王 軍 ， 燕曉曉 ， 丁 赫 ， 王靜芳 ， 呂文發(fā)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 吉林省反芻動(dòng)物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實(shí)驗(yàn)室 ， 吉林 長春 130118 ；2.新疆阿勒泰畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)校 ， 新疆 阿勒泰 836599)

LPS誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞miRNA差異表達(dá)分析

王 軍1， 燕曉曉1， 丁 赫1， 王靜芳2， 呂文發(fā)1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 吉林省反芻動(dòng)物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實(shí)驗(yàn)室 ， 吉林 長春 130118 ；2.新疆阿勒泰畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)校 ， 新疆 阿勒泰 836599)

MicroRNA (miRNA)在炎癥反應(yīng)中起重要作用，本試驗(yàn)用miRNA測(cè)序技術(shù)研究了細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞miRNA差異表達(dá)。用1μg/mL 的LPS處理牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞24 h，測(cè)定細(xì)胞上清液IL-6和IL-8分泌量，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行miRNA測(cè)序，并用熒光定量PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。結(jié)果表明，LPS可誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞11個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)、9個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)miRNA的靶基因注釋到生物過程的GO term共20個(gè)，注釋到細(xì)胞組分的GO term共12個(gè)，注釋到分子功能的GO term共20個(gè)；差異表達(dá)miRNA靶基因主要富集于PI3K-Akt和MAPK等信號(hào)通路。結(jié)果提示，miRNA在LPS誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起重要作用，其作用與PI3K-Akt和MAPK等信號(hào)通路激活有關(guān)。

細(xì)菌脂多糖 ； 子宮內(nèi)膜細(xì)胞 ； miRNA測(cè)序 ； 差異表達(dá)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是由病原微生物感染引起的一種產(chǎn)科疾病，其發(fā)病率達(dá)20%～40%，給奶牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。研究奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機(jī)制對(duì)于開發(fā)新型技術(shù)防治該病具有重要意義。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，也是使細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的重要物質(zhì)[2]，LPS誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)[3-4]。miRNA是一類長度約為20～24個(gè)核苷酸長度的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，在細(xì)胞增殖、凋亡、器官形成和機(jī)體發(fā)育等生理過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。最近，越來越多的證據(jù)表明，miRNA參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[7-8]，但miRNA在LPS誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)中的作用目前尚不清楚。本試驗(yàn)利用miRNA測(cè)序技術(shù)研究LPS感染牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞24 h后miRNA的差異表達(dá)，為揭示LPS誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從屠宰場采集牛子宮角，采用組織塊培養(yǎng)法，于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞，每2 d更換一次完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底壁80%時(shí)，用0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇3～5代生長狀態(tài)良好的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞，用1 μg/mL的 LPS (Sigma，美國)處理(LPS組)，對(duì)照組用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)(Ctr組)，24 h后收集細(xì)胞及上清液，上清液用于IL-6和IL-8分泌量測(cè)定，細(xì)胞用于miRNA測(cè)序及后續(xù)熒光定量PCR驗(yàn)證。

1.3 IL-6和IL-8濃度測(cè)定 細(xì)胞上清液用3 000 r /min離心20 min后，分別用ELISA試劑盒(Life Technologies，美國)測(cè)定上清液中IL-6和IL-8濃度，具體操作按試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4 miRNA測(cè)序及分析 利用TRIZol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)檢測(cè)，RNA質(zhì)量合格后，直接將miRNA兩端加上接頭，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后經(jīng)PCR擴(kuò)增和切膠回收等環(huán)節(jié)獲得cDNA文庫。使用Agilent 2100和Q-PCR明確文庫質(zhì)量合格后，進(jìn)行HiSeq/MiSeq測(cè)序。將測(cè)序序列與miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫中牛的已知miRNAs比對(duì)分析，得到miRNA表達(dá)結(jié)果，分別使用log2比率(火山圖)和散點(diǎn)圖比較兩組共同表達(dá)的miRNA表達(dá)量差異，并將差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行聚類分析，利用miRBase數(shù)據(jù)庫中的軟件及數(shù)據(jù)對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，利用Blast等軟件對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析。

1.5 熒光定量PCR 為驗(yàn)證miRNA測(cè)序的可靠性，隨機(jī)選擇4個(gè)miRNA，采用polyA加尾法進(jìn)行miRNA的熒光定量PCR驗(yàn)證。利用TRIZol法提取細(xì)胞總RNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR測(cè)定miRNA表達(dá)量。miRNA引物及內(nèi)參U6的引物信息見表1。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR總反應(yīng)體系中含SYBR PremixExTaq10 μL、ROX reference dye 0.4 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA 2 μL和滅菌去離子水6 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s、變性95 ℃ 5 s、退火溫度持續(xù)34 s、延伸95 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。利用2-△△Ct法分析miRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 miRNA熒光定量PCR引物信息

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS18.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，t檢驗(yàn)法比較分析Ctr組和LPS組之間的差異，顯著水平為Plt;0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8水平 圖1表明，LPS處理24 h可顯著提高奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞IL-6和IL-8分泌量(Plt;0.01)，提示LPS處理成功。

圖1 不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-6和IL-8濃度

2.2 miRNA測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果表明，LPS處理24 h后牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞有20個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中11個(gè)miRNA上調(diào)、9個(gè)miRNA下調(diào)(見中插彩版圖2A、C、D)。隨機(jī)選取的4個(gè)miRNA熒光定量PCR結(jié)果也與miRNA測(cè)序結(jié)果一致(見中插彩版圖2B)，表明測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。差異表達(dá)miRNA的靶基因GO分析結(jié)果表明，差異基因注釋到生物過程、細(xì)胞組分和分子功能的GO term分別為20，12個(gè)和20個(gè)(圖3)。差異表達(dá)miRNA靶基因KEGG分析結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集于PI3K-Akt等信號(hào)通路(見中插彩版圖4)。

圖3差異表達(dá)miRNA靶基因GO分析(LPSvsCtr)

注：BP:生物過程； CC：細(xì)胞組成； MF：分子功能

3 討論

LPS可誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞IL-6、IL-8和IL-1β等炎癥因子表達(dá)量上升，引發(fā)炎癥反應(yīng)，但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。本試驗(yàn)利用miRNA測(cè)序技術(shù)研究了LPS對(duì)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞miRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)11個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)和9個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，并明確了這些差異表達(dá)miRNA靶基因富集的信號(hào)通路。研究結(jié)果不僅為明確miRNA參與LPS誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)提供證據(jù)，也為研究LPS誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制提供參考。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的20個(gè)差異表達(dá)miRNA，雖然在牛子宮內(nèi)膜炎上鮮有報(bào)道，但對(duì)其他物種的研究顯示，多個(gè)miRNA參與炎癥反應(yīng)。miR-20a等參與miRNA靶向調(diào)控SIRPα表達(dá)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過程[9]，miR-375不僅可調(diào)節(jié)食管和支氣管上皮細(xì)胞IL-13的表達(dá)[10]，而且可調(diào)節(jié)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素的產(chǎn)生[11]。結(jié)核分枝桿菌感染鼠樹突狀細(xì)胞時(shí)，miR-99b 可調(diào)節(jié)IL-6、IL-12和 IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的釋放[12]；let-7c 可通過靶向調(diào)控STAT3調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[13]。此外，我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集于PI3K-Akt和MAPK等信號(hào)通路，以往報(bào)道支持這一發(fā)現(xiàn)。已有研究表明，LPS可通過激活多種細(xì)胞PI3K-Akt或MAPK信號(hào)通路而引發(fā)炎癥反應(yīng)[14-15]。本研究雖然揭示了miRNA在LPS誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，但其作用機(jī)制有待深入研究。

4 結(jié)論

miRNA在LPS誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起重要作用，其作用與PI3K-Akt和MAPK等信號(hào)通路激活有關(guān)。

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Lipopolysaccharide-InducedDifferentialExpressionofmiRNAsinBovineendometrialcells

WANG Jun1, YAN Xiao-xiao1, DING He1, WANG Jing-fang2, LV Wen-fa1

(1.Jilin Province Engineering Laboratory for Ruminant Reproductive Biotechnology and Healthy Production，College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China；2.Xinjiang Altay Animal Husbandry and Veterinary Schools Vocational Schools，Altay 836599,China)

MicroRNA (miRNA) plays important roles in inflammation response, the present study was conducted to study differential expression of miRNA in bovine endometrial cells induced by Lipopolysaccharide (LPS) using miRNA sequencing method. Firstly, bovine endometrial cells were treated with 1.0 μg/ml of LPS for 24 h, then concentration of IL-6 and IL-8 in cell supernatant and miRNA expression pattern of cell were determined using ELISA Kit and miRNA sequencing. Finally, real-time PCR was used to verify results of miRNA sequencing. The results showed that LPS stimulation led to differential expression of 20 miRNAs with 11 up-regulated and 9 down-regulated miRNAs. Target genes of the 20 miRNAs were referred to 20 Go terms for biological processes, 12 Go terms for cellular component and 20 Go terms for molecular function. Results of KEGG analysis showed that the target genes were significantly enriched in PI3K-Akt and AMPK signaling pathway. These results indicated that miRNA play important roles in the inflammation response of bovine endometrial cells induced by LPS, which may be achieved by the activation of PI3K-Akt and MAPK signaling pathway.

LPS ； endometrial cells ； miRNA sequencing ； differential expression

LV Wen-fa

S823

A

0529-6005(2017)10-0010-03

2017-07-24

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31672420)；吉林省科技廳項(xiàng)目(20150519018JH ，20150204074NY ，20160209001NY)

王軍(1979-)，男，副教授，博士，主要從事動(dòng)物繁殖調(diào)控研究，E-mail: junwang2004@126.com

呂文發(fā)，E-mail: wenfa2004@163.com