田萬年 ， 薛書江 ， 賈立軍 ， 張守發(fā)， 李國江

(1.吉林農業(yè)科技學院動物科技學院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.吉林農業(yè)科技學院 預防獸醫(yī)學吉林省重點實驗室 ，吉林 吉林 132101 ； 3. 延邊大學農學院 ， 吉林 延吉 133002)

吉林省部分地區(qū)羊泰勒蟲病流行病學調查及分類鑒定

田萬年1,2， 薛書江3， 賈立軍3， 張守發(fā)3， 李國江1,2

(1.吉林農業(yè)科技學院動物科技學院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.吉林農業(yè)科技學院 預防獸醫(yī)學吉林省重點實驗室 ，吉林 吉林 132101 ； 3. 延邊大學農學院 ， 吉林 延吉 133002)

為了解吉林省部分地區(qū)羊泰勒蟲病的流行情況，試驗采用PCR方法對采自吉林省部分地區(qū)羊血液樣本235份進行羊泰勒蟲檢測，并對部分陽性樣本進行測序分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，羊泰勒蟲陽性率為28.08%，為呂氏泰勒蟲單獨感染，沒有檢測到尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲感染。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，吉林省呂氏泰勒蟲與青海分離株分布于同一分支，親緣關系最近，與綿羊泰勒蟲、尤氏泰勒蟲親緣關系較遠。此次調查為吉林省羊泰勒蟲病的綜合防治提供了理論依據。

羊泰勒蟲病 ； 流行病學調查 ； 聚合酶鏈反應 ； 18S rRNA ； 系統(tǒng)發(fā)育樹

羊泰勒蟲病是由羊泰勒蟲引起的綿羊和山羊的一種經蜱傳染性血液原蟲病[1]。本病呈地方性流行，主要以高熱、貧血和消瘦為主要臨床癥狀，可引起外地引進羊大量死亡，慢性發(fā)病的羊產肉量和產毛量顯著下降，嚴重影響?zhàn)B羊業(yè)的發(fā)展[2]。近年來，我國已報道的羊泰勒蟲有3個種，即呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲[3-5]。自然感染病例多為尤氏泰勒蟲和呂氏泰勒蟲的混合感染，也有少數病例單一蟲種感染，綿羊泰勒蟲僅在新疆有報道[6-7]。

目前，血液涂片檢查在流行病學中大量應用，我國對羊泰勒蟲的診斷主要以血液涂片為主。吉林省是全國重要的養(yǎng)羊基地，而吉林省的養(yǎng)羊基地主要集中在白城、松原及四平市所轄的雙遼市。羊產業(yè)是吉林省畜牧產業(yè)中的支柱性產業(yè)和傳統(tǒng)產業(yè)，養(yǎng)羊業(yè)已經成為當地農民增收和農業(yè)增效的重要支撐。目前，對吉林省羊泰勒蟲病的流行病學調查較少，也無優(yōu)勢蟲株及分類研究的相關報道。本試驗應用PCR方法結合血液涂片檢查，對采自吉林省部分地區(qū)羊泰勒蟲進行檢查，為該地區(qū)羊泰勒蟲病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 血液樣本的采集 血液樣本共235份分別采自吉林省琿春市90份(2016年5月)，白城市45份(2015年4月)，松原市40份(2015年5月)和雙遼市60份(2016年4月)綿羊或山羊抗凝血，同時制作了血液涂片，供姬姆薩染色鏡檢。血液保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 全血DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2000 DNA Marker等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 基因組DNA的提取 將采集的羊抗凝血，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，抽提的DNA用60 μL TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 羊泰勒蟲的PCR檢測 根據GenBank上登錄的羊泰勒蟲18S rRNA基因序列，設計種屬特異性引物，引物序列見表1。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR反應條件如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠純化PCR產物，送至上海生工生物工程技術服務有限公司序列測定。

表1 羊泰勒蟲病PCR檢測引物

1.5 序列比對與進化分析 將測定的梨形蟲18S rRNA基因序列、以及GenBank上登錄的泰勒蟲和巴貝斯蟲18S rRNA基因序列，建立牛羊梨形蟲的系統(tǒng)進化樹。序列依次為瑟氏泰勒蟲(AF081137、AY661515、JF719834、AB016074)、環(huán)形泰勒蟲(AY524666、FJ426369、EU073963、EU083801)、綿羊泰勒蟲(FJ603460)、萊氏泰勒蟲(AF081135)、呂氏泰勒蟲(AY262117、JF719832)、尤氏泰勒蟲(AY262116、JF719835)以及牛巴貝斯蟲(HQ264111、AY603398)、牛卵形巴貝斯蟲(LC125457、AY081192、AY603400、AY603400)、牛雙芽巴貝斯蟲(KM046917)、羊巴貝斯蟲(AY998123)。

2 結果

2.1 血液樣本PCR檢測 通過對235份羊血液樣本進行PCR檢測，呂氏泰勒蟲特異性引物擴增特異條帶，而尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲特異引物未擴增出條帶(結果見圖1)，羊泰勒蟲PCR檢測陽性率為28.08%(66/235)。血液涂片染色鏡檢陽性率為12.76%(30/235)。

圖1 呂氏泰勒蟲特異引物擴增的PCR結果

呂氏泰勒蟲特異引物擴增的M：DL-2000 DNA Marker ； 1～5： 部分羊樣本PCR 產物 ； 6：空白對照

圖2 尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲特異引物擴增的PCR結果

2.2 不同地區(qū)羊群感染羊泰勒蟲病情況 采用PCR方法對分別采自琿春、白城、松原和雙遼4個地區(qū)的235份血液樣本進行羊泰勒蟲感染情況的比較，其結果見表1。

表1 不同地區(qū)羊感染羊泰勒蟲的情況

*：平均感染率，下表同

從表1可見，不同地區(qū)羊均可感染羊泰勒蟲病。經統(tǒng)計學分析，琿春地區(qū)感染率顯著高于其他3個地區(qū)，差異極顯著(Plt;0.01)。

2.3 不同品種羊群感染羊泰勒蟲病情況 將PCR檢測的235份羊血液樣本的檢測結果，按不同品種分組進行比較，其結果見表2。

表2 不同品種羊群感染羊泰勒蟲病情況

從表2可見，綿羊和山羊均可感染羊泰勒蟲病。經統(tǒng)計學分析，不同品種間羊泰勒蟲感染率差異不顯著(Pgt;0.05)。

2.4 不同飼養(yǎng)方式羊群感染羊泰勒蟲病情況 將PCR檢測的235份羊血液樣本的檢測結果，按不同飼養(yǎng)方式分組進行比較，其結果見表3。

表3 不同飼養(yǎng)方式羊感染羊泰勒蟲的情況

從表3可見，不同飼養(yǎng)方式的羊均感染羊泰勒蟲病。統(tǒng)計學分析表明，不同飼養(yǎng)方式羊泰勒蟲感染率差異顯著(Plt;0.05)。

2.5 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 為了進一步分析吉林省羊群感染羊泰勒蟲優(yōu)勢蟲種及遺傳進化關系，將本試驗測得的羊泰勒蟲18S rRNA基因序列與GenBank登錄的巴貝斯蟲和泰勒蟲序列進行對比分析，應用DNAMAN軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析(見圖4)。結果顯示，本次流行病學調查檢測到的泰勒蟲位于呂氏泰勒蟲分支上，T.luwenshuniJilin分離株與T.luwenshuni青海分離株處在同一分支，與國內流行的尤氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲親緣關系較遠，吉林省羊群流行羊泰勒蟲優(yōu)勢蟲株為呂氏泰勒蟲。

3 討論

羊泰勒蟲病是一類經蜱傳播的血液原蟲病，本病呈世界性流行，我國羊泰勒蟲病流行區(qū)域逐漸擴大，國內有多個省份報道該病的流行及優(yōu)勢蟲株[8-11]。目前，羊產業(yè)是吉林省畜牧產業(yè)中的支柱性產業(yè)和傳統(tǒng)產業(yè)，已經成為當地農民增收和農業(yè)增效的重要支撐。為了解吉林省羊群羊泰勒蟲病的感染情況，本試驗應用血液涂片和PCR技術對該地區(qū)羊泰勒蟲的感染率及優(yōu)勢蟲種類進行了鑒定。結果顯示，血液涂片鏡檢陽性率為12.76%，PCR檢測陽性率為28.08%，高于血液涂片鏡檢，感染的優(yōu)勢蟲種為呂氏泰勒蟲，沒有檢測到尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲。本次調查發(fā)現(xiàn)，羊泰勒蟲呈單一病原感染，未出現(xiàn)呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲混合感染，這一結果與孟林明等[12]報道的呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲多呈混合感染存在差異，可能由于所處地理位置不同及傳播該病的媒介蜱有關。對PCR檢測的235份血液樣本進行了不同地區(qū)、不同品種及不同飼養(yǎng)方式的比較分析。結果顯示，不同地區(qū)及不同飼養(yǎng)方式差異顯著，吉林省琿春地區(qū)感染率為45.56%，明顯高于其他地區(qū)(Plt;0.05)，存在較大差異，可能與地理生態(tài)環(huán)境和跨境交易運輸頻率等導致感染率存在差異。放牧羊的感染率為34.53%，顯著高于舍飼18.75%(Plt;0.05)，分析原因可能為放牧羊與蜱的接觸幾率比舍飼羊高一些。

圖3 基于泰勒蟲和巴貝斯蟲18S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化樹

本試驗對吉林省流行羊泰勒蟲陽新樣本的18S rRNA基因序列進行了克隆和遺傳進化分析。結果顯示，本次檢測到羊泰勒蟲位于呂氏泰勒蟲分支上，無陽性樣本位于尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲分支，表明吉林流行的羊泰勒蟲為呂氏泰勒蟲，豐富了羊泰勒蟲流行病學資料，進一步證實了殷宏等[13]認為國內羊泰勒蟲存在新種的觀點。遺傳進化樹發(fā)現(xiàn)，本次檢測的呂氏泰勒蟲和青海分離株處于同一分支，而區(qū)別于甘肅和湖北分離株，這一結果與楊菊鳳等[10]報道的我國羊泰勒蟲存在地區(qū)差異性結果相一致。本次調查明確了吉林省羊泰勒蟲的優(yōu)勢蟲株和流行情況，但尚未對該地區(qū)蜱的種類進行調查，下一步加大檢測樣本數量，確定蜱的種類，為吉林省羊泰勒蟲病的防控提供詳實數據。

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EpidemiologicalsurveyandidentificationoftheileriosisingoatsandsheepinJilinProvince

TIAN Wan-nian1,2, XUE Shu-Jiang3, JIA Li-jun3, ZHANG Shou-fa3， LI Guo-jiang1,2

(1.College of Animal Science, Jilin Agricultural Scienceand Technology College, Jilin 132101, China； 2.Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province, Jilin 132101, China； 3.College of Agriculture, Yanbian University, Yanji 133002, China)

In order to study the prevalence of theileria parasites in ovine infections in sheep. A total of 235 peripheral blood samples of sheep were collected from Jilin and detected by microscopic examination and PCR. The 18S rRNA gene was cloned from part of positive samples and used for phylogenetical analysis. As a result, Theileriosis in goats and sheep was positive in 28.08% of the samples. Phylogenetic tree analysis confirmedTheileriaspp. was most closely related toTheilerialuwenshuniQinghai strains, but more distantly related toTheileriauilenbergiandTheileriaovis. The results provide important information for prevention and control of Piroplasma of Cattle and Sheep in the region.

ovine and caprine theileriosis ； epidemiological investigation ； PCR ； 18S rRNA ； phylogenetic tree

s：ZHANG Shou-fa ； LI Guo-jiang

S852.72

A

0529-6005(2017)10-0013-04

2016-11-10

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20150623004TC)；吉林省重點學科培育項目(吉農院合字[2015]第x030號)；吉林農業(yè)科技學院種子基金項目(吉農院合字[2014]第Z07號)

田萬年(1980-)，男，講師，博士，主要從事動物寄生蟲病研究，E-mail:wannian2000@hotmail.com

張守發(fā)，E-mail:shoufazhang@sina.com；李國江，E-mail:illiguojiang@126.com