姜俊慶 ， 程建國(guó) ， 趙 位 ， 羅 燕 ， 王吳優(yōu) ， 田 青

(1.四川養(yǎng)麝研究所 ， 四川 都江堰 6118301 ； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 四川 溫江 611130)

林麝源解沒(méi)食子酸鏈球菌的分離鑒定及進(jìn)化分析

姜俊慶1， 程建國(guó)1， 趙 位2， 羅 燕2， 王吳優(yōu)2， 田 青2

(1.四川養(yǎng)麝研究所 ， 四川 都江堰 6118301 ； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 四川 溫江 611130)

采用傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法和分子生物學(xué)方法，對(duì)四川省某養(yǎng)麝場(chǎng)2只患化膿性疾病林麝病原菌進(jìn)行生理生化特征和16S rRNA基因序列測(cè)定，以小鼠感染試驗(yàn)測(cè)試分離菌株的致病性，用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)對(duì)分離菌株進(jìn)行進(jìn)化分析。該研究分別從2只林麝機(jī)體內(nèi)分離出1株解沒(méi)食子酸鏈球菌解沒(méi)食子酸亞種和1株解沒(méi)食子酸鏈球菌馬其頓亞種，兩分離菌均能夠引起小鼠肝臟腫大，且對(duì)多類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)化分析顯示，2分離菌處于不同的分支。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究解沒(méi)食子酸鏈球菌以及林麝化膿性疾病奠定基礎(chǔ)。

林麝 ； 解沒(méi)食子酸鏈球菌 ； 分離鑒定 ； 進(jìn)化分析

解沒(méi)食子酸鏈球菌(Streptococcusgallolyticus)屬于牛鏈球菌。自1990年Osawa[1]首次于樹(shù)袋熊的排泄物中分離出該菌并命名以來(lái)，在人、家畜、家禽、野生動(dòng)物以及水生動(dòng)物機(jī)體內(nèi)也分離到該致病菌[2]。該菌屬于D族鏈球菌，其可用作食品發(fā)酵，也可引起動(dòng)物感染。作為機(jī)會(huì)感染致病菌，解沒(méi)食子酸鏈球菌在臨床上可引起各種感染性疾病，如腹膜炎、尿路感染、菌血癥以及結(jié)腸/直腸癌等[3-6]。在早期研究中解沒(méi)食子酸鏈球菌生物學(xué)分類(lèi)存在很大的爭(zhēng)議。至2003年，Schlegel等[7]將解沒(méi)食子酸鏈球菌分為3個(gè)亞種，即：解沒(méi)食子酸亞種、巴氏亞種和馬其頓亞種。到目前為止，臨床上對(duì)解沒(méi)食子酸鏈球菌的分離還比較少，而對(duì)于不同亞種之間的研究罕見(jiàn)有報(bào)道。

本研究分別從2只病死林麝的肝臟和肺臟中分離出了1株疑似解沒(méi)食子酸鏈球菌解沒(méi)食子酸亞種和1株疑似解沒(méi)食子酸鏈球菌馬其頓亞種。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)診斷，并對(duì)其進(jìn)行耐藥情況調(diào)查和致病性研究。最后，通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，分析2株解沒(méi)食子酸鏈球菌不同亞種的進(jìn)化地位。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 5%犢牛血清的胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic soy agar, TSA)平皿、生化反應(yīng)管以及藥敏紙片，2×TaqPCR Master Mix Kit和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。供藥敏試驗(yàn)的紙片抗生素的種類(lèi)包括：鏈霉素、慶大霉素、頭孢匹胺、環(huán)丙沙星、青霉素、丁胺卡那霉素、氧氟沙星、頭孢噻吩、氟苯尼考、氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢他啶、亞胺培南、卡那霉素和林可霉素。

1.2 樣品采集及菌株分離 于四川某養(yǎng)麝場(chǎng)分別采集2只不同病死林麝的肝臟和肺臟，密封于無(wú)菌采樣袋，送往實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行細(xì)菌分離。將肝臟和肺臟劃線接種于TSA平皿，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后挑選單菌落劃線純化，最后進(jìn)行革蘭染色，確定為純培養(yǎng)物后，甘油保存于-70 ℃冰箱，備用。

1.3 生理生化鑒定 將保存的菌種劃線接種于TSA平皿，培養(yǎng)18 h后觀察菌落大小、形態(tài)和顏色，然后采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化鑒定，操作步驟按照細(xì)菌微量生化反應(yīng)管的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 分子生物學(xué)鑒定 將純化的菌種接種于TSA平皿，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，無(wú)菌生理鹽水洗下，提取基因組DNA，作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物為：27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3'; 1492R:5'-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3'。PCR擴(kuò)增體系為：2 ×TaqPCR Master Mix 25 μL，10 mmol/L 27F引物2 μL，10 mmol/L 1492R引物2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。

1.5 小鼠的致病性試驗(yàn) 將24只7周齡的BALB/c小鼠平均分成3個(gè)組(雌雄各半)，分別命名為A、B、C。同時(shí)將菌株劃線接種于TSA平皿，培養(yǎng)18 h后用無(wú)菌生理鹽水洗下，制成菌液。然后用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌濃度，將菌液濃度調(diào)整為109CFU/mL。將調(diào)整濃度后的肝臟、肺臟分離菌菌液分別腹腔接種于A, B組小鼠，0.5 mL/只，C組注射等量的生理鹽水作為對(duì)照組。飼養(yǎng)14 d，記錄小鼠死亡數(shù)量和死亡時(shí)間，并對(duì)感染死亡小鼠進(jìn)行剖檢，觀察并記錄內(nèi)部臟器的病理變化。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室和標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，先將分離菌株增菌培養(yǎng)，10倍倍比稀釋后涂布MH瓊脂平板，分別將藥敏紙片貼于平板上。最后，將貼好的藥敏紙片的MH瓊脂平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.7 分子進(jìn)化分析 在NCBI上對(duì)分離到的2個(gè)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析，采用Clustalx與從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的解沒(méi)食子酸鏈球菌16S rRNA基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并用Mega 6.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將病死2只病死林麝的肝臟和肺臟劃線培養(yǎng)18 h后，在TSA培養(yǎng)基上，均形成透明、圓形、光滑的小菌落，革蘭染色可見(jiàn)紫色呈鏈狀排列或單個(gè)存在的革蘭陽(yáng)性球菌。

2.2 菌種的生理生化性質(zhì) 各項(xiàng)生理生化指標(biāo)檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝臟和肺臟分離菌株菌發(fā)酵葡萄糖、乳糖、尿素以及V-P 反應(yīng)均表現(xiàn)為陽(yáng)性，在棉籽糖、甘露醇、海藻糖發(fā)酵過(guò)程中肝臟分離株表現(xiàn)為陽(yáng)性，而肺臟分離株表現(xiàn)為陰性。同時(shí)，在對(duì)阿拉伯糖發(fā)酵過(guò)程中肝臟分離株表現(xiàn)為陰性，而肺臟分離株表現(xiàn)為陽(yáng)性。以上結(jié)果中，肝臟分離株符合解沒(méi)食子酸鏈球菌解沒(méi)食子酸亞種的生理生化特征，而肺臟分離株符合解沒(méi)食子酸鏈球菌馬其頓亞種的生理生化特征。

2.3 分子生物學(xué)鑒定 肝臟、肺臟分離菌株16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)大小分別約為1 200 bp和1 400 bp的條帶。將目的條帶膠回收后測(cè)序，結(jié)果表明，肝臟和肺臟分離株16S rRNA基因大小分別為1 274 bp和1 453 bp。將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為：KU323659和KY693647。并在NCBI上分別對(duì)2分離菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。結(jié)果顯示，肝臟分離菌株的16S rRNA基因序列與解沒(méi)食子酸鏈球菌解沒(méi)食子酸亞種16S rRNA基因序列相似性達(dá)99%，因此確定該分離菌為解沒(méi)食子酸鏈球菌解沒(méi)食子酸亞種，命名為FMDD_5。肺臟分離菌株的16S rRNA基因序列與解沒(méi)食子酸鏈球菌馬其頓亞種16S rRNA基因序列相似性達(dá)99%，因此確定該分離菌為解沒(méi)食子酸鏈球菌馬其頓亞種，命名為L(zhǎng)PSM。

2.4 菌種對(duì)小鼠的致病性 A組和B組感染試驗(yàn)小鼠精神委靡、食欲不振，剖檢均可見(jiàn)肝臟淤血、腫大，周邊鈍圓等病理變化，生理鹽水組小鼠無(wú)任何明顯的病理變化。

2.5 藥敏試驗(yàn) 在所用的15種藥敏紙片中，分離菌株LPSM對(duì)卡那霉素、鏈霉素、林可霉素耐藥，而分離菌株FMDD_5對(duì)青霉素、卡那霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、林可霉素耐藥。

2.6 分子進(jìn)化分析 采用鄰近法將8株解沒(méi)食子酸鏈球菌解沒(méi)食子酸亞種和11株解沒(méi)食子酸鏈球菌馬其頓亞種與2株分離菌株進(jìn)行建樹(shù)，建樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖1。肝臟分離株FMDD_5與其他8株解沒(méi)食子酸鏈球菌解沒(méi)食子酸亞種同屬一個(gè)大的分支，保守性比較高，基因序列相似性高達(dá)99.9%。肺臟分離菌株LPSM與其他11株解沒(méi)食子酸鏈球菌馬其頓亞種處于不同的分支，其相似性達(dá)99.72%。

圖1 21株解沒(méi)食子酸鏈球菌進(jìn)化分析

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)麝類(lèi)的研究主要集中于野生麝類(lèi)資源的保護(hù)、麝的人工養(yǎng)殖技術(shù)以及麝香的開(kāi)發(fā)方面[8-9]，關(guān)于麝的化膿性疾病的研究相對(duì)較少。而化膿性疾病在麝養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)病率比較高，約占麝疾病的70%，嚴(yán)重制約麝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[10]。加大對(duì)麝化膿性疾病的研究，是促進(jìn)人工養(yǎng)麝的重要途徑。解沒(méi)食子酸鏈球菌作為一種人獸共患病病原，已經(jīng)在雞、鴨、鵝、野生亞洲象等動(dòng)物機(jī)體內(nèi)分離到該致病菌[11]。李美霞等[12]對(duì)解沒(méi)食子酸鏈球菌不同感染途徑雛鴨的病理變化進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不同途徑感染的雛鴨均有較高死亡率，表現(xiàn)出嚴(yán)重的心肌炎、腦膜炎等病理變化。解沒(méi)食子酸亞種一直被認(rèn)為是正常菌群，存在于人類(lèi)腸道[2]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，解沒(méi)食子酸亞種是機(jī)會(huì)性致病菌，在人臨床研究發(fā)現(xiàn)，能引起心內(nèi)膜炎和敗血癥等多種感染，Sillanp等[13]研究證實(shí)，鏈球菌引起的人感染性心內(nèi)膜炎約24%的都是由解沒(méi)食子酸亞種引起。而在養(yǎng)殖業(yè)中，解沒(méi)食子酸亞種能夠引起動(dòng)物感染乳腺炎、敗血癥等[14]。目前普遍認(rèn)為馬其頓亞種不具備毒性，是安全的。

本試驗(yàn)對(duì)病死林麝進(jìn)行剖檢證實(shí)，解沒(méi)食子酸亞種和馬其頓亞種均能夠引起林麝的化膿性疾病，小鼠致病性試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)室分離菌株解沒(méi)食子酸亞種FMDD_5和馬其頓亞種LPSM均能夠引起小鼠肝臟的病理變化。耐藥性試驗(yàn)表明，解沒(méi)食子酸亞種和馬其頓亞種對(duì)多類(lèi)抗生素都出現(xiàn)耐藥性，所以在臨床用藥中應(yīng)嚴(yán)格把控抗生素的使用。由于與馬其頓亞種具有較高同源性的菌株均表現(xiàn)出致病性，因此將馬其頓亞種應(yīng)用于食品中還應(yīng)該進(jìn)行嚴(yán)格防范。

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Isolation,IdentificationandBioinformaticsAnalysisofStreptococcusgallolyticus

JIANG Jun-qing1， CHENG Jian-guo1， ZHAO Wei2, LUO Yan1， WANG Wu-you2, TIAN Qing2

(1 Sichuan Institute of Musk Deer Breeding, Dujiangyan 611830, China ;2 College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China)

Pathogens were isolated and identified by conventional method and 16S rRNA sequence analysis from suppurative disease of two forest musk deer in Sichuan. The pathogenicity of the isolates was verified by pathogenicity tests in mice, and antimicrobial susceptibility was evaluated by disk diffusion test (K-B method). In order to establish the phylogenetic relationship of the isolates, the phylogenetic tree of the isolates was constructed. The results showed that oneS.gallolyticussubsp.gallolyticusstrain and oneS.gallolyticussubsp.macedonicusstrain were isolated and identified,and both the isolates caused hepatomegaly in BALB/c mice.Multiple antibiotic resistances were observed in the phenotypic analysis. Furthermore, the phylogenetic analysis of the two isolates showed that they were segregated in different branches.

forest musk deer ;Streptococcusgallolyticus; isolation and identification ; phylogenetic analysis

LUO Yan

Q93-331

A

0529-6005(2017)10-0020-03

2017-04-12

四川省省級(jí)科研院所科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2017YSZH0008)

姜俊慶(1961-)，男，助理研究員，本科，主要從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究，E-mail：419332680@qq.com

羅燕，E-mail：lycjg@163.com