菌液，送至哈爾濱博仕生物科技有限公司進行序列測定。

表1 擴增plc基因的引物序列

1.4 重組質(zhì)粒pSIP409-plc的轉(zhuǎn)化 取測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pSIP409-plc和載體質(zhì)粒pSIP409各1 μL轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達感受態(tài)細胞BL21中。挑取單個菌落接種至3 mL Em+抗性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。以菌液為模板進行PCR鑒定。將陽性質(zhì)粒pSIP409-plc采用電穿孔法轉(zhuǎn)入新制備的植物乳酸桿菌感受態(tài)中，調(diào)節(jié)電穿孔儀的電壓和時間分別為1 890 V和1.1 ms。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物置于10 μg/mL Em+抗性的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧培養(yǎng)3 h，涂布于MRS固體培養(yǎng)基(Em+10 μg/mL)，30 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h至形成單菌落。挑取單菌落克隆，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化后重組乳酸桿菌的質(zhì)粒，采用PstⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定。

1.5 plc蛋白的表達

1.5.1 在大腸桿菌系統(tǒng)的表達 將PCR鑒定陽性的重組表達菌按1∶100(v/v)接種于50 mL Em+抗性LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h～8 h。當培養(yǎng)物的OD600 nm值達0.4～0.6時，取出1 mL菌液作為誘導(dǎo)前(0 h)對照，置于4 ℃暫時保存。向剩余菌液中加入誘導(dǎo)劑SppIP，使其終濃度達2 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔6 h(即誘導(dǎo)后第6、12、18、24、30 h和36 h)取出1 mL菌液，置于4 ℃暫時保存。將各小時菌液進行10 000 r/min離心5 min收集細菌沉淀，加入20 μL PBS懸起沉淀后加入等量2×SDS上樣緩沖液(含200 mmo1/L DTT)混勻，煮沸10 min，用于10 %凝膠SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE分析后將凝膠電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)進行Western Blot鑒定，NC膜經(jīng)3%脫脂乳(TTBS)封閉1 h，TTBS洗滌3次，加入適當稀釋的鼠抗產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因單克隆抗體中進行孵育，室溫振蕩40 min，TTBS洗滌3次，將NC膜放入經(jīng)TTBS適當稀釋的HRP標記山羊抗鼠IgG中孵育，室溫振蕩40 min，TTBS洗滌3次，四氯萘酚顯色。

1.5.2 在植物乳酸桿菌系統(tǒng)的表達 將重組乳酸菌pSIP409-plc接種于5 mL含10 μg/mL Em+抗性的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧靜置培養(yǎng)過夜。取1 mL接種于20 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧靜止培養(yǎng)至OD600 nm為0.3，在培養(yǎng)基中添加SppIP誘導(dǎo)肽，每隔6 h取一次菌液，取5次。以同樣的方法誘導(dǎo)含空質(zhì)粒pSIP409的乳酸菌培養(yǎng)30 h后作對照。將各個時間誘導(dǎo)收獲的菌液均調(diào)至OD600 nm為0.6～0.8，取菌液2 mL，12 000 r/min離心10 min，收集菌體。適量PBS懸起菌體后超聲裂解，按1.5.1方法進行SDS-PAGE和Western Blot鑒定。

1.6 間接免疫熒光對plc蛋白的表達進行定位 采用IFA法對重組菌pSIP409-plc誘導(dǎo)后目的蛋白的表達進行分析。分別取500 μL經(jīng)誘導(dǎo)的重組植物乳桿菌和經(jīng)誘導(dǎo)的含空質(zhì)粒的pSIP409植物乳桿菌，5 000 r/min離心5 min，菌體沉淀用無菌PBS充分洗滌3次，5 000 r/min離心5 min，棄上清；加入PBS稀釋的產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因單克隆抗體作為第一抗體，混和均勻，37 ℃水浴作用60 min，5 000 r/min 離心5 min，菌體沉淀用無菌PBS充分洗滌3次，5 000 r/min離心5 min，棄上清；加入PBS稀釋的FITC標記羊抗鼠IgG熒光二抗，懸浮混合后37 ℃作用60 min 5 000 r/min 離心5 min，菌體沉淀用無菌PBS洗滌3次，5 000 r/min 離心 5 min，棄上清；菌體沉淀懸浮于400 μL的PBS中，用接種環(huán)取適量涂片，自然干燥后，熒光顯微鏡觀察菌體表面熒光反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 plc基因與pSIP409的重組 將回收純化的plc基因片段與乳酸桿菌載體片段連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP409-plc，如圖1。采用PstⅠ和XhoⅠ對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行酶切，得到約為6 262k bp和2 261 bp的2個片段，如圖2，與預(yù)計大小相符，表明陽性重組質(zhì)粒pSIP409-plc構(gòu)建成功。

圖1 pSIP409-plc重組菌的菌液PCR鑒定

圖2 重組質(zhì)粒pSIP409-plc的雙酶切鑒定

2.2 重組質(zhì)粒pSIP409-plc序列測定 測序結(jié)果進行BLAST和MegAlign分析，重組質(zhì)粒pSIP409-plc的核苷酸序列與登錄號為HQ585981.1的產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因片段的同源性達到99%，與參考序列EU143239.1的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均達到99%，共有2處堿基、1處氨基酸發(fā)生突變，均為無疑義突變，表明重組質(zhì)粒pSIP409-plc構(gòu)建成功。

2.3 重組plc蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達 重組菌pSIP409-plc誘導(dǎo)后，菌體裂解經(jīng)SDS-PAGE電泳和NC膜轉(zhuǎn)印后，分別與鼠抗產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因單克隆抗體和HRP標記山羊抗小鼠IgG作用，結(jié)果表明，重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后，在40 kDa位置出現(xiàn)一條清晰且單一的目的條帶，說明蛋白表達正確，如圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pSIP409-plc在大腸桿菌中的表達

2.4 重組plc蛋白在植物乳桿菌中的誘導(dǎo)表達

2.4.1 pSIP409-plc的電轉(zhuǎn)化 以重組質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)10 μg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖4，在目的位置1 134 bp處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖4 重組質(zhì)粒pSIP409-plc PCR鑒定

2.4.2 重組plc蛋白在植物乳酸菌中的表達 菌體沉淀經(jīng)超聲裂解后，裂解上清進行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至NC轉(zhuǎn)移膜上，進行蛋白印跡分析，如圖5中可見在目的位置有1條明顯的蛋白印跡帶，大小為40 kDa，而以含有載體pSIP409的裂解上清作為陰性對照的乳酸菌經(jīng)蛋白印跡分析后無印跡帶，表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSIP409-plc成功轉(zhuǎn)入植物乳酸菌內(nèi)表達了plc蛋白，且具有反應(yīng)原性。

圖5 重組質(zhì)粒pSIP409-plc在乳酸菌中的表達

2.5 表達plc蛋白的重組植物乳酸菌的間接免疫熒光鑒定 重組植物乳酸菌pSIP409-plc/L.plantarum進行IFA試驗結(jié)果表明，經(jīng)熒光顯微鏡檢查可見經(jīng)SppIP誘導(dǎo)后的重組菌分別可以與plc單克隆抗體結(jié)合，菌體表面出現(xiàn)明顯的黃綠色熒光(圖6A)，未誘導(dǎo)的重組菌pSIP409-plc/L.plantarum不與plc單克隆抗體結(jié)合，菌體表面未發(fā)現(xiàn)綠色熒光(圖6B)。由此表明，重組植物乳酸菌表達的外源蛋白位于菌體的表面。

圖6 免疫熒光鑒定目的蛋白的表達 (40×)

3 討論

α毒素是幾乎所有產(chǎn)氣莢膜梭菌都能產(chǎn)生的一種多功能性金屬酶，是典型的致死性毒素，近20年來，α毒素被認定是養(yǎng)禽業(yè)壞死性腸炎的主要致病因素。α毒素具有磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)和鞘磷脂酶(Sphingomyelinase)活性，不僅能水解紅細胞、血小板、白細胞、內(nèi)皮細胞和肌細胞的膜磷脂，導(dǎo)致細胞膜裂解，而且具有其他細胞毒性[6-8]，包括出血、壞死[9]和顯著的致死性。本試驗選擇α毒素(plc)基因作為主要免疫抗原基因。參考產(chǎn)氣莢膜梭菌plc(序列號為HQ585981.1)基因的核苷酸序列，設(shè)計兩對引物。同時參考植物乳酸菌載體pSIP409的限制性內(nèi)切酶位點序列，在上游和下游引物的的5′端插入一個限制性酶切位點和保護性堿基序列，將目的基因與載體pSIP409連接后進行菌液PCR和雙酶切鑒定，測序比對結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pSIP409-plc的核苷酸序列與登錄號為HQ585981.1的產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因片段的同源性達到99%，與參考序列產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124(CP000246.1)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均達到99%，共有2處堿基發(fā)生突變，1處氨基酸發(fā)生突變，表明重組質(zhì)粒pSIP409-plc構(gòu)建成功。

重組蛋白的表達，首先將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒在大腸桿菌系統(tǒng)進行表達。先將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coilBL21表達菌，鑒定后用SppIP進行誘導(dǎo)表達，Western Blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達的蛋白與產(chǎn)氣莢膜梭菌plc單克隆抗體反應(yīng)分別在40 kDa處出現(xiàn)單一且清晰的條帶，證明重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中成功表達，氨基酸突變并沒有影響所表達蛋白的免疫原性。然后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入植物乳酸菌表達系統(tǒng)，雖然將質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸菌表達系統(tǒng)的方法很多，但是普遍存在時間長、效率低、不穩(wěn)定等特點，所以一般采用操作簡單且效率高的電轉(zhuǎn)化法。但是，能影響電轉(zhuǎn)化的因素有很多。首先，要有適當?shù)馁|(zhì)粒DNA濃度，濃度過低時DNA分子過少不能產(chǎn)生高轉(zhuǎn)化率，而濃度過高時DNA分子過飽和又不利于轉(zhuǎn)化[10]；其次，合理的電場強度，電壓過低細胞難以極化使DNA不能進入，而電壓過高時細胞會過度損傷導(dǎo)致死亡[11]；最后，恰當?shù)拿}沖時間，本實驗選擇Eppendorf細菌酵母電轉(zhuǎn)儀，可以根據(jù)所選電壓自動調(diào)整合適的脈沖時間。經(jīng)鑒定電轉(zhuǎn)化成功后，使用SppIP進行植物乳酸菌表達系統(tǒng)的誘導(dǎo)，使用Western Blot鑒定后證明重組蛋白在植物乳酸菌中表達成功，間接免疫熒光實驗同樣證明了蛋白的表達。為重組乳酸菌進行免疫和誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。試驗選取的表達載體pSIP409屬pSIPP表達系統(tǒng)，它表達的基因具有可控性，可以避免機體發(fā)生免疫耐受[10]，但是同時乳酸菌表達系統(tǒng)一直以來存在一個缺點，即表達量低，以后的疫苗研究中可以著重于乳酸菌載體的改造來提高抗原表達量，使乳酸菌的免疫產(chǎn)生更好的免疫效果。

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ConstructionofrecombinantLactobacillusplantarumcontainingplcgeneofClostridiumperfringens

ZHANG Yan1,2， ZHOU Qing-min1， FENG Wan-yu1， XU Xin1， HUANG Jian1， WANG Xin1,2， LI Lan-lan2， ZHENG Xiao-xing2， NING Xiu-yun3， LI Guang-xing2

(1. Heilongjiang Veterinary Science Research Institute, Qiqihar 161006, China;2.College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;3.Animal epidemic prevention station of Nehe, Qiqihar 161300, China)

In this study, according to the intestinal effervescent effect of lactic acid bacteria, the key pathogenic factor α-toxin / phospholipase C was selected as the antigen to construct the plc gene fragment of Clostridium perfringens alpha toxin by removing the signal peptide. The recombinant plasmid pSIP409-plc was constructed by using pSIP409, which was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells and identified by SppIP induction. Western Blot demonstrated that the recombinant protein was successfully expressed and contained mainly in inclusion bodies. The relative molecular mass of plc recombinant protein was 40 kDa. The recombinant plasmid pSIP409-plc was transformed into Lactobacillus plantarum NC8 cells by PCR and digested with double digestion. Western Blot and indirect immunofluorescence showed that the constructed recombinant Lactobacillus plantar had the ability to induce plc protein secretion and could be used as candidate antigen for mucosal immunization.

Clostridiumperfringens; plc gene ;Lactobacillusplantarum; express

LI Guang-xing

S858.31

A

0529-6005(2017)10-0031-04

2016-07-27

張艷(1987-)，研究實習員，碩士，研究方向為基礎(chǔ)獸醫(yī)學，E-mail: zhangyanyan008@163.com

李廣興， E-mail:liguangxing1968@hotmail.com