王紅梅+王永平+陳麗如+王程

摘要：以三角槭葉片為試驗材料，比較了不同浸提液和浸提時間對色素浸提效果的影響，并對測定期內溫濕度的變化與葉綠素、類胡蘿卜素、花青素含量變化的相關性進行了分析。結果發(fā)現，適合葉綠素的浸提液為丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1，浸提時間為50 h；適合花青素的浸提液為0.1 mol/L的HCl，浸提時間為50 h。測定期內隨著溫度的降低，葉綠素、類胡蘿卜素都呈下降趨勢，而花青素的含量呈上升趨勢。葉綠素、類胡蘿卜素、花青素與測定期內平均溫度的相關性達顯著水平，而與濕度的相關性不強。

關鍵詞：三角槭；葉綠素；類胡蘿卜素；花青素；時序變化；溫度

中圖分類號： S792.350.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0228-03

三角槭（Acer buergerianum Miq.）又名三角楓，為槭樹科（Aceraceae）槭屬落葉喬木，因其葉片秋季變?yōu)榘导t色或橙紅色，成為一種良好的彩葉觀賞樹種。其主要分布區(qū)位于長江流域，華北、華南、西南各省也有栽培[1]。對于彩葉樹種變色機制的研究，國外起步較早，早在20世紀90年代，已有學者對紅葉雞爪槭和紅花槭在不同環(huán)境條件下葉色的變化進行了研究[2-3]。近年來，國內關于槭樹屬植物的變色生理在紅楓、紫花槭、白牛槭、擰筋槭、茶條槭、五角槭、自由人槭、紅花槭等種或品種中已經有相關報道[4-7]，而對于三角楓變色機制的研究僅榮立蘋等[1]進行了探索。

本研究以栽培于江蘇農林職業(yè)技術學院內的三角槭優(yōu)良單株為試驗材料，研究其轉色期葉片中葉綠素、花青素含量的變化，分析測定期內溫濕度的變化與色素含量的關系，為進一步研究三角槭葉色變化的生理機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為三角槭優(yōu)良單株，現栽培于江蘇農林職業(yè)技術學院，該單株生長健壯，于秋季葉色轉為亮紅色，落葉初期為12月。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣 本試驗于秋季三角槭進入轉色期開始測定，試驗期為2015年10月28日至12月2日。每周采樣1次，采樣時取樹冠向陽面中部當年生枝條的葉片[4，8-9]，同時利用溫濕度測定儀觀測采樣期前1周內的溫濕度變化。

1.2.2 色素的提取

1.2.2.1 葉綠素的提取 將采集的葉片用清水沖洗干凈，擦干，避開主脈，剪碎，并混合均勻[8]。稱取剪碎的葉片0.2 g，放入50 mL的三角瓶中，加入浸提液20 mL。浸提液分別為80%丙酮、丙酮 ∶ 無水乙醇=1 ∶ 1、95%乙醇。倒入浸提液后立即用保鮮膜封口，并用黑色塑料膜將整個瓶子包裹起來，防止漏光。將培養(yǎng)瓶放置于32 ℃的環(huán)境下避光恒溫進行浸提，浸提時間分別設定40、45、50 h，浸提過程中搖動幾次。試驗采用雙因素完全隨機組合設計，每個試驗處理重復3次。

1.2.2.2 花青素的提取 稱取剪碎的葉片1 g，放入50 mL三角瓶，加入0.1 mol/L的HCl 10 mL，封口，遮光（方法同葉綠素的提取），采用單因素試驗設計，試驗因子為浸提時間（40、45、50 h），每個處理重復3次。

1.2.3 光密度的測定 用分光光度計在470、645、646、649、663、665 nm的波長下測定葉綠素的D值，在530 nm下測定花青素的D值[10]。

1.2.4 色素的計算 色素計算公式分別用3種不同浸提液的色素濃度（mg/L）的計算公式進行計算，并對計算結果進行比較。80%丙酮作為浸提液的的計算公式為：

Ca=12.72×D663 nm-2.59×D645 nm；（1）

Cb=22.88×D645 nm-4.67×D663 nm；（2）

Ccar=（1 000×D470 nm-3.27×Ca-104×Cb）/229。（3）

丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1為浸提液的計算公式為：

Ca=12.21×D663 nm-2.81×D646 nm；（4）

Cb=20.13×D646 nm-5.03×D663 nm；（5）

Ccar=（1 000×D470 nm-3.27×Ca-104×Cb）/229。（6）

95%乙醇作為浸提液時的計算公式為：

Ca=13.95×D665 nm-6.88×D649 nm；（7）

Cb=24.96×D649 nm-7.32×D665 nm；（8）

Ccar=（1 000×D470 nm-2.05×Ca-114×Cb）/245[11]。（9）

將上述濃度計算結果轉換為色素含量，利用公式：

色素含量（mg/g）=色素濃度（mg/L）×浸提液體積（mL）/[1 000×葉片質量（g）]；（10）

計算色素的相對含量[12]。并對不同計算公式的計算結果進行誤差率的對比。

花青素的計算，以1 g鮮質量葉在10 mL浸提液中的D值為0.1時的花青素濃度記為1個色素單位，計算花青素相對含量（色素單位）[4，13-17]。

1.2.5 溫濕度的測定 空氣溫度和濕度的觀測，利用空氣溫濕度自動記錄儀于色素測定的前1周開始，每天進行觀測和記錄。統計到測定時為止1周的大氣溫濕度的最高、最低、平均值以及極差，并與色素含量變化進行相關性分析[13]。

2 結果與分析

2.1 葉綠素的不同浸提方法的比較

2.1.1 不同浸提效果比較 在比較不同浸提效果時，色素濃度的計算公式分別采用式（1）～（9），色素含量的計算利用公式（10），將計算出的色素含量采用SPSS 19.0進行方差分析和多重比較 （表1）。研究發(fā)現，處理4、5、6的葉綠素a、葉綠素b的平均含量之間沒有顯著差異，而這3個處理與其他各處理間均存在顯著差異。類胡蘿卜素平均含量在處理4～9之間無顯著差異，而與其他處理間差異顯著。綜合分析得出：以丙酮與乙醇=1 ∶ 1的浸提液浸提效果最好，與其他2種浸提液間存在顯著差異；而不同浸提時間的各處理間差異不顯著。endprint

2.1.2 不同色素計算公式的比較 浸提液不同，色素的計算公式也不同。固定浸提時間為50 h，以3種不同浸提液浸提色素，并用相應的計算公式進行計算，對其計算結果與采用公式（4）～（6）計算的結果進行比較。以（4）～（6）計算結果為實測值，其他公式計算的為測定值，利用公式：誤差率=（測定值-實測值）/實測值×100%，計算不同測定公式的誤差率（表2）。

經誤差率比較發(fā)現，采用不同浸提液計算公式的計算結果誤差率相差很大（表2）。這就說明，在進行色素吸光度測定時波長的選擇必須與浸提液的吸收峰對應，計算也必須運用相應的計算公式，而不能套用Lichtenthaler等對Arnon法進行的修正公式。

2.2 葉綠素的時序性變化

色素時序性變化的試驗，均采用浸提液2（丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1），浸提時間為50 h。在測定期內，每7 d測定1次數據。研究發(fā)現，從2015年10月至12月，三角槭的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素a+b均呈短暫上升后急速下降，葉綠素a+b的含量從最大的4.19 mg/g降至0.27 mg/g，類胡蘿卜素含量也有所下降，但下降幅度較為平緩（圖1）。

2.3 花青素的時效性變化

研究發(fā)現，在測定期內花青素的相對含量隨著時間的變化呈逐漸增加的趨勢，由7.30增至17.50（圖2）。

2.4 花青素相對含量、類胡蘿卜素與總葉綠素比值的變化

研究發(fā)現，在測定期內，花青素與總葉綠素比值呈上升趨勢，但開始上升較為緩慢，至11月中旬后，迅速上升。而葉綠素與類胡蘿卜素比值變化幅度比較小（圖3）。因此，測定株表現在葉片顏色上是由綠變黃并不明顯，但隨著花青素含量的增加，葉片呈現較明顯的紅色。

2.5 測定期內溫濕度的變化

測定期內平均溫度呈下降趨勢，由19.9 ℃下降到 10.8 ℃（圖4）。同時，平均濕度差呈現類似的下降趨勢（圖5）。

2.6 葉綠素、花青素與溫濕度的相關性分析

對葉綠素和花青素含量的變化與溫濕度變化進行相關性分析，結果發(fā)現，葉綠素a、類胡蘿卜素的含量均與平均氣溫間存在較強的正相關，即隨著氣溫的降低，葉綠素、類胡蘿卜素含量均降低。其含量與相對濕度的相關性不強，即色素含量的變化受濕度影響較小?；ㄇ嗨氐暮颗c平均氣溫間存在較強的負相關，隨著氣溫的降低，花青素含量逐漸增加，反映了花青素在不斷的合成和積累（表3）。因此， 葉片的顏色也逐漸變?yōu)榧t色。

3 結論與討論

在三角槭葉片色素和花青素測定中，葉綠素的浸提液以丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1，浸提50 h，效果較好。使用不同浸提液必須使用此浸提液最大吸光度下的計算公式，而不能為了簡便選擇固定公式。

在色素含量的時序性變化中發(fā)現，隨著平均氣溫的降低，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素均呈下降的趨勢，而且葉綠素a、類胡蘿卜素與平均氣溫之間存在較強的正相關。花青素的含量隨著平均氣溫的降低而升高，兩者呈現負的強相關。

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