王紅梅+王永平+陳麗如+王程

摘要：以三角槭葉片為試驗(yàn)材料，比較了不同浸提液和浸提時(shí)間對色素浸提效果的影響，并對測定期內(nèi)溫濕度的變化與葉綠素、類胡蘿卜素、花青素含量變化的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適合葉綠素的浸提液為丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1，浸提時(shí)間為50 h；適合花青素的浸提液為0.1 mol/L的HCl，浸提時(shí)間為50 h。測定期內(nèi)隨著溫度的降低，葉綠素、類胡蘿卜素都呈下降趨勢，而花青素的含量呈上升趨勢。葉綠素、類胡蘿卜素、花青素與測定期內(nèi)平均溫度的相關(guān)性達(dá)顯著水平，而與濕度的相關(guān)性不強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：三角槭；葉綠素；類胡蘿卜素；花青素；時(shí)序變化；溫度

中圖分類號(hào)： S792.350.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0228-03

三角槭（Acer buergerianum Miq.）又名三角楓，為槭樹科（Aceraceae）槭屬落葉喬木，因其葉片秋季變?yōu)榘导t色或橙紅色，成為一種良好的彩葉觀賞樹種。其主要分布區(qū)位于長江流域，華北、華南、西南各省也有栽培[1]。對于彩葉樹種變色機(jī)制的研究，國外起步較早，早在20世紀(jì)90年代，已有學(xué)者對紅葉雞爪槭和紅花槭在不同環(huán)境條件下葉色的變化進(jìn)行了研究[2-3]。近年來，國內(nèi)關(guān)于槭樹屬植物的變色生理在紅楓、紫花槭、白牛槭、擰筋槭、茶條槭、五角槭、自由人槭、紅花槭等種或品種中已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道[4-7]，而對于三角楓變色機(jī)制的研究僅榮立蘋等[1]進(jìn)行了探索。

本研究以栽培于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)的三角槭優(yōu)良單株為試驗(yàn)材料，研究其轉(zhuǎn)色期葉片中葉綠素、花青素含量的變化，分析測定期內(nèi)溫濕度的變化與色素含量的關(guān)系，為進(jìn)一步研究三角槭葉色變化的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為三角槭優(yōu)良單株，現(xiàn)栽培于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，該單株生長健壯，于秋季葉色轉(zhuǎn)為亮紅色，落葉初期為12月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣 本試驗(yàn)于秋季三角槭進(jìn)入轉(zhuǎn)色期開始測定，試驗(yàn)期為2015年10月28日至12月2日。每周采樣1次，采樣時(shí)取樹冠向陽面中部當(dāng)年生枝條的葉片[4，8-9]，同時(shí)利用溫濕度測定儀觀測采樣期前1周內(nèi)的溫濕度變化。

1.2.2 色素的提取

1.2.2.1 葉綠素的提取 將采集的葉片用清水沖洗干凈，擦干，避開主脈，剪碎，并混合均勻[8]。稱取剪碎的葉片0.2 g，放入50 mL的三角瓶中，加入浸提液20 mL。浸提液分別為80%丙酮、丙酮 ∶ 無水乙醇=1 ∶ 1、95%乙醇。倒入浸提液后立即用保鮮膜封口，并用黑色塑料膜將整個(gè)瓶子包裹起來，防止漏光。將培養(yǎng)瓶放置于32 ℃的環(huán)境下避光恒溫進(jìn)行浸提，浸提時(shí)間分別設(shè)定40、45、50 h，浸提過程中搖動(dòng)幾次。試驗(yàn)采用雙因素完全隨機(jī)組合設(shè)計(jì)，每個(gè)試驗(yàn)處理重復(fù)3次。

1.2.2.2 花青素的提取 稱取剪碎的葉片1 g，放入50 mL三角瓶，加入0.1 mol/L的HCl 10 mL，封口，遮光（方法同葉綠素的提?。?，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因子為浸提時(shí)間（40、45、50 h），每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 光密度的測定 用分光光度計(jì)在470、645、646、649、663、665 nm的波長下測定葉綠素的D值，在530 nm下測定花青素的D值[10]。

1.2.4 色素的計(jì)算 色素計(jì)算公式分別用3種不同浸提液的色素濃度（mg/L）的計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，并對計(jì)算結(jié)果進(jìn)行比較。80%丙酮作為浸提液的的計(jì)算公式為：

Ca=12.72×D663 nm-2.59×D645 nm；（1）

Cb=22.88×D645 nm-4.67×D663 nm；（2）

Ccar=（1 000×D470 nm-3.27×Ca-104×Cb）/229。（3）

丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1為浸提液的計(jì)算公式為：

Ca=12.21×D663 nm-2.81×D646 nm；（4）

Cb=20.13×D646 nm-5.03×D663 nm；（5）

Ccar=（1 000×D470 nm-3.27×Ca-104×Cb）/229。（6）

95%乙醇作為浸提液時(shí)的計(jì)算公式為：

Ca=13.95×D665 nm-6.88×D649 nm；（7）

Cb=24.96×D649 nm-7.32×D665 nm；（8）

Ccar=（1 000×D470 nm-2.05×Ca-114×Cb）/245[11]。（9）

將上述濃度計(jì)算結(jié)果轉(zhuǎn)換為色素含量，利用公式：

色素含量（mg/g）=色素濃度（mg/L）×浸提液體積（mL）/[1 000×葉片質(zhì)量（g）]；（10）

計(jì)算色素的相對含量[12]。并對不同計(jì)算公式的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行誤差率的對比。

花青素的計(jì)算，以1 g鮮質(zhì)量葉在10 mL浸提液中的D值為0.1時(shí)的花青素濃度記為1個(gè)色素單位，計(jì)算花青素相對含量（色素單位）[4，13-17]。

1.2.5 溫濕度的測定 空氣溫度和濕度的觀測，利用空氣溫濕度自動(dòng)記錄儀于色素測定的前1周開始，每天進(jìn)行觀測和記錄。統(tǒng)計(jì)到測定時(shí)為止1周的大氣溫濕度的最高、最低、平均值以及極差，并與色素含量變化進(jìn)行相關(guān)性分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素的不同浸提方法的比較

2.1.1 不同浸提效果比較 在比較不同浸提效果時(shí)，色素濃度的計(jì)算公式分別采用式（1）～（9），色素含量的計(jì)算利用公式（10），將計(jì)算出的色素含量采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和多重比較 （表1）。研究發(fā)現(xiàn)，處理4、5、6的葉綠素a、葉綠素b的平均含量之間沒有顯著差異，而這3個(gè)處理與其他各處理間均存在顯著差異。類胡蘿卜素平均含量在處理4～9之間無顯著差異，而與其他處理間差異顯著。綜合分析得出：以丙酮與乙醇=1 ∶ 1的浸提液浸提效果最好，與其他2種浸提液間存在顯著差異；而不同浸提時(shí)間的各處理間差異不顯著。endprint

2.1.2 不同色素計(jì)算公式的比較 浸提液不同，色素的計(jì)算公式也不同。固定浸提時(shí)間為50 h，以3種不同浸提液浸提色素，并用相應(yīng)的計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，對其計(jì)算結(jié)果與采用公式（4）～（6）計(jì)算的結(jié)果進(jìn)行比較。以（4）～（6）計(jì)算結(jié)果為實(shí)測值，其他公式計(jì)算的為測定值，利用公式：誤差率=（測定值-實(shí)測值）/實(shí)測值×100%，計(jì)算不同測定公式的誤差率（表2）。

經(jīng)誤差率比較發(fā)現(xiàn)，采用不同浸提液計(jì)算公式的計(jì)算結(jié)果誤差率相差很大（表2）。這就說明，在進(jìn)行色素吸光度測定時(shí)波長的選擇必須與浸提液的吸收峰對應(yīng)，計(jì)算也必須運(yùn)用相應(yīng)的計(jì)算公式，而不能套用Lichtenthaler等對Arnon法進(jìn)行的修正公式。

2.2 葉綠素的時(shí)序性變化

色素時(shí)序性變化的試驗(yàn)，均采用浸提液2（丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1），浸提時(shí)間為50 h。在測定期內(nèi)，每7 d測定1次數(shù)據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，從2015年10月至12月，三角槭的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素a+b均呈短暫上升后急速下降，葉綠素a+b的含量從最大的4.19 mg/g降至0.27 mg/g，類胡蘿卜素含量也有所下降，但下降幅度較為平緩（圖1）。

2.3 花青素的時(shí)效性變化

研究發(fā)現(xiàn)，在測定期內(nèi)花青素的相對含量隨著時(shí)間的變化呈逐漸增加的趨勢，由7.30增至17.50（圖2）。

2.4 花青素相對含量、類胡蘿卜素與總?cè)~綠素比值的變化

研究發(fā)現(xiàn)，在測定期內(nèi)，花青素與總?cè)~綠素比值呈上升趨勢，但開始上升較為緩慢，至11月中旬后，迅速上升。而葉綠素與類胡蘿卜素比值變化幅度比較?。▓D3）。因此，測定株表現(xiàn)在葉片顏色上是由綠變黃并不明顯，但隨著花青素含量的增加，葉片呈現(xiàn)較明顯的紅色。

2.5 測定期內(nèi)溫濕度的變化

測定期內(nèi)平均溫度呈下降趨勢，由19.9 ℃下降到 10.8 ℃（圖4）。同時(shí)，平均濕度差呈現(xiàn)類似的下降趨勢（圖5）。

2.6 葉綠素、花青素與溫濕度的相關(guān)性分析

對葉綠素和花青素含量的變化與溫濕度變化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉綠素a、類胡蘿卜素的含量均與平均氣溫間存在較強(qiáng)的正相關(guān)，即隨著氣溫的降低，葉綠素、類胡蘿卜素含量均降低。其含量與相對濕度的相關(guān)性不強(qiáng)，即色素含量的變化受濕度影響較小?；ㄇ嗨氐暮颗c平均氣溫間存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，隨著氣溫的降低，花青素含量逐漸增加，反映了花青素在不斷的合成和積累（表3）。因此， 葉片的顏色也逐漸變?yōu)榧t色。

3 結(jié)論與討論

在三角槭葉片色素和花青素測定中，葉綠素的浸提液以丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1，浸提50 h，效果較好。使用不同浸提液必須使用此浸提液最大吸光度下的計(jì)算公式，而不能為了簡便選擇固定公式。

在色素含量的時(shí)序性變化中發(fā)現(xiàn)，隨著平均氣溫的降低，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素均呈下降的趨勢，而且葉綠素a、類胡蘿卜素與平均氣溫之間存在較強(qiáng)的正相關(guān)?；ㄇ嗨氐暮侩S著平均氣溫的降低而升高，兩者呈現(xiàn)負(fù)的強(qiáng)相關(guān)。

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