郭正兵+韓柏明+郭強

摘要：以波姬紅無花果為試材，40 ℃高溫脅迫經(jīng)茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗，分析與抗逆相關的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、茉莉酸合成路徑中脂氧合酶（LOX）活性變化及丙二醛、脯氨酸、多酚含量，同時，采用黑絨金龜蠶食傷害經(jīng)茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗，分析與生物脅迫相關的多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性變化及單寧、胰蛋白酶抑制素含量。結果表明，高溫脅迫經(jīng)50 μmol/L茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗，其SOD、POD、CAT活性與未用茉莉酸甲酯處理（對照）相比有顯著增加，脯氨酸、多酚含量提高，丙二醛含量降低；生物蠶食經(jīng)50 μmol/L茉莉酸甲酯處理的幼苗葉片，其PPO、PAL活性增加，單寧、胰蛋白酶抑制素含量提高。經(jīng)茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗，高溫脅迫、生物蠶食能通過增加SOD、POD、CAT活性抵御非生物逆境的脅迫，通過提高PPO、PAL活性增強對生物脅迫的抗性。

關鍵詞：無花果；抗逆；茉莉酸甲酯；超氧化物歧化酶；過氧化物酶；多酚氧化酶；高溫脅迫；生物蠶食

中圖分類號： S663.301 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0138-06

無花果（Ficus carica L.）為?？崎艑俣嗄晟淙~灌木或小喬木，原產(chǎn)于亞洲西部，目前我國各地均有栽培，尤以新疆維吾爾自治區(qū)南部、廣東、福建沿海地區(qū)、江浙一帶及膠東半島栽培較多，北京以南的內陸地區(qū)近些年無花果栽培面積也迅速增加，北京以北地區(qū)因天氣寒冷，若栽培無花果須采用溫室大棚等設施進行越冬。無花果栽培面積的不斷擴大導致需苗量越來越大，而植物生長調節(jié)劑研究應用可為無花果的廣泛栽培提供理論指導[1]。

茉莉酸甲酯（MeJA）是通過硬脂酸途徑產(chǎn)生的脂肪酸衍生物，廣泛存在于各類植物中[2]。當植物受到創(chuàng)傷、昆蟲咬食或病原菌侵染等引發(fā)局部及系統(tǒng)性的傷害信號時，會產(chǎn)生茉莉酸甲酯等茉莉酸類物質，進而提高植物本身的抗性[3]。茉莉酸甲酯對植物的調節(jié)作用主要體現(xiàn)在2個方面：一是調節(jié)植物種子萌發(fā)、花粉發(fā)育、衰老等生長發(fā)育，二是調節(jié)植物傷害應答、抵抗病原菌侵襲等防御系統(tǒng)，并在轉錄水平上影響植物次生代謝[4]。茉莉酸類物質誘導植物次生代謝物含量的增加，主要是以信號分子的形式參與到植物次生代謝過程中，調控相關關鍵酶基因的表達，影響關鍵酶活性，從而對次生代謝物的產(chǎn)生進行調控[5]，茉莉酸類物質在植物抵御逆境脅迫上起著關鍵作用。本研究利用茉莉酸甲酯處理經(jīng)高溫脅迫、生物蠶食的無花果幼苗葉片，進行抗逆酶活性分析，為茉莉酸甲酯在無花果中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用外植體為波姬紅無花果幼嫩枝條，2014年3月采自江蘇省句容市江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院。試驗用試劑為 6-芐基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、赤霉素（GA）、2% NaClO、0.1% HgCl2、75%乙醇、蔗糖、瓊脂、MS培養(yǎng)基等。茉莉酸甲酯用適量的無水乙醇溶解，加入Tween-80乳化，并用蒸餾水定容，使Tween-80終濃度為1%。

1.2 無花果幼苗的擴繁

將無花果幼嫩枝條莖段接種培養(yǎng)30 d，將初始培養(yǎng)基上分化、生長健壯的芽切下，接種于MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+GA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8.0 g/L（pH值5.8）的壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，再將生長健壯的無花果組培苗接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照度2 000 lx、光照時間14 h/d。

1.3 無花果幼苗的移植與試驗處理

將無菌的波姬紅無花果組培苗移栽到裝有營養(yǎng)土 ∶ 蛭石為1 ∶ 1的營養(yǎng)缽中，選取4葉株齡的高度、長勢、葉色基本一致的幼苗置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1周，溫度為25 ℃、光照度為 2 000 lx、光照時間為14 h/d、相對濕度為70%～80%，其間正常澆水；采用50 μmol/L茉莉酸甲酯溶液均勻噴施無花果幼苗的葉表面和葉背，至藥液欲滴為度，以噴施相同濃度乙醇和Tween-80、不含茉莉酸甲酯的水溶液為對照，光照培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1 d。一部分幼苗于40 ℃高溫脅迫1 d，取出，置于適宜環(huán)境中自然生長，并在脅迫前（0 d）及脅迫后、1、2、3、4 d 采集葉樣；另一部分幼苗用黑絨金龜蠶食葉片進行生物脅迫，分別于處理后0、1、2、3、4 d采集葉樣，重復4次，每重復12株苗。葉片洗凈，用蒸餾水沖洗，吸水紙吸干，去除粗大的主葉脈，待測。

1.4 生理指標的測定

1.4.1 丙二醛 參照孔祥生等的方法[6]采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛含量：吸取離心的上清液2 mL（對照為 2 mL 蒸餾水）于試管中，加入2 mL 0.6% TBA溶液，搖勻；沸水浴煮沸，自試管內溶液出現(xiàn)小氣泡開始計時，約10 min；取出試管，冷卻，3 000 r/min離心15 min；取上清液并測量體積，以0.6% TBA溶液為空白，分別測定波長為450、532、600 nm處的吸光度。

1.4.2 脯氨酸 參照李合生的方法[7]采用茚三酮法測定脯氨酸含量：準確吸取葉片提取液移入試管中，加水補足體積到1 mL；分別加入0.25 mL甲酸、1.0 mL茚三酮-乙二醇甲醚溶液，沸水中加熱15 min；取出，移入70 ℃恒溫水浴鍋中繼續(xù)發(fā)色10 min，加入5 mL異丙醇溶液，靜置5 min；測定波長 510 nm 處吸光度，利用脯氨酸濃度標準曲線計算脯氨酸含量。

1.4.3 多酚 參照卜彥花等的方法[8]測定無花果葉片多酚含量。

1.4.4 單寧 采用香草醛法[9]測定單寧含量：稱取葉片 0.2 g，剪碎，浸入25 mL甲醇中提取2 h；取上清液，添加4%香草醛、甲醇溶液各2.0 mL，鹽酸1.0 mL，混合，30 ℃水浴 20 min；室溫下用分光光度計測定波長為510 nm處的吸光度，并以不同濃度單寧酸為標樣繪制單寧濃度與吸光度的標準曲線，計算單寧含量，單位為mg/g。endprint

1.4.5 胰蛋白酶抑制素[10] 準確稱取葉片0.2 g，加入4 mL含7%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、1.67 mmol/L苯硫脲、0.3 mol/L KCl、0.4 mmol/L維生素C（抗壞血酸）的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH值7.8），研磨成勻漿；13 000 r/min 4 ℃離心10 min；取上清液，測定胰凝乳蛋白酶含量，測定時，先在含有0. 001 5 mg胰凝乳蛋白酶的 1.0 mmol/L HCl溶液中加入等量提取液混合反應10 min，再取100 μL混合液與2.9 mL含有0.5 mmol /L N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯（BTEE）的甲醇-磷酸緩沖液（pH值8.0）混勻，以BTEE和胰凝乳蛋白酶作對照，于波長256 nm處測定10 min內吸光度的變化值，單位時間內吸光度變化0.01代表生成1個單位胰蛋白酶抑制素，用U/g表示。

1.5 抗氧化酶活性的測定

稱取0.5 g無花果葉片置于研缽內，加入少量經(jīng)預冷的50 mmol/L含1% PVP、pH值為7.8的磷酸緩沖液，冰浴研磨；勻漿移入離心管，并用相應的磷酸緩沖液分2次沖洗研缽，并移入離心管，使提取液的終體積為5 mL；提取液于冷凍離心機內11 000 r/min 4 ℃離心20 min；取上清液，測定酶的活性，測定溫度為25 ℃。

1.5.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL） 參照鄒志燕等的方法[11]測定PAL活性：在2.80 mL含20 mmol/L L-苯丙氨酸的硼酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值8.8）中加入20 μL酶提取液，混勻，于波長290 nm處測定2 min內吸光度的變化，以1 min吸光度變化0.01表示1個酶活力單位，用U/（g·min）表示。

1.5.2 多酚氧化酶（PPO） 以鄰苯二酚為底物，參照宮玉艷等的方法[12]測定PPO活性：在2.9 mL含0.02 mol/L鄰苯二酚的磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值7.4）中加入100 μL酶提取液，混勻，于波長420 nm處測定2 min內吸光度的變化，以1 min吸光度變化0.01表示1個酶活力單位，用U/（g·min）表示。

1.5.3 過氧化物酶（POD） 以愈創(chuàng)木酚為底物，參照鄭炳松的方法[13]測定POD活性：在2.99 mL含0.2%愈創(chuàng)木酚和0.3% H2O2的磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH值7.4）中加入 10 μL 酶提取液，混勻，于波長470 nm處測定3 min內吸光度的變化，以1 min吸光度變化0.1表示1個酶活力單位，用 U/（g·min） 表示。

1.5.4 過氧化氫酶（CAT） 參照孔祥生等的方法[6]測定CAT活性：在含0.3% H2O2的磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH值7.0）中加入20 μL酶提取液，混勻，于波長240 nm處測定2 min內吸光度的變化，以1 min吸光度變化0.1表示1個酶活力單位，用U/（g·min）表示。

1.5.5 超氧化物歧化酶（SOD） 采用鄰苯三酚自氧化法[7]測定SOD活性：將待測酶提取液加入到緩沖液中，混勻；加入鄰苯三酚，迅速混勻，快速倒入石英比色杯中，25 ℃恒溫池中于波長325 nm處連續(xù)測定2 min內吸光度變化，以1 mL反應液中1 min抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。

1.5.6 脂氧合酶（LOX）[14] 在含25 μL油酸鈉母液、2 900 μL 磷酸緩沖液的溶液中加入75 μL粗酶液，以磷酸緩沖液為空白對照，25 ℃恒溫池中于波長234 nm處測定吸光度，加酶液后30 s開始計時，每隔15 s測1次吸光度，共測量6次，以1 g樣品1 min吸光度增加0.01為1個LOX酶活力單位。重復3次。

1.5.7 DPPH自由基清除率和總還原力測定 （1）DPPH自由基清除率的測定。在10 mL比色管中依次加入4.0 mL DPPH溶液和黃酮提取液，再加入無水乙醇至刻度，混勻立即用1 cm比色皿在517 nm波長處測吸光度，記為Di；再在溫室避光保存30 min后測吸光度，記為Dj；對照試驗為只加DPPH的乙醇溶液，其吸光度記為Dc。按下式計算自由基清除率（K）：K=[1-（Di-Dj）/Dc]×100%。（2）總還原力的測定。在10 mL離心管中分別加入0.2 mol/L的pH值為6.6的磷酸緩沖液2.5 mL和樣品溶液1 mL，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合均勻后于50℃反應20 min。取出后加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應，5 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3，混勻后靜置 10 min，在700 nm處檢測吸光度。以維生素C作為陽性對照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Spsspasw Statistics 17.0軟件進行統(tǒng)計，采用Duncans法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 茉莉酸甲酯處理對高溫脅迫無花果幼苗植株的影響

50 μmol/L茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗經(jīng)40 ℃高溫脅迫1 d，并在適宜環(huán)境中自然生長3個月，結果發(fā)現(xiàn)，所有的植株都受到不同程度的高溫脅迫影響，傷害輕微的植株的葉片出現(xiàn)零星褐色斑點或局部小面積壞死斑塊，傷害嚴重的植株的葉片慢慢枯萎脫落，生長點壞死，但植株未見死亡，仍可從莖基部萌發(fā)側芽，恢復生長；茉莉酸甲酯處理的植株恢復生長相對較快，葉片相對較大。由表1可見，未噴施茉莉酸甲酯（對照）處理的植株傷害相對較重，嚴重受害植株占比、葉片死亡率分別為60%、20%，而茉莉酸甲酯處理的嚴重受害植株占比、葉片死亡率分別僅為25%、5%。

2.2 茉莉酸甲酯處理對高溫脅迫無花果葉片丙二醛、脯氨酸、多酚含量的影響endprint

2.2.1 丙二醛 由圖1可見，與對照相比，噴施50 μmol/L茉莉酸甲酯的無花果，其葉片丙二醛含量有顯著降低（P<0.05）；脅迫處理第1 d采樣，無花果葉片丙二醛含量較脅迫當天采樣（0 d）有所上升，后呈緩慢下降態(tài)勢。

2.2.2 脯氨酸 由圖2可見，與丙二醛相反，噴施50 μmol/L茉莉酸甲酯的無花果，其葉片脯氨酸含量顯著高于對照（P<0.05）；脯氨酸含量變化趨勢與丙二醛也有所不同，對照與噴施茉莉酸甲酯處理的無花果，其葉片脯氨酸含量在第1～3 d采樣時呈上升態(tài)勢，第4 d略有下降。

2.2.3 多酚 由表2可見，茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗經(jīng)高溫脅迫，其葉片總酚含量迅速升高，顯著高于對照（P<0.05），其中沒食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、龍膽酸、丁香酸、p-香豆酸的含量在第3 d采樣時相對最高，均顯著高于對照（P<0.05），無花果幼苗通過促進葉片多酚的合成以抵御逆境脅迫；對照植株經(jīng)高溫脅迫處理，沒食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、龍膽酸、丁香酸、p-香豆酸、總酚含量低于同期茉莉酸甲酯處理的植株。

2.3 茉莉酸甲酯處理對高溫脅迫無花果葉片抗氧化酶活性的影響

2.3.1 LOX 茉莉酸是植物進行抗逆的一種重要激素，LOX是茉莉酸合成路徑中的第一個關鍵酶，且茉莉酸具有自我激活合成路徑的作用，外源茉莉酸的噴施能促進內源茉莉酸的合成，而LOX活性的高低可反映內源茉莉酸的含量大小。由圖3可見，茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗經(jīng)高溫脅迫，其葉片LOX活性在1～3 d采樣時呈上升態(tài)勢，4 d時略有下降，其中，第2～3 d采樣的葉片LOX活性顯著高于對照處理（P<0.05）；對照葉片的LOX活性呈緩慢上升趨勢，變化相對較小。

2.3.2 SOD 由圖4可見，茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗經(jīng)高溫脅迫，其葉片SOD活性在1～3 d采樣時呈上升態(tài)勢，4 d時略有下降，其中，2～4 d采樣的葉片SOD活性顯著高于對照處理（P<0.05）；對照處理的無花果葉片其SOD活性在 1 d 采樣時含量上升，后逐漸下降。

2.3.3 CAT 由圖5可見，茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗經(jīng)高溫脅迫，其葉片CAT活性在1～2 d采樣時上升，3～4 d 呈下降態(tài)勢，其中，1～4 d采樣的葉片CAT活性顯著高于對照處理（P<0.05）；對照處理的葉片CAT活性變化趨勢與茉莉酸甲酯處理一致，呈先升后降態(tài)勢。

2.3.4 POD 由圖6可見，茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗經(jīng)高溫脅迫，其葉片POD活性變化趨勢與CAT一致，在1～2 d 采樣時上升，3～4 d下降，其中，1～4 d采樣的葉片POD活性顯著高于對照處理（P<0.05）；對照處理的葉片POD活性呈先升后降態(tài)勢。

2.3.5 DPPH自由基的清除和總還原力 由圖7、圖8可見，茉莉酸甲酯和對照處理的無花果幼苗經(jīng)高溫脅迫，其植株DPPH自由基清除率、總還原力隨采樣時期的延長呈先升后降趨勢，這可能與高溫脅迫后酚酸、沒食子酸、總酚含量的變化相關；50 μmol/L茉莉酸甲酯處理的植株DPPH自由基清除率和總還原力在2～4 d采樣時均顯著高于對照（P<0.05）。

2.4 茉莉酸甲酯處理對生物脅迫無花果葉片抗性物質的影響

2.4.1 單寧 利用黑絨金龜蠶食經(jīng)茉莉酸甲酯處理的無花果葉片，對其進行生物脅迫，結果（表9）表明，葉片單寧含量在1～2 d采樣時上升，3～4 d下降，其中，1～4 d采樣的葉片POD活性顯著高于對照處理（P<0.05）；對照葉片單寧含量變化趨勢與茉莉酸甲酯處理的一致。

2.4.2 胰蛋白酶抑制素 由圖10可見，茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗經(jīng)生物脅迫，其葉片胰蛋白酶抑制素含量變化趨勢與單寧一致，在1～2 d采樣時上升，3～4 d下降，其中，1～3 d采樣的葉片胰蛋白酶抑制素含量顯著高于對照處理（P<0.05）；對照處理的葉片胰蛋白酶抑制素也呈先升后降態(tài)勢。

2.5 茉莉酸甲酯處理對生物脅迫無花果葉片抗性酶活性的影響

由圖11、圖12可見，茉莉酸甲酯處理的無花果幼苗經(jīng)生物脅迫，其葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性在1～3 d采樣時有明顯上升，且顯著高于對照（P<0.05），在4 d采樣時雖有明顯下降，但與對照相比差異顯著（P<0.05）。

2.6 茉莉酸甲酯處理對高溫、生物脅迫無花果葉片內源茉莉酸含量的影響

茉莉酸在植物抗逆方面起著重要的作用。由圖13可見，無論是高溫處理（4 d）后還是生物蠶食（4 d）后，茉莉酸甲酯處理的無花果葉片的茉莉酸含量明顯高于對照，這可能是因為用茉莉酸甲酯處理能刺激植物體內茉莉酸的合成，進而來應答外界環(huán)境的脅迫。

3 結論與討論

植物在生長發(fā)育過程中必須不斷進行生理代謝來應對外界生物和非生物脅迫環(huán)境以維持生存，而防御因子是調控植物生長及繁殖最重要的一個因子，可應對外來的非生物和生物脅迫[15-16]。植物激素在調節(jié)植物代謝應答逆境脅迫方面起著關鍵的作用，主要有茉莉酸（JA）、水楊酸、乙烯3種激素[17]。茉莉酸是一種重要的植物生長調節(jié)劑，在調控植物種子萌發(fā)、根伸長、胚胎發(fā)育、性別決定、幼苗發(fā)育、塊莖形成、果實成熟、葉片衰老等生長發(fā)育方面起著重要的作用[18-20]，尤其在植物干旱、鹽脅迫、高溫等逆境脅迫應答[21-23]中作用更為明顯，但在無花果上的相關研究相對較少。本試驗研究表明，高溫脅迫或生物蠶食經(jīng)茉莉酸甲酯處理的無花果，其葉片內源茉莉酸含量急劇上升，這與Pedranzani等的研究結論[24-26]較為吻合，鹽脅迫、傷口、滲透脅迫、紫外輻射等不同脅迫都會導致內源茉莉酸含量的增加，并啟動一系列應答逆境脅迫的途徑。

當植物遭受脅迫時，體內會產(chǎn)生羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O-2 · ）、過氧化氫（H2O2）等活性氧（ROS），過多的ROS能使脂類、蛋白質、核酸氧化[27]，造成植物氧化損傷[28]，而植物會產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽過氧化物（GPX）等一些抗氧化的酶來抵御傷害。茉莉酸能使植物產(chǎn)生抗氧化劑和次級代謝產(chǎn)物[29]，增強植物的抗氧化系統(tǒng)及其清除自由基的能力[30]，如利用茉莉酸甲酯處理蓖麻，能使其體內APX活性升高；茉莉酸甲酯能減輕百草枯藥劑對玉米的氧化傷害[31]；懸鉤子經(jīng)過茉莉酸甲酯處理后抗氧化能力迅速升高[32]。本試驗結果表明，茉莉酸甲酯處理能使高溫脅迫處理的無花果葉片抗氧化酶SOD、POD、CAT活性增強，葉片內源DPPH清除率、總還原力升高，使葉片的受傷害程度降低，與表型分析一致。endprint

除非生物脅迫響應外，茉莉酸也參與無花果植株的生物脅迫響應。茉莉酸甲酯處理能增強植物對害蟲的抗性[33]；田間西紅柿經(jīng)茉莉酸甲酯處理，西花薊馬、蚜蟲的數(shù)量銳減[34]，且甜菜夜蛾數(shù)量也減少很多[35]；桃噴施茉莉酸甲酯，蚜蟲數(shù)量減少[36]；與對照植株比，茉莉酸甲酯處理的菠菜其真菌侵害數(shù)量減少，且茉莉酸甲酯能減少線蟲對燕麥、菠菜等植物的傷害[37]。另外，茉莉酸甲酯熏蒸棉花還能誘導植株產(chǎn)生乙酸葉醇酯、羅勒烯、金合歡烯等揮發(fā)性物質，通過間接誘導釋放揮發(fā)性物質和直接防御蛋白以抵御昆蟲的傷害[38]。本試驗結果表明，利用黑絨金龜蠶食經(jīng)茉莉酸甲酯處理的無花果葉片，其內源茉莉酸含量增加，PAL、PPO氧化酶活性急劇上升，單寧、胰蛋白酶抑制素物質含量增加，這些物質含量的增加能抵御外界生物的進一步侵害，使植物盡快恢復正常生長狀態(tài)。

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