楊姍姍 ， 范瑞文 ， 焦丁興 ， 董常生

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山西 太谷 030801 ； 2.河北省清河縣農(nóng)業(yè)局 ，河北 清河 054000)

黑色素細(xì)胞中過量表達(dá)lpa-miR-nov-66對TYRP2的影響

楊姍姍1， 范瑞文1， 焦丁興2， 董常生1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山西 太谷 030801 ； 2.河北省清河縣農(nóng)業(yè)局 ，河北 清河 054000)

本研究旨在探討lpa-miR-nov-66對黑色素生成相關(guān)基因TYRP2的影響。采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，在羊駝黑色素細(xì)胞中過表達(dá)lpa-miR-nov-66，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)技術(shù)和免疫印跡法(western blotting)技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染lpa-miR-nov-66后黑色素細(xì)胞內(nèi)TYRP2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)差異。RT-PCR結(jié)果顯示：TYRP2的部分片段擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為151 bp。qRT-PCR和免疫印跡(western blotting)結(jié)果顯示：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組TYRP2在mRNA表達(dá)水平顯著降低，降低0.44倍；蛋白表達(dá)水平也顯著降低，降低0.78倍。結(jié)果表明，lpa-miR-nov-66可以影響TYRP2的表達(dá)，可能參與了動物毛色的形成過程。

mircoRNA ; lpa-miR-nov-66 ; 黑色素細(xì)胞 ; TYRP2

數(shù)百年來，動物飼養(yǎng)者一直在探討以行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)特征為目標(biāo)的表型變化。其中毛用動物(羊駝和綿羊)的毛色得到了相當(dāng)大的重視[1]。動物毛色主要由沉著在皮膚內(nèi)黑色素的數(shù)量及其種類決定。動物黑色素主要分為真黑色素和褐黑色素兩種，兩者的相對數(shù)量及分布決定了動物皮膚及被毛的顏色[2]。許多研究已經(jīng)明確了基因和microRNAs (miRNAs) 在人類和其他脊椎動物毛發(fā)和皮膚顏色中的重要作用[3]。microRNAs (miRNAs)，一種小RNA分子，長度在22～25 nt，是調(diào)控大多數(shù)細(xì)胞生物過程的必需因子，可以調(diào)節(jié)人類大約三分之一的蛋白質(zhì)編碼基因[4-5]。因此對miRNAs作用的研究顯得極為重要。miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控主要有兩種方式，一種是加速靶向基因mRNA的降解，一種是阻礙靶向基因mRNA的翻譯，而哺乳動物主要是以后者為主[6]。許多研究表明，miRNAs與調(diào)控動物毛色基因有相互作用關(guān)系。例如Zhu等通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-25抑制了MITF的表達(dá)，同時黑色素含量也呈現(xiàn)降低的趨勢[7]。Dong等人通過通過顯微注射的方法將miR-137注射到C57黑色小鼠胚胎內(nèi)，發(fā)現(xiàn)后代的轉(zhuǎn)基因小鼠的毛色明顯變淺[8]。實(shí)驗(yàn)室前期通過對白色和棕色羊駝皮膚的深度測序，獲得了一系列可能參與毛色調(diào)控的mircoRNAs。lpa-miR-nov-66就是其中的一個[9]。本文通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在羊駝黑色素細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)lpa-miR-nov-66，以探究其過量表達(dá)對黑色素相關(guān)基因TYRP2的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基(Sciencell公司，美國)，TRIZol(Invitrogen公司，美國)；Plasmid 提取試劑盒(Qiagen公司，美國)；根據(jù)lpa-miR-nov-66序列合成的真核表達(dá)載體(Invitrogen公司，美國)；RT-PCR Kit (TaKaRa公司)，TYRP2多克隆兔抗抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗 (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；總蛋白提取試劑盒 (北京碧云天生物技術(shù)研究所)；蛋白Marker (Fermentas公司，美國)；ECL發(fā)光試劑盒 (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 羊駝黑色素細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供[10]。從液氮中取出保存的綿羊黑色素細(xì)胞，復(fù)蘇后，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至90%左右時進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 接種106個/孔細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至60%～75%時，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其比例為轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒=1 μl∶3μg。轉(zhuǎn)染6 h后，用含有兩倍血清的培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染，12 h后移去兩倍血清的培養(yǎng)基，用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)56 h后收取樣品。

1.2.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)56 h，用TRIZol法提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的總RNA，并用Nanodrop1000測其品質(zhì)與濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成 Real-time PCR檢測 利用Premier 3.0 在線軟件，根據(jù)NCBI提交的羊駝TYRP2的序列設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，并將β-actin設(shè)為內(nèi)參引物(見表1)。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

1.2.5 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)體系的建立 按照RT-PCR Kit說明書操作，每個樣品3個重復(fù)，反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，循環(huán)數(shù)為40個，終延伸72 ℃ 10 min。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用△△Ct法：

目的基因的相對表達(dá)水平=

△Ct(試驗(yàn)組)=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因) △Ct(對照組)=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)

△△Ct=△Ct(實(shí)驗(yàn)組)-△Ct(對照組)目的基因的相對表達(dá)水平 = 2-△△Ct

所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,熒光實(shí)時定量 PCR 結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示, 其中各基因的表達(dá)量所示結(jié)果均由內(nèi)參基因β-actin的表達(dá)量進(jìn)行校正，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)。

1.2.6 蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western Blotting) 按照總蛋白提取試劑盒說明書提取轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞的總蛋白，并測其濃度。上樣后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。PVDF膜用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，時間為1 h。加入首抗，4 ℃，過夜孵育。用TBST洗膜，5 min×6次，放入HRP標(biāo)記的二抗中，37 ℃，孵育1 h。用TBST洗膜，5 min×6次。將膜取出，用ECL發(fā)光試劑盒顯色后曝光。對獲得的目的條帶進(jìn)行掃描分析。利用Image-ProPlus 6.0軟件測定目的蛋白的灰度值，并進(jìn)行半定量分析。數(shù)據(jù)用Means±SE表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 羊駝黑色素細(xì)胞的生長觀察 在合成質(zhì)粒時，所用載體為可在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的pcDNA6.2-GW/ EmGFPmiR并連有1個啟動基因綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)和增強(qiáng)性啟動子(promoter)CMV ，在由attBI-和attBII-切開的載體間插入了lpa-miR-nov-66 序列 (圖1)。

圖1 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR 表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

正常羊駝黑色素細(xì)胞在復(fù)蘇后，貼壁生長，伸展性能較好，生長狀態(tài)良好。24 h后細(xì)胞呈現(xiàn)典型的樹突狀。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞密度增大，細(xì)胞形態(tài)呈長梭形(圖2A)。圖2B和2C顯示，轉(zhuǎn)染效率較高，并且細(xì)胞形態(tài)單一，生長良好。

2.2 轉(zhuǎn)染lpa-miR-nov-66對TYRP2 mRNA影響的測定 將提取的總RNA進(jìn)行凝膠電泳檢測，圖3A中可見3條清晰的條帶，并且28 s的亮度高于18 s，說明RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。RT-PCR結(jié)果(圖3B)顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為151 bp，與預(yù)期目的基因的片段大小相符合。qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC組中TYRP2基因mRNA表達(dá)水平相比，lpa-miR-nov-66組TYRP2的mRNA表達(dá)量呈下降趨勢，其mRNA的表達(dá)量是NC組0.44倍，差異極其顯著(Plt;0.001) (圖3C)。

圖2 羊駝黑色素細(xì)胞

圖3 TYRP2 mRNA在轉(zhuǎn)染NC和lpa-miR-nov-66質(zhì)粒中的表達(dá)檢測和分析

2.3 轉(zhuǎn)染lpa-miR-nov-66對TYRP2蛋白表達(dá)量影響的測定 蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)然后黑色素細(xì)胞內(nèi)的TYRP2蛋白質(zhì)可以與TYRP2多克隆抗體結(jié)合 (圖4A)。結(jié)果顯示，與NC組相比，lpa-miR-nov-66組TYRP2的蛋白表達(dá)水有顯著降低，NC組的0.78倍(Plt;0.01) (圖4B)。

3 討論

TYRP2/Dct作為小鼠的 slaty/Dct (Slt)基因座編碼，可以將多巴色素異構(gòu)化為5,6-二羥吲哚-2羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)。因此slaty/Dct(Slt)野生型小鼠毛發(fā)的真黑素富含DHICA。研究者證實(shí)2,3,5-吡咯三羧酸(pyrrole-2,3,5-tricarboxylic acid, PTCA)可作為含有DHICA色素的特有標(biāo)記物[11]。Lamoreux 等對具有Slaty基因座的黑色、棕色、黑chinchilla和棕chinchilla野生型小鼠的毛發(fā)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PTCA含量含量較高。這都證明了小鼠的TYRP2可決定色素中DHICA的含量[12]。Slaty等位點(diǎn)變異所形成的純合子小鼠，TYRP2功能較正常低3倍到10倍，甚至失去功能。分析發(fā)現(xiàn)Slaty變異的基因型小鼠毛發(fā)總色素量沒有變化，只有PTCA值大量降低，導(dǎo)致PTCA和總色素量的比值只有原來的1/4到1/6，形成的真黑素中DHICA 含量非常少。人類TYRP2/Dct基因存在多態(tài)性并影響人類毛發(fā)的色素沉積[13]。但是，TYRP2/Dct多態(tài)性在人類皮膚和毛發(fā)淺色發(fā)生機(jī)制中所具有的重要地位仍然不能確定。令人感興趣的是，人類棕色或黑色毛發(fā)毛囊色素細(xì)胞不能表達(dá)TYRP2/Dct蛋白。因此，研究者推測人類棕色和黑色毛發(fā)的形成不需要TYRP2的參與[14]。

圖4 TYRP2 蛋白在轉(zhuǎn)染NC和lpa-miR-nov-66質(zhì)粒中的表達(dá)量

本試驗(yàn)利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞，進(jìn)而研究了lpa-miR-nov-66對黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的影響。試驗(yàn)通過qRT-PCR 以及Western Boltting方法對黑色素細(xì)胞中的與黑色素生成有關(guān)基因TYRP2進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，lpa-miR-nov-66的過表達(dá)可以使黑色素細(xì)胞中TYRP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均有下降，這暗示了lpa-miR-nov-66可能會通過調(diào)控TYRP2影響黑色素顆粒的合成。研究表明，TYRP2對黑色素細(xì)胞的存活具有一定的支持作用[15]。TYRP2作為黑色素合成過程中的關(guān)鍵酶，可以穩(wěn)定酪氨酸酶的活性，維持黑色素小體結(jié)構(gòu)的完整性[16]，其表達(dá)水平的降低會引起黑色素含量的減少。lpa-miR-nov-66過表達(dá)下調(diào)了TYRP2在翻譯及轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，說明在黑色素細(xì)胞中過表達(dá)lpa-miR-nov-66會抑制TYRP2的表達(dá)，從而對黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒的生成產(chǎn)生一定的抑制作用。然而，lpa-miR-nov-66的過量表達(dá)對黑色素細(xì)胞中TYRP2的影響是否還存在其他的作用途徑，相關(guān)途徑之間是否存在交叉等一些問題目前尚未見報(bào)道，還有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

通過在羊駝黑色素細(xì)胞中過表達(dá)lpa-miR-nov-66，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的lpa-miR-nov-66可以降低TYRP2 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，lpa-miR-nov-66與綿羊毛色形成過程具有一定的相關(guān)性。

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TheInfluencesofover-expressinglpa-miR-nov-66onTYRP2inmelanocytesofalpaca

YANG Shan-shan1, FAN Rui-wen1, JIAO Ding-xing2, DONG Chang-sheng1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2.Agricultural Bureau of Hebei Province, Qinghe 054000,China )

The molecular mechanisms underlying the formation of coat colors in animals are poorly understood. Recent studies have demonstrated that microRNAs play important roles in the control of melanogenesis and coat color in mammals. In order to investigate the influences of lpa-miR-nov-66 on TYRP2 in melanocytes. The melanocytes were cultured and transfected with the lpa-miR-nov-66 or NC plasmid. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative real-time polymerse chain reaction (qRT-PCR) and western blotting were used to detect the different expression of TYRP2 in melanocytes transfected with the lpa-miR-nov-66 or NC plasmid. A partial sequence of TYRP2 gene with the length of 151 bp was successfully amplified by RT-PCR. qRT-PCR results showed that the expression level of TYRP2 mRNA was 0.44 fold changes in the melanocytes transfected with lpa-miR-nov-66 plasmid compared with the melanocytes transfected with NC plasmid (Plt;0.001). Western blotting showed that the protein level of TYRP2 was 0.78 fold changes in in the melanocytes transfected with lpa-miR-nov-66 plasmid compared with the melanocytes transfected with NC plasmid (Plt;0.01). All those results suggest that lpa-miR-nov-66 can affect the expression of TYRP2 both at mRNA and protein levels and has a potential role in coat color regulation.

mircoRNA ; lpa-miR-nov-66 ; melanocytes ; TYRP2

DONG Chang-sheng

S852.1

A

0529-6005(2017)10-0024-04

2017-03-29

國家“863”計(jì)劃 (2013AA102506); 公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè)) 科研專項(xiàng) (201303119); 山西省研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目 (2016BY071)

楊姍姍(1987-), 女,博士生, 研究方向?yàn)檠蝰劽? E-mail:shanshan0321@163.com

董常生,E-mail: cs-dong@sxau.edu.cn