周 玲 ， 陳桂華 ， 伍子?jì)?， 麥凱杰 ， 李 迪 ， 王勝陽(yáng) ， 馬靜云 ， 張祥斌

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 廣東 廣州 510642)

廣東地區(qū)2016-2017年規(guī)?；i場(chǎng)腹瀉病原調(diào)查分析

周 玲 ， 陳桂華 ， 伍子?jì)?， 麥凱杰 ， 李 迪 ， 王勝陽(yáng) ， 馬靜云 ， 張祥斌

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 廣東 廣州 510642)

為了解廣東地區(qū)導(dǎo)致豬群腹瀉病原的流行狀況，對(duì)廣東省部分地區(qū)的豬場(chǎng)進(jìn)行豬群腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查，共采集腹瀉樣品273份，采用PCR和RT-PCR的方法檢測(cè)能夠造成豬群腹瀉的病原，包括豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，豬輪狀病毒(PoRV)，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，以及近年開(kāi)始流行的豬德?tīng)査跔畈《?PorcineDeltacoronavirus, PDCoV)，豬庫(kù)布病毒(PorcineKobuvirus,PKoV)，豬博卡病毒(PorcineBocavirus，PBoV)，豬薩佩羅病毒(PorcineSapelovirus,PSV)。檢測(cè)結(jié)果顯示，PEDV仍然是導(dǎo)致豬群腹瀉的主要病原，而TGEV沒(méi)有檢測(cè)到。尤為突出的是PKV僅次于PEDV的高陽(yáng)性率，因此其在豬群腹瀉中的作用值得進(jìn)一步探索。

廣東省 ； 豬群腹瀉 ； 腹瀉病原調(diào)查 ； PCR

自2010年以來(lái)，我國(guó)仔豬出現(xiàn)大范圍厭食、嘔吐、腹瀉嚴(yán)重等臨床癥狀，傳播迅速，且發(fā)病仔豬死亡率高，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬行業(yè)造成了重大損失。經(jīng)研究表明，引起豬病毒性腹瀉的病原較為常見(jiàn)的有豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，豬輪狀病毒(PorcineRotavirus，PoRV)，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)。近年有報(bào)道指出,豬德?tīng)査跔畈《?PorcineDeltacoronavirus, PDCoV)，豬庫(kù)布病毒(PorcineKobuvirus,PKoV)，豬博卡病毒(PorcineBocavirus，PBoV)，豬薩佩羅病毒(PorcineSapelovirus,PSV)在一定程度上可以導(dǎo)致豬的腹瀉、嘔吐癥狀[1]。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果表明，以上幾種腹瀉病原常常是以混合感染的形式呈現(xiàn)，而且對(duì)各階段豬群都易感，特別對(duì)哺乳仔豬危害最大，引起仔豬嘔吐、水樣腹瀉，致死率高[1]。本次研究主要是通過(guò)采集得到廣東省部分地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)的腹瀉樣品，對(duì)腹瀉病原在當(dāng)前腹瀉豬群中的感染情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，以期為廣東地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)建立有效的綜合防控措施提供參考，降低病毒性腹瀉給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 樣品 分別采集2016年1月至2017年4月期間，在廣東省不同地區(qū)43個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)中具有腹瀉、嘔吐、脫水、死亡等癥狀的發(fā)病豬群的糞便或腸道內(nèi)容物，共273份。

1.2 主要試驗(yàn)材料 核酸提取試劑盒(Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 250-prep)，購(gòu)自Axygen公司；PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver. 2(Catalog No. RR057A)、DL-2 000TMDNA Marker(Catalog No. 3427Q),購(gòu)自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司(TaKaRa公司產(chǎn)品);核酸染料EB替代物Goldview，購(gòu)自廣州美津生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 用于檢測(cè)的引物分別參照GenBank上的相關(guān)序列，利用Primer 6.0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)了PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV的特異性引物，引物信息如表1，引物送由華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 病毒核酸的提取 將腸道內(nèi)容物或糞便與生理鹽水以1∶3的比列稀釋，充分震蕩后8 000 r/min離心10 min。取上清按愛(ài)思進(jìn)核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒核酸的抽提，產(chǎn)物于-80 ℃保存待用。

1.5 RT-PCR檢測(cè) 以提取的樣品核酸為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2× 1 Step Buffer 10 uL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，模板 2 μL，用RNase Free dH2O 補(bǔ)足20 μL。PCR擴(kuò)增程序：50 ℃ 30 min; 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min; 4℃ 保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 檢測(cè)結(jié)果與分析

2.1 臨床病料檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用PCR和RT-PCR方法對(duì)2016年1月-2017年4月采集的臨床病料進(jìn)行腹瀉病原檢測(cè)，共檢測(cè)臨床病料273份，發(fā)現(xiàn)其中PEDV陽(yáng)性病料182份，總陽(yáng)性率為66.7%；PoRV陽(yáng)性病料64份，總陽(yáng)性率23.4%；PDCoV陽(yáng)性病料47份，總陽(yáng)性率17.2%；273份臨床腹瀉病料并未檢測(cè)到TGEV陽(yáng)性；PKV陽(yáng)性病料155份，總陽(yáng)性率56.8%；PBoV陽(yáng)性病料81份，總陽(yáng)性率29.7%；PSV陽(yáng)性病料76份，總陽(yáng)性率27.8%。病原檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 腹瀉病原檢測(cè)結(jié)果

2.2 病料中腹瀉病原感染情況分析 對(duì)273份臨床腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示,PEDV、PoRV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV只有少數(shù)單獨(dú)感染，分別是PEDV單獨(dú)感染34份，RV單獨(dú)感染4份，PDCoV單獨(dú)感染4份，PKV單獨(dú)感染11份，PBoV單獨(dú)感染2份，PSV單獨(dú)感染3份，如表3。其中PEDV與其他腹瀉病原混合感染占PEDV陽(yáng)性病料的81.3%，與PKV混合感染的情況最多，為94份，占PEDV與其他病原混合感染情況的66.2%。

表3 腹瀉病原單獨(dú)感染情況

2.3 不同時(shí)間腹瀉病原檢測(cè)結(jié)果分析 首先對(duì)所檢測(cè)的273份樣品進(jìn)行時(shí)間的劃分，統(tǒng)計(jì)出以上幾種可以導(dǎo)致豬群腹瀉的病原在腹瀉豬群中不同時(shí)間的陽(yáng)性檢出率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)中插彩版圖1。春季共檢測(cè)腹瀉樣品93份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV陽(yáng)性率分別為62.40%、22.58%、19.35%、0%、62.40%、27.96%、25.80%。夏季共檢測(cè)腹瀉樣品31份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV陽(yáng)性率分別為77.41%、45.16%、0%、0%、80.65%、9.68%、19.35%。秋季共檢測(cè)腹瀉樣品62份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV陽(yáng)性率分別為54.84%、27.41%、27.41%、0%、61.29%、22.58%、40.32%。冬季共檢測(cè)腹瀉樣品87份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV陽(yáng)性率分別為75.86%、16.09%、13.79%、0%、40.23%、43.68%、24.14%。據(jù)報(bào)道，PEDV具有季節(jié)流行性，大多流行于冬季和春季，但從本次研究結(jié)果來(lái)看，PEDV檢出率較高的為夏季77.41%和冬季75.86。PDCoV夏季的檢出率為0%，冬季的檢出率也相對(duì)較低為13.79%，可見(jiàn)在夏季高溫和冬季寒冷的氣候下PDCoV的繁殖和傳播得到抑制。其他病原未有明顯的季節(jié)分布。TGEV在所有時(shí)間內(nèi)的檢出率都為0%，這也在一定程度上說(shuō)明其在廣東地區(qū)的分布減少甚至消失。

2.4 不同豬場(chǎng)腹瀉病原混合感染情況分析 為了了解來(lái)源于不同豬場(chǎng)腹瀉樣品的病原感染情況，做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，43個(gè)不同豬場(chǎng)單獨(dú)感染腹瀉病原的數(shù)量相對(duì)于混合感染極少，而且病原混合感染情況較為復(fù)雜，大多是幾種病原混合感染，如中插彩版圖2，其中PEDV以及PKoV的混合感染數(shù)量最多，這也證明了PEDV是當(dāng)前導(dǎo)致豬群腹瀉的主要病原。雖然PKoV在健康豬群中也能檢測(cè)到，但從本次的調(diào)查結(jié)果來(lái)看，其在腹瀉豬群中普遍存在。因此，PKoV與豬群腹瀉的關(guān)系還需進(jìn)一步的研究。目前復(fù)雜的混合感染情況也給臨床防疫工作帶來(lái)挑戰(zhàn)。

3 討論

豬的病毒性腹瀉是規(guī)?；i場(chǎng)的常見(jiàn)病和多發(fā)病，主要由PEDV、RV、TGEV引起。自2012年P(guān)DCoV在香港首次報(bào)道[2]后，多項(xiàng)研究證明，PDCoV感染仔豬后可引起仔豬腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀。為了調(diào)查PDCoV在國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)中的流行情況，有學(xué)者對(duì)采自湖北、江蘇、廣東、河南、安徽等地區(qū)的2013年到2014年的258份糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，PDCoV陽(yáng)性率14.3%，證實(shí)了PDCoV在我國(guó)豬場(chǎng)中存在[3]。2007年，匈牙利科學(xué)家在10日齡腹瀉仔豬糞便樣品中檢測(cè)到PKoV，從此開(kāi)始了對(duì)豬庫(kù)布病毒的研究[4]。2012年，胡軍勇[5]等采集湖北省54個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)仔豬病料165份進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PKoV在腹瀉仔豬中的感染率高達(dá)82.5%，健康仔豬中陽(yáng)性率為13.23%。因此，可以推測(cè)PKoV的感染與仔豬腹瀉有一定的關(guān)系。第一例豬博卡病毒(PBo-Like Virus)于2009年由瑞典科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[6]。隨后，于2010年在中國(guó)首次檢測(cè)出了豬博卡病毒[7]。PBoV主要在斷奶仔豬中流行，目前已在中國(guó)的其他省市如江西、浙江、安徽、河北、河南、江蘇、上海、北京、新疆等地區(qū)檢測(cè)到，檢出率在12.5%～88.9%，和PKoV一樣，PBoV也能在健康豬的樣品中檢測(cè)到，檢出率為7.3%[8]。大量的研究已證實(shí)，PBoV已在中國(guó)的規(guī)?；i場(chǎng)中廣泛分布。豬的薩佩羅病毒于1960年被首次報(bào)道以來(lái)，相繼被英國(guó)、日本等多個(gè)國(guó)家報(bào)道。PSV感染豬只可以引起輕度或者中度的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、腹瀉、肺炎和繁殖障礙，也會(huì)表現(xiàn)出無(wú)明顯特征的亞臨床癥狀。2009年，蘭道亮等[9]分離出中國(guó)首株P(guān)SV,將其命名為csh，并用動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)該株病毒可以引起豬腹瀉、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀。2012年，又對(duì)華東地區(qū)960份臨床糞便樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，總陽(yáng)性率為17.2%。隨后有研究人員對(duì)華南地區(qū)和西南地區(qū)的PSV流行情況作了調(diào)查，陽(yáng)性檢出率分別為18.21%和26.6%。綜合以上報(bào)道可以看出，能夠?qū)е仑i腹瀉的病原如PEDV、RV、TGEV、PDCoV、PKoV、PBoV、PSV已在我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)中普遍存在。

從此次檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，PEDV總體陽(yáng)性率最高，為66.7%，其次是PKoV，陽(yáng)性率為56.8%。自2010-2011年以來(lái)，我國(guó)南部10個(gè)省豬場(chǎng)均有暴發(fā)PEDV，豬死亡數(shù)超100萬(wàn)頭，陳建飛[10]等通過(guò)在全國(guó)采樣對(duì)仔豬腹瀉病因進(jìn)行分析，證明從2010年12月開(kāi)始的導(dǎo)致大規(guī)模仔豬腹瀉的病因主要是豬流行性腹瀉病毒。而且近年來(lái)，PEDV流行范圍不斷擴(kuò)大，混合感染率增高[11]，本次檢測(cè)中PEDV與其他病毒的混合感染占PEDV總陽(yáng)性率的81.3%。從中可以看出PEDV是廣東地區(qū)導(dǎo)致豬腹瀉的主要病原。PKoV自2007年被報(bào)道后，已經(jīng)被證實(shí)廣泛存在于世界豬場(chǎng)中[4]，2015年，F(xiàn)an Yang等證明PKoV作為獨(dú)特的致病因子，產(chǎn)生腹瀉和特異性病理?yè)p傷，可能導(dǎo)致間質(zhì)性肺炎，腎病和胃腸炎[12]。由于PKoV在健康豬群中也能檢測(cè)出，所以其是否與當(dāng)前的豬腹瀉病情相關(guān)尚無(wú)定論，但PKoV與PEDV、RV、PDCoV、PBoV、PSV的混合感染可能是疾病發(fā)生的誘導(dǎo)因素。調(diào)查結(jié)果顯示，PKoV與PEDV的混合感染占PEDV與其他病原混合感染情況的66.2%，有學(xué)者認(rèn)為PKoV和PEDV共感染仔豬時(shí)，可能通過(guò)某種分子機(jī)制，增強(qiáng)了PEDV[13]的感染力，從而使仔豬死亡率增加，具體機(jī)制目前還尚未可知。從檢測(cè)結(jié)果中可以看到，引起豬病毒性腹瀉的病原如TGEV、RV的陽(yáng)性率分別為0%、23.4%，而2013年田云[14]等對(duì)廣東地區(qū)豬流行性腹瀉情況調(diào)查得到的結(jié)果分別為1.52%、16.06%，相較之下，TGEV陽(yáng)性率下降，RV陽(yáng)性率有所提高。雖然在本次調(diào)查中PDCoV總陽(yáng)性率為17.2%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PEDV的檢出率，值得注意的是與2015年翟少倫[15]等針對(duì)華南地區(qū)PDCoV的流行情況做的調(diào)查結(jié)果PDCoV陽(yáng)性率4.4%相比，PDCoV感染率有持續(xù)升高的勢(shì)頭。另外，已有多篇報(bào)道顯示，PBoV和PSV在國(guó)內(nèi)外豬群中分布較為普遍，但其對(duì)宿主的作用機(jī)制仍不十分清楚，在生產(chǎn)上也相應(yīng)地缺乏有效的防控措施，因此對(duì)豬群的潛在威脅不容忽視。

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InvestigationonporcinediarrheaPathogensinGuangdongprovinceform2016to2017

ZHOU Ling ， CHEN Gui-hua ， WU Zi-xian ， MAI Kai-jie ， LI Di ， WANG Sheng-yang ， MA Jing-yun ， ZHANG Xiang-bin

(College of Animal Science，South China Agricultural University ，Guangzhou 510642，China)

To evaluate the epidemic status of porcine diarrhea pathogens in Guangdong,the epidemiological investigation of diarrhea in some pig herds was conducted. In this study, 273 diarrhea samples were collected and detected by PCRor RT-PCR for diarrhea pathogens, including Porcine Epidemic Diarrhea Virus, Porcine Rotavirus, Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus,Porcine Deltacoronavirus, Porcine Kobuvirus, Porcine Bocavirus, and Porcine Sapelovirus which had been epidemic in recent years. The results showed that PEDV was still the cause of porcine diarrhea, and TGEVwas not detected. Particularly there was a high positive rate of PKoV which was only second to PEDV, Thus,the role of PKoV in porcine diarrhea is worth exploring further.

Guangdong ; porcine diarrhea ; diarrhea pathogens investigation ; PCR

ZHANG Xiang-bin

S858.28

A

0529-6005(2017)10-0003-03

2017-05-23

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)(2016YFD0501304)

周玲(1993-),女，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物健康養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)，E-mail：1481075258@qq.com

張祥斌，E-mail：Zhangxb@scau.edu.cn