張 悅 高曉建 葉金明 陳 楠 杜雪地 張曉君 邴旭文

(1. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009; 2. 揚(yáng)州市水產(chǎn)生產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站, 揚(yáng)州 225101; 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無(wú)錫 214081)

翹嘴鱖病原嗜水氣單胞菌分子特征及LAMP檢測(cè)方法的建立

張 悅1高曉建1葉金明2陳 楠1杜雪地1張曉君1邴旭文3

(1. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009; 2. 揚(yáng)州市水產(chǎn)生產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站, 揚(yáng)州 225101; 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無(wú)錫 214081)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種危害鱖魚(yú)養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要病原細(xì)菌, 為進(jìn)一步明確該病原菌的分子特征及建立快速檢測(cè)技術(shù), 實(shí)驗(yàn)對(duì)引起翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)暴發(fā)性死亡的病原嗜水氣單胞菌進(jìn)行了致病性、菌株毒力特征研究, 同時(shí)以嗜水氣單胞菌氣溶素基因aerA為分子靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物, 利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了病原嗜水氣單胞菌的快速檢測(cè)方法。結(jié)果表明, 本次引起翹嘴鱖暴發(fā)性死亡的病原嗜水氣單胞菌半致死濃度為1.6×106CFU/mL, 攜帶aerA等14種毒力基因, 此14種毒力基因可用于其致病性分析及分子檢測(cè)。以氣溶素基因aerA設(shè)計(jì)引物進(jìn)行的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增, 結(jié)果顯示可擴(kuò)增出階梯狀條帶, 加入SYBR Green I染色后呈現(xiàn)綠色的陽(yáng)性反應(yīng), 而對(duì)照組均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶且反應(yīng)體系呈現(xiàn)橙色, 表明LAMP檢測(cè)方法對(duì)于嗜水氣單胞菌檢測(cè)具有很好的特異性; 靈敏度檢測(cè)的最低檢測(cè)限為4.6×101CFU/mL; 10種經(jīng)人工感染的淡水養(yǎng)殖魚(yú)蝦組織勻漿增菌液, 提取DNA后進(jìn)行LAMP方法檢測(cè), 結(jié)果均可獲得陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果, 而對(duì)照未染菌組呈陰性, 表明該方法具有較好的應(yīng)用性, 可應(yīng)用于嗜水氣單胞菌引起的水生動(dòng)物疾病的檢測(cè)。

翹嘴鱖; 嗜水氣單胞菌;aerA基因; 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)是淡水兇猛肉食性魚(yú)類(lèi), 生長(zhǎng)速度快, 因其肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)含量高而深受歡迎, 目前鱖養(yǎng)殖已成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)一大特色, 但日益嚴(yán)重發(fā)生的鱖病害問(wèn)題, 已然成為制約其發(fā)展的不利因素之一。目前鱖發(fā)生的病害除傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)病導(dǎo)致鱖大批死亡外, 細(xì)菌引起的敗血癥病害也較為嚴(yán)重, 敗血癥暴發(fā)的高峰時(shí)期為每年季節(jié)交替時(shí)段, 該病會(huì)造成大批鱖發(fā)病死亡, 給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。

近年來(lái)江蘇揚(yáng)州地區(qū)多家養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的翹嘴鱖出現(xiàn)暴發(fā)性死亡, 病魚(yú)通常表現(xiàn)為鰓蓋出血, 鰓絲腐爛裂開(kāi), 部分病魚(yú)鰓部黏液較多、附有大量污泥, 鰓絲末端腐爛; 解剖之后發(fā)現(xiàn)肝臟出血, 有腹水;病魚(yú)肝臟、脾臟、腎臟腫大, 脾臟常呈紫黑色; 鰾壁充血, 膽囊腫大, 腸系膜、腹膜及腸壁充血, 腸內(nèi)沒(méi)有食物、有較多黏液, 有的腸腔內(nèi)積水或有氣體、腸管粗脹。經(jīng)調(diào)查及對(duì)病魚(yú)的檢驗(yàn)排除了病毒和寄生蟲(chóng)感染, 經(jīng)過(guò)對(duì)患病翹嘴鱖病原菌的分離、形態(tài)特征、理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列的同源性分析及致病性檢驗(yàn), 確定該病原為致病性嗜水氣單胞菌, 分離菌對(duì)翹嘴鱖的半致死濃度為1.6×106CFU/mL, 且攜帶aerA等14種毒力基因。實(shí)驗(yàn)以嗜水氣單胞菌的氣溶素基因aerA序列設(shè)計(jì)LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)引物, 建立針對(duì)嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)方法, 并分析了其特異性, 靈敏性和實(shí)際應(yīng)用性, 該實(shí)驗(yàn)為診斷由嗜水氣單胞菌引起的病害提供了快速的可行性的方法。

1 材料與方法

1.1 分離菌致病性檢測(cè)

將分離自患病翹嘴鱖的供試病原嗜水氣單胞菌菌株(G3)接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯, 28℃過(guò)夜培養(yǎng)后作為供試菌液, 菌液稀釋10倍濃度, 分別為2.8×108、2.8×107、2.8×106、2.8×105和2.8×104CFU/mL,經(jīng)肌肉注射的方法感染培養(yǎng)一周的健康的翹嘴鱖,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各10尾, 每尾接種0.1 mL; 對(duì)照組接種同劑量無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯; 于試驗(yàn)水族箱中隔離養(yǎng)殖,觀察記錄試驗(yàn)魚(yú)感染后每天的發(fā)病與死亡情況, 測(cè)定分離菌對(duì)翹嘴鱖的半致死濃度,LD50計(jì)算參考張慶萍等[3]方法進(jìn)行。

1.2 分離菌毒力基因檢測(cè)

細(xì)菌模板DNA的制備按煮沸法提取: 取1 mL菌液(供試菌株接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期)離心1min (12000 r/min), 棄上清, 將菌體懸浮于100 μL的滅菌蒸餾水中, 100℃煮沸10min,冰浴中冷卻后離心10min (12000 r/min), 取上清作為PCR模板。

根據(jù)已報(bào)道的嗜水氣單胞菌的毒力基因, 選擇氣溶素基因(aerA)等14種毒力基因, 引物由上海生物工程技術(shù)公司合成(表1), 用以檢測(cè)分離菌毒力基因的攜帶情況。PCR反應(yīng)體系: 2×EasyTaqPCR SuperMix (北京全式金生物技術(shù)有限公司) 12.5 μL,上下游引物各0.5 μL, 模版1 μL, 最后加ddH2O至25 μL。PCR程序如下: 94℃ 5min、94℃ 30s、50—60℃ 30s、72℃ 2min, 循環(huán)30次后72℃ 延伸7min。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析, 采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.3 嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)

供試菌株分離自發(fā)病翹嘴鱖的供試嗜水氣單胞菌G3, 對(duì)照副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)、非O1霍亂弧菌(non-O1Vibrio cholerae)、愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)均分離自發(fā)病水生動(dòng)物, 本實(shí)驗(yàn)室保存供用, 菌株編號(hào)及在GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表2。

LAMP引物設(shè)計(jì)與合成用引物設(shè)計(jì)軟件primer premier5.0和primer explorer V4, 以氣溶素基因(aerA)為靶基因(EU484343)設(shè)計(jì)嗜水氣單胞菌LAMP特異性引物(表3), 引物由上海生物工程技術(shù)公司。

LAMP擴(kuò)增條件的優(yōu)化及特異性檢測(cè)以一對(duì)外引物(Ah-aerA-F3與Ah-aerA-B3)和一對(duì)內(nèi)引物(Ah-aerA-FIP與Ah-aerA-BIP) 對(duì)模板進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增, 優(yōu)化嗜水單胞菌LAMP最佳反應(yīng)體系。以副溶血弧菌、鰻弧菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、非O1霍亂弧菌及愛(ài)德華氏菌為對(duì)照菌株, 檢驗(yàn)內(nèi)外引物L(fēng)AMP擴(kuò)增的特異性, 通過(guò)凝膠電泳觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將反應(yīng)產(chǎn)物加入1 μL SYBR Green I熒光染料后, 輕輕振蕩, 觀察混合液有無(wú)顏色變化。

表1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物引物Tab. 1 The PCR amplification primers

嗜水氣單胞菌LAMP擴(kuò)增的靈敏性檢測(cè)菌液稀釋法將菌液進(jìn)行10倍比梯度稀釋為: 4.6×1010、4.6×109、4.6×108、4.6×107、4.6×106、4.6×105、4.6×104、4.6×103、4.6×102、4.6×101和4.6×100CFU/mL。取1 mL菌液按上述煮沸法提取DNA作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的模板, 陰性對(duì)照為滅菌去離子水。按照所建立的LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏性檢測(cè)。

嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)的應(yīng)用取南美白對(duì)蝦、羅氏沼蝦、羅非魚(yú)、白鰱、鯽、草魚(yú)、鯉、泥鰍、黃顙魚(yú)、團(tuán)頭魴等10種淡水養(yǎng)殖魚(yú)蝦,進(jìn)行肌肉組織勻漿, 人工染菌后用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)4h,煮沸法提取DNA, 按優(yōu)化的LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及添加熒光染料SYBR GreenⅠ以檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 供試菌致病性及LD50

供試菌株(G3)肌肉注射感染健康翹嘴鱖, 感染數(shù)小時(shí)后翹嘴鱖表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍, 鰓部出血, 肝臟、脾臟腫大出血, 且出現(xiàn)體表出血及腹水等病變,然后陸續(xù)死亡, 死亡情況見(jiàn)表4; G3對(duì)翹嘴鱖的LD50為1.6×106CFU/mL; 對(duì)感染死亡的翹嘴鱖進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn), 分離檢驗(yàn)到其含有大量原感染菌, 表明該分離菌為引起翹嘴鱖大量死亡的病原菌。

2.2 嗜水氣單胞菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)PCR檢測(cè)該菌株可以擴(kuò)增出aerA(280 bp)等14個(gè)毒力基因。圖1為選擇的代表菌株G3菌株的14種毒力基因檢測(cè)結(jié)果。

表2 供試菌株來(lái)源Tab. 2 Origin of strains used in the study

表3 引物序列Tab. 3 Sequence of primers

表4 分離菌(G3)的致病性Tab. 4 Pathogenicity of isolates (G3)

2.3 嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)方法的建立

經(jīng)過(guò)優(yōu)化之后的 25 μL LAMP反應(yīng)體系包括dNTP 2.5 μL (10 mmol/L)、10×Thermopol buffer 2.5 μL、甜菜堿4 μL (5 mol/L)、Mg2+2 μL (25 mmol/L), 引物FIP、BIP各2 μL (10 μmol/L), F3、B3各0.5 μL (10 μmol/L)、Bst DNA酶1 μL (8000U)、DNA模板2 μL, ddH2O補(bǔ)足至25 μL; LAMP的反應(yīng)條件即在65℃條件下保持60min, 之后80℃終止反應(yīng)10min。

2.4 嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)的特異性擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用上述反應(yīng)程序, 以一對(duì)外引物(Ah-aerAF3與Ah-aerA-B3)和一對(duì)內(nèi)引物(Ah-aerA-FIP與AhaerA-BIP)分別對(duì)嗜水氣單胞菌和6株對(duì)照致病菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增, 結(jié)果顯示嗜水氣單胞菌可擴(kuò)增出階梯狀條帶且經(jīng)SYBR Green I染色后呈現(xiàn)綠色的陽(yáng)性反應(yīng), 而其他6株對(duì)照病原菌均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶且經(jīng)SYBR Green I染色后呈現(xiàn)橙色的陰性反應(yīng)(圖2、圖3), 該結(jié)果表明所建立的嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)方法特異性較強(qiáng)。

2.5 嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)的靈敏度

10倍系列稀釋嗜水氣單胞菌液提取DNA后, 按2.3建立的LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏性檢測(cè), 結(jié)果表明嗜水氣單胞菌菌體濃度自4.6×1010至4.6×101CFU/mL結(jié)果顯示可擴(kuò)增出階梯狀條帶(圖4), 加入SYBR Green I染色后呈現(xiàn)綠色的陽(yáng)性反應(yīng), 而對(duì)照組均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶且反應(yīng)體系呈現(xiàn)橙色(圖5)。本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP檢測(cè)嗜水氣單胞菌靈敏度為4.6×101CFU/mL。

圖1 嗜水氣單胞菌毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 The result of virulence genes of A. hydrophila by PCR amplification

圖2 嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)方法的特異性(電泳)Fig. 2 Specificity of LAMP for detection of A. hydrophila(electrophoresis)

圖3 嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)方法的特異性(SYBR Green I)Fig. 3 Specificity of LAMP for detection of A. hydrophila (SYBR Green I)

圖4 嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)方法的靈敏性(電泳)Fig. 4 Sensitivity of LAMP methods for detection of A.hydrophila (electrophoresis)

2.6 嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)應(yīng)用

人工染菌的10種水產(chǎn)品組織勻漿增菌液, 提取其DNA后進(jìn)行LAMP檢測(cè)。LAMP檢測(cè)電泳結(jié)果顯示人工染菌組均呈現(xiàn)階梯狀條帶, 結(jié)果為陽(yáng)性。對(duì)照組未染菌組均無(wú)電泳條帶(圖6), 加入SYBR GreenⅠ染色后，人工染菌組呈現(xiàn)綠色的陽(yáng)性反應(yīng),而對(duì)照組呈現(xiàn)橙色的陰性反應(yīng)(圖7)， 結(jié)果表明所建立的LAMP檢測(cè)方法準(zhǔn)確測(cè)出感染的嗜水氣單胞菌樣品。

圖5 嗜水氣單胞菌LAMP檢測(cè)方法的靈敏性(SYBR Green I)Fig. 5 Sensitivity of LAMP methods for detection of A.hydrophila (SYBR Green I)

圖6 嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)應(yīng)用(電泳)Fig. 6 Application of LAMP for detection of A. hydrophila(electrophoresis)

圖7 嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)應(yīng)用(SYBR Green I)Fig. 7 Application of LAMP for detection of A. hydrophila(SYBR Green I)

3 討論

嗜水氣單胞菌隸屬于弧菌科、氣單胞菌屬, 是水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的重要病原菌之一[13], 該菌近年來(lái)已發(fā)展成為能夠引起多種水生動(dòng)物感染的細(xì)菌性傳染病原, 可引起鰱、鳙、團(tuán)頭魴、鳊、鯪、鰻、銀鯽、異育銀鯽、草魚(yú)及鱖等多種淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)發(fā)生細(xì)菌性敗血癥[14], 該菌引起的疾病在我國(guó)養(yǎng)魚(yú)史上被記載為危害魚(yú)的年齡范圍最大(從夏花魚(yú)種至食用魚(yú))、危害魚(yú)的種類(lèi)最多、流行地區(qū)范圍最廣、造成的損失最大的一種魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性病害[15], 造成了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失; 同時(shí), 該菌為典型的人、畜、魚(yú)共患病原菌[16]。

自然界中嗜水氣單胞菌分布廣泛, 且對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物危害極大[17]。本文從病變的具有典型癥狀的鱖進(jìn)行病原菌的分離, 從瀕死的鱖的肝臟、腎臟組織中分離到大量?jī)?yōu)勢(shì)菌, 經(jīng)純化培養(yǎng), 證實(shí)為同一種菌。人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)的致病性, 本文對(duì)細(xì)菌的16S rRNA和gyrB基因序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析, 運(yùn)用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建, 結(jié)果顯示分離菌株與嗜水氣單胞菌具有很高的同源性, 經(jīng)形態(tài)特征、理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列的同源性分析及致病性檢驗(yàn), 均表明引起翹嘴鱖暴發(fā)性死亡的病原為嗜水氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌有非致病性菌株和致病性菌株之分, 其中后者又可分為強(qiáng)毒株和弱毒株, 而嗜水氣單胞菌的致病力大小與菌株所攜帶毒力基因有關(guān)[18]。嗜水氣單胞菌眾多的毒力基因是否在同一種毒力菌株中全部存在, 或者只有幾種存在并發(fā)生作用, 均需要進(jìn)一步研究明確。溶血素、細(xì)胞毒性腸毒素、氣溶素、細(xì)胞興奮性腸毒素和胞外蛋白酶等被認(rèn)為是嗜水氣單胞菌主要致病性毒力基因,這些毒素有較強(qiáng)的毒性, 是導(dǎo)致機(jī)體組織出現(xiàn)潰瘍、出血、壞死問(wèn)題發(fā)生的直接原因之一。朱大玲等[19]報(bào)道aer和ahp基因與嗜水氣單胞菌的毒力存在相關(guān)性, 攜帶aer和ahp基因的菌株可能是強(qiáng)毒株。本研究PCR檢測(cè)的毒力基因包括aer和ahp兩種毒力基因, 同時(shí)也檢測(cè)到lip、act、fla、alt、hly、gcaT、eprCAI、ast、lafA、acg、ela和ompAI等毒力基因, 表明分離株攜帶嗜水氣單胞菌的主要毒力基因。致病性試驗(yàn)中2.8×107CFU/mL濃度的分離株菌液腹腔感染鱖, 48h內(nèi)鱖全部死亡, 表明該分離株具有很強(qiáng)的致病性。通過(guò)毒力基因檢測(cè)和致病性試驗(yàn)表明溶血素、細(xì)胞性腸毒素、氣溶素、細(xì)胞興奮性腸毒素等毒力因子為嗜水氣單胞菌主要的毒力因子, 且攜帶這些毒力基因的菌株能夠引起疾病的暴發(fā)性流行。

本文以為嗜水氣單胞菌氣溶素基因aerA為靶基因設(shè)計(jì)了LAMP檢測(cè)的4對(duì)的特異性引物即2對(duì)內(nèi)引物與2對(duì)外引物來(lái)識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域,通過(guò)特異性、靈敏性及實(shí)際應(yīng)用情況, 建立了病原嗜水氣單胞菌的LAMP檢測(cè)方法。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳, 觀察到產(chǎn)生各種片斷長(zhǎng)度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增產(chǎn)物, 加入SYBR Green I染色后呈現(xiàn)綠色的陽(yáng)性反應(yīng), 而對(duì)照組均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶且反應(yīng)體系呈現(xiàn)橙色, 該方法可用于病原嗜水氣單胞菌的檢驗(yàn)。由于LAMP擴(kuò)增的陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)smear和一些低分子質(zhì)量的帶, 一旦產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增, 便不易鑒別, 因此檢測(cè)過(guò)程應(yīng)注意外源性DNA污染問(wèn)題,避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果, 關(guān)注反應(yīng)的特異性。在分子流行病研究中, LAMP技術(shù)相較于PCR法, 它不需要昂貴的PCR熱循環(huán)儀, 只需要普通的水浴鍋或者穩(wěn)定熱源設(shè)備即可, 該方法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短, 非常適用于水生動(dòng)物疫病即時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)病原體的要求。

[1]Pan H J, Wu S Q, Dong C F,et al. Identification of pathogenicAeromonas hydrophilaGYK1 strain, virulence and hemolysis [J].Journal of Shanghai Fisheries University,2004, 13(1): 23—29 [潘厚軍, 吳淑勤, 董傳甫, 等. 鱖致病性嗜水氣單胞菌GYK1株鑒定、毒力及溶血性. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 13(1): 23—29]

[2]Zhao H J, Zhang X, Lin C J,et al. Isolation and identification ofAeromonas hydrophilafrom mandarin fish [J].Chinese Journal of Animal Quarantine, 2012, 29(6):54—56 [肇慧君, 張雪, 林長(zhǎng)軍, 等. 鱖魚(yú)嗜水氣單胞菌的分離與鑒定. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2012, 29(6): 54—56]

[3]Zhang Q P, Huang X H, Xie H T. Calculation of LD_(50)and empirical estimation [J].Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2000, 5(2): 162—163[張慶萍,黃曉輝, 謝海棠. 計(jì)算LD_(50)的查表法和經(jīng)驗(yàn)估算法. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2000, 5(2): 162—163]

[4]Liang L G, Xie J. Identification, virulence factor test and drug sensitivity test ofAeromonas hydrophilaofHelicoverpa armigera[J].Chinese Journal of Ecology, 2013,32(12): 3236—3242 [梁利國(guó), 謝駿. 青魚(yú)病原嗜水氣單胞菌分離鑒定、毒力因子檢測(cè)及藥敏試驗(yàn). 生態(tài)學(xué)雜志, 2013, 32(12): 3236—3242]

[5]Fu G H, Xiao D, Hu K,et al. Multiplex PCR detection and ERIC-PCR molecular typing of virulence genes ofAeromonas hydrophilainCarassius auratus[J].Marine Fishery, 2014, 36(6): 549—556 [符貴紅, 肖丹, 胡鯤, 等.鯽源嗜水氣單胞菌毒力基因多重PCR檢測(cè)及ERICPCR分子分型. 海洋漁業(yè), 2014, 36(6): 549—556]

[6]Sen K, Rodgers M. Distribution of six virulence factors inAeromonasspecies isolated from US drinking water utilities: a PCR identification [J].Journal of Applied Microbiology, 2004, 97(5): 1077—1086

[7]Ren Y, Lu C P, Yao H C. Cloning, sequence analysis and detection of an extracellular temperature-labile protease encoding gene (eprJ) fromAeromonas hydrophila[J].Journal of Fishery Sciences of China, 2006, 13(6):924—928 [任燕, 陸承平, 姚火春. 嗜水氣單胞菌溫敏胞外蛋白酶基因eprJ的克隆與檢測(cè). 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2006,13(6): 924—928]

[8]Wong C Y, Heuzenroeder M W, Flower R L. Inactivation of two haemolytic toxin genes inAeromonas hydrophilaattenuates virulence in a suckling mouse model [J].Microbiology, 1998, 144(2): 291—298

[9]Merino S, Gavín R, Vilches S,et al. A colonization factor(production of lateral flagella) of mesophilicAeromonasspp. is inactive inAeromonas salmonicidastrains [J].Applied amp; Environmental Microbiology, 2003, 69(1):663—667

[10]Han H J, Taki T, Kondo H,et al. Pathogenic potential of a collagenase gene fromAeromonas veronii[J].Canadian Journal of Microbiology, 2007, 54(1): 1—10

[11]Nawaz M, Khan S A, Khan A A,et al. Detection and characterization of virulence genes and integrons inAeromonas veronii, isolated from catfish [J].Food Microbiology, 2010, 27(3): 327—331

[12]Wang H. Comparative study between biological characteristics of the different animal speciesAeromonas veronniand four virulence [D]. Thesis for Master of Science,Jilin Agricultural University, Jilin. 2014 [王惠.不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌的生物特性及四種毒力基因比較研究. 碩士學(xué)位論文, 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 吉林. 2014]

[13]Mou S X, Zhou X, Peng Y Z,et al. Effect of fibrous root ofCoptis chinensisfranch and berberine on the non-specific immunity and resistance againstAeromonas hydrophilainfection in grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(2): 267—274[牟紹霞, 周霞, 彭耀宗, 等. 黃連須和小檗堿對(duì)草魚(yú)非特異性免疫系統(tǒng)的影響及對(duì)嗜水氣單胞菌感染的抵抗作用. 水生生物學(xué)報(bào), 2015, 39(2): 267—274]

[14]Pang M D, Xie X, Dong Y H,et al. Identification of novel virulence-related genes inAeromonas hydrophilaby screening transposon mutants in a tetrahymena infection model [J].Veterinary Microbiology, 2017, 199: 36—46

[15]Rao J J, Li S S, Huang K H,et al. Establishment of multiple PCR detection method for pathogenicAeromonas hydrophila[J].Journal of Fishery Sciences of China,2007, 14(5): 749—755 [饒靜靜, 李壽崧, 黃克和, 等. 致病性嗜水氣單胞菌多重PCR檢測(cè)方法的建立. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14(5): 749—755]

[16]Fadl A A, Galindo C L, Sha J,et al. Global transcriptional responses of wild-typeAeromonas hydrophilaand its virulence-deficient mutant in a murine model of infection[J].Microbial Pathogenesis, 2007, 42(5—6): 193—203

[17]Li F J, Wang W Q, Zhu Z Q,et al. Distribution, virulence-associated genes and antimicrobial resistance ofAeromonasisolates from diarrheal patients and water,China [J].Journal of Infection, 2015, 70(6): 600—608

[18]Pridgeon J W, Klesius P H, Song L,et al. Identification,virulence, and mass spectrometry of toxic ECP fractions of West Alabama isolates ofAeromonas hydrophilaobtained from a 2010 disease outbreak [J].Veterinary Microbiology, 2013, 164(2-3): 336—343

[19]Zhu D L, Li A H, Qian D,et al. Advances in virulence genes ofAeromonas hydrophila[J].Journal of Hydrodynamics, 2004, 28(1): 80—84 [朱大玲, 李?lèi)?ài)華, 錢(qián)冬,等. 嗜水氣單胞菌毒力基因的研究進(jìn)展. 水生生物學(xué)報(bào),2004, 28(1): 80—84]

MOLECULAR CHARACTERIZATION AND ESTABLISHMENT OF LAMP DETECTION METHOD OF PATHOGENIC AEROMONAS HYDROPHILA ISOLATED FROM SINIPERCA CHUATSI

ZHANG Yue1, GAO Xiao-Jian1, YE Jin-Ming2, CHEN Nan1, DU Xue-Di1, ZHANG Xiao-Jun1and BING Xu-Wen3
(1. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Yangzhou Aquatic Product Technical Guidance Station, Yangzhou 225101, China; 3. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Utilization,Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China)

Aeromonas hydrophilaexists in the water body, which can cause many kinds of diseases and huge loss of aquaculture animals to the aquaculture production. The pathogenicity and virulence characteristics of the isolated strain which caused mass mortalities of reared Mandarin fish were studied. The rapid detection methods ofA. hydrophilawere established by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) usingaerAgene as molecular marker. The results showed that theLD50ofA. hydrophilawas 1.6×106CFU/mL, and 14 virulence genes were detected from the isolated strain, which can be biology markers in detecting of pathogenicA. hydrophila. The assay of LAMP for detectingA. hydrophilawas established usingaerAgene as molecular marker. Positive reactions were detected by the stair-step amplified bands, and the green amplified products were observed directly by naked-eye in the reaction tube by addition of SYBR Green I. No any amplified bands and orange color were detected in control group. The results showed that LAMP detection method ofA. hydrophilahad good specificity. The results of sensitivity of LAMP showed that the primers could detectA. hydrophilaat the level of 4.6×101CFU/mL. The artificially infected 10 species of freshwater fishes and shrimps revealed positive amplified results using LAMP detection method, and no-infected 10 samples revealed negative amplified results. The results showed that the LAMP detection method has preferable application, and could be used in rapid diagnose of aquatic animal diseases caused byA. hydrophila.

Siniperca chuatsi;Aeromonas hydrophila;aerAgene; Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

S941.42

A

1000-3207(2017)06-1225-07

2017-01-03;

2017-04-26

江蘇省水產(chǎn)三項(xiàng)工程項(xiàng)目(Y2016-33和D2015-15); 江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(14KJA240001); 江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(BE2017311)資助 [Supported by the Projects of Shui Chan San Xiang of Jiangsu Province (Y2016-33, D2015-15); the Major Natural Science Research Program of Jiangsu Higher Education Institutions (14KJA240001); the Key Research and Development Program of Jiangsu Province (BE2017311)]

張悅(1994—), 女, 江蘇南京人; 碩士研究生; 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害及病原微生物學(xué)研究。E-mail: 18861339319@163.com

張曉君, E-mail: zxj9307@163.com; 邴旭文, E-mail: bingxw@ffrc.cn