秦緒偉 （齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東濟(jì)南 250100）秦艷 （山東省日照市嵐山區(qū)虎山畜牧獸醫(yī)站）

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水貂李氏桿菌的分離鑒定與藥敏實(shí)驗(yàn)

秦緒偉 （齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東濟(jì)南 250100）秦艷 （山東省日照市嵐山區(qū)虎山畜牧獸醫(yī)站）

山東日照某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生神經(jīng)癥狀為主要特征的疾病，發(fā)病率較少，主要表現(xiàn)為食欲減退、癱瘓、有的轉(zhuǎn)圈，開(kāi)始未引起注意，慢慢開(kāi)始增多，按照維生素B1缺乏治療，未見(jiàn)效果，后來(lái)發(fā)展到神經(jīng)癥狀伴隨下痢、嘔吐、腹瀉，最后死亡。畜主帶病死水貂來(lái)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，經(jīng)細(xì)菌分離檢測(cè)、生化試驗(yàn)、PCR基因擴(kuò)增確診為李氏桿菌，通過(guò)藥敏試驗(yàn)選擇敏感性高的藥物治療，最終控制了病情。李氏桿菌在水貂上發(fā)病較少，都是散發(fā)，一般不被重視，有的僅僅作為神經(jīng)性腦炎治療，現(xiàn)就這次李氏桿菌的分離鑒定介紹如下。

李氏桿菌可以感染多種畜、禽、野生動(dòng)物和人，是一種嚴(yán)重的人畜共患傳染病，引起多種動(dòng)物的流產(chǎn)、敗血癥、腦膜腦炎等臨床特征，在食品安全上有重要性，李氏桿菌屬的代表是單核細(xì)胞增多性李氏桿菌，該菌是人和動(dòng)物李氏桿菌病的病原體，是致死性食源性條件致病菌[1]。李氏桿菌寄生在多種冷血?jiǎng)游矧?、蠅、昆蟲(chóng)、魚(yú)蝦和甲殼動(dòng)物體內(nèi)，環(huán)境中廣泛存在于江河湖、沼澤污泥、屠宰廢棄物、飼草、墊料、肉奶蛋以及水產(chǎn)品中[2]。土壤污染和攝入被污染的飼料是李氏桿菌的主要傳播媒介，青貯飼料pH值高于5.5加快李氏桿菌的繁殖，是該病傳播的主要方式，被稱(chēng)為“青貯病”[3]。李氏桿菌病在不同動(dòng)物上癥狀不同，在禽類(lèi)和嚙齒類(lèi)發(fā)病主要癥狀是壞死性肝炎和心肌炎，單蹄獸上發(fā)病主要是呈現(xiàn)敗血癥，反芻獸和人類(lèi)發(fā)病主要是腦炎型和流產(chǎn)，水貂、狐貍貉子多種毛皮動(dòng)物容易患該病，主要是神經(jīng)癥狀[4]。李氏桿菌是革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢小桿菌，大小0.4~0.5μm×1~2μm，常呈現(xiàn)V形排列，血瓊脂平板培養(yǎng)呈現(xiàn)明顯的溶血環(huán)菌落[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 養(yǎng)殖場(chǎng)水貂發(fā)生疾病，主要是神經(jīng)癥狀，解剖從病死貂腦內(nèi)分離到一株細(xì)菌，進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 18~22g小白鼠，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；1.5~2kg家兔，購(gòu)自濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心；1~2月齡水貂，購(gòu)自濟(jì)南章丘航科特種毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.3 試驗(yàn)材料 藥敏片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；微量生化反應(yīng)小管，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；牛血清，購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；犬瘟熱病毒抗原快速檢測(cè)試紙，購(gòu)自韓國(guó)百易奧生物公司；解剖臺(tái)、剪刀、手術(shù)刀、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、試管，實(shí)驗(yàn)室常備物品。

1.1.4 試驗(yàn)器具 生物安全柜，蘇凈安泰BSC-1600IIA2；顯微鏡，奧林巴斯CX-31；全自動(dòng)樣品快速研磨儀，上海凈信科技Tiss-24；基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司TC-96/G/H(b)c；恒溫培養(yǎng)箱，三洋MCO-15AC。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢 將發(fā)病死亡水貂外表消毒，放解剖臺(tái)解剖，無(wú)菌取心血、肝臟、肺臟、腦組織進(jìn)行載玻片涂片、染色、鏡檢，細(xì)菌分離時(shí)接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、SS瓊脂平板、10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、10%兔鮮血瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.2 細(xì)菌的生化試驗(yàn) 無(wú)菌取10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落，接種10%血清馬丁肉湯培養(yǎng)基，接種后37℃溫箱培養(yǎng)24h，取樣接種各種生化反應(yīng)小管，觀察是否發(fā)酵發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、鼠李糖、海藻糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、棉實(shí)糖、糊精、水楊苷、衛(wèi)矛醇，進(jìn)行甲基紅MR和VP試驗(yàn)，觀察是否反應(yīng)，接種后第三天觀察反應(yīng)結(jié)果，有的菌緩慢發(fā)酵糖類(lèi)，留樣繼續(xù)觀察至第7天，記錄結(jié)果。

1.2.3 細(xì)菌的16S rRNA分子生物學(xué)鑒定 病死水貂腦組織細(xì)菌分離，接種10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，取菌落接種馬丁肉湯37℃溫箱培養(yǎng)18h，取1ml放入1.5ml無(wú)菌的離心管中，12000r/min離心1min，棄掉上清，加入無(wú)菌水中將菌體重懸，使用振蕩器震蕩搖勻，沸水浴7min，再冰浴5min，12000r/min離心1min，上清液作為基因擴(kuò)增的模板。設(shè)計(jì)寡核苷酸引物來(lái)擴(kuò)增16S rRNA，使用引物如下：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’, R1-5’ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’。PCR反應(yīng)體系50μl：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500mmol/L)5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，引物(20umol/L)各1μl，模板2μl，ddH2O36.8μl，Taq酶(5U/ul) 0.25μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。取PCR產(chǎn)物5μl用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送交上海基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。提交Genbank進(jìn)行對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，判定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，16S rRNA以相似性97%為界限，以高于97%判定為該菌。

1.2.4 病料PCR檢測(cè) 由于水貂發(fā)病主要是神經(jīng)癥狀，懷疑腺病毒、狂犬病毒、偽狂犬病毒一些病毒引起的疾病。無(wú)菌取肝、脾臟、腦組織研磨，進(jìn)行基因擴(kuò)增，檢測(cè)是否存在腺病毒、狂犬病毒、偽狂犬病毒。

1.2.5 犬瘟熱試紙檢測(cè) 使用犬瘟熱抗原快速檢測(cè)試紙商品試紙盒內(nèi)的棉簽，取鼻液、氣管液、肺部血液在稀釋液中稀釋?zhuān)斡跈z測(cè)孔內(nèi)，待稀釋液流到檢測(cè)區(qū)1min后，觀察結(jié)果，C為對(duì)照，T為檢測(cè)，C出現(xiàn)紅色線為試紙合格，可進(jìn)一步判定，T線出現(xiàn)紅色為犬瘟熱陽(yáng)性，T線無(wú)色為犬瘟熱陰性。

1.2.6 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn) 按照藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將分離菌均勻涂抹在10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，把相應(yīng)的頭孢喹肟、頭孢噻呋、頭孢曲松、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、丁胺卡那霉素、壯觀霉素、強(qiáng)力霉素、多黏菌素、林可霉素藥敏片貼在平板上，37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察記錄抑菌圈的大小。

1.2.7 細(xì)菌的毒力試驗(yàn) 病死水貂腦組織細(xì)菌分離，接種10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，取菌落接種馬丁肉湯37℃溫箱培養(yǎng)18h，培養(yǎng)液腹腔注射18~22g小白鼠，0.5ml/只；將菌液接種1.5~2kg家兔眼睛結(jié)膜內(nèi)，1ml/只；將菌液肌肉注射1~2月齡水貂，1ml/只，接種注射后連同對(duì)照組觀察7d。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌鏡檢與培養(yǎng)結(jié)果

病死水貂解剖，可見(jiàn)肺臟肉變、脾臟腫大、肝臟土黃色、腦水腫，心血、肝臟、肺臟、腦組織觸片，火焰固定，革蘭氏染色呈現(xiàn)陽(yáng)性桿菌，肺臟未發(fā)現(xiàn)，心血、肝視野中少量幾個(gè)菌，腦組織視野中多處可見(jiàn)，菌體呈現(xiàn)規(guī)則短桿狀，多數(shù)散在，個(gè)別呈現(xiàn)V形。接種平板37℃溫箱培養(yǎng)24h可見(jiàn)，麥康凱瓊脂平板、SS瓊脂平板不生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板生長(zhǎng)少量，10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、10%兔鮮血瓊脂平板生長(zhǎng)良好，多量較小、圓形、光滑的菌落，鮮血瓊脂可見(jiàn)明顯的溶血環(huán)。

2.2 細(xì)菌的生化結(jié)果

分離細(xì)菌接種生化反應(yīng)管第3天觀察記錄結(jié)果，留樣繼續(xù)觀察至第7天，可見(jiàn)發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、果糖、鼠李糖、海藻糖、糊精、水楊苷、蔗糖、乳糖，結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性，不發(fā)酵阿拉伯糖、棉實(shí)糖、衛(wèi)矛醇、木糖，呈現(xiàn)陰性。甲基紅MR和VP試驗(yàn)均為陽(yáng)性，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

注：“—”表示陰性，“+”表示陽(yáng)性

2.3 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序公司返回的測(cè)序結(jié)果，采用Bioedit軟件進(jìn)行人工校對(duì)，然后輸入基因庫(kù)用Blastn軟件進(jìn)行相似性比較，比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，與產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌相似性為99%，確定為李氏桿菌。

2.4 病料PCR檢測(cè)結(jié)果

無(wú)菌取肝、脾臟、腦組織研磨，進(jìn)行基因擴(kuò)增，檢測(cè)腺病毒、狂犬病毒、偽狂犬病毒基因全部為陰性，排除腺病毒、狂犬病毒，偽狂犬病引起的神經(jīng)癥狀。

2.5 犬瘟熱試紙檢測(cè)結(jié)果

病料滴于檢測(cè)孔，觀察試紙結(jié)果，C為對(duì)照紅色成立，T線無(wú)色，犬瘟熱抗原陰性。

2.6 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

使用藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，37℃溫箱培養(yǎng)24h后觀察可見(jiàn)壯觀霉素、阿奇霉素、丁胺卡那霉素高敏，頭孢喹肟、頭孢噻呋、頭孢曲松、左氧氟沙星、多黏菌素中敏，環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、林可霉素低敏。使具體藥敏結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 分離菌的藥敏結(jié)果 (mm)

2.7 毒力試驗(yàn)結(jié)果

小白鼠腹腔注射菌液后2~3d死亡，呈現(xiàn)敗血癥，對(duì)照組觀察7d，健活；家兔眼結(jié)膜接種后，第2天開(kāi)始發(fā)生化膿性的結(jié)膜炎，對(duì)照組觀察7d正常；水貂肌肉注射后第2~3天死亡，死亡前神經(jīng)癥狀，對(duì)照組觀察7d，健活。所有發(fā)病死亡小白鼠、家兔、水貂進(jìn)行解剖，細(xì)菌分離，可以分離到攻毒相同的李氏桿菌，鏡檢革蘭氏染色陽(yáng)性小桿菌，有的呈現(xiàn)V形，在血清平板37℃溫箱培養(yǎng)24h后觀察可見(jiàn)透明露珠樣的菌落，鮮血平板可見(jiàn)明顯的溶血環(huán)。

3 討論

3.1 李氏桿菌的癥狀

李氏桿菌是人和多種禽、畜、野生動(dòng)物共患的人獸共患病，在動(dòng)物防疫和人的食品安全上都有重要的意義，不同動(dòng)物有不同的臨床表現(xiàn)形式，需要區(qū)別診斷，主要的臨床特征是流產(chǎn)、神經(jīng)癥狀、敗血癥，單胃和新生動(dòng)家畜是敗血癥，反芻獸草食動(dòng)物是腦炎、流產(chǎn)、結(jié)膜炎，嚙齒類(lèi)動(dòng)物主要是敗血癥，豬表現(xiàn)敗血癥、流產(chǎn)、神經(jīng)癥狀等多種癥狀，毛皮動(dòng)物發(fā)病主要是神經(jīng)癥狀，水貂發(fā)生李氏桿菌病，主要是神經(jīng)癥狀。

3.3 水貂李氏桿菌病的鑒別診斷

臨床上水貂發(fā)生神經(jīng)癥狀的疾病比較多，需要鑒別診斷，特別是發(fā)生在斷奶后仔貂，其中維生素A缺乏、維生素B1缺乏、缺鈣、神經(jīng)性犬瘟熱、偽狂犬病、狂犬病、腺病毒感染、鏈球菌病等都有不同程度的神經(jīng)癥狀。維生素A缺乏、維生素B1缺乏屬于維生素缺乏，主要表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，一般不死亡，或者發(fā)病很長(zhǎng)時(shí)間才死亡；缺鈣的主要癥狀是癱瘓，生長(zhǎng)較快的水貂表現(xiàn)明顯，其他食欲、精神不受影響，不會(huì)引起死亡；神經(jīng)性犬瘟熱發(fā)病主要是發(fā)病后期的犬瘟熱，開(kāi)始會(huì)有發(fā)熱、結(jié)膜炎等癥狀；偽狂犬病、狂犬病、腺病毒感染都是病毒性疾病，診斷需要病毒檢測(cè)，一般這幾種病毒病，發(fā)病都較少，但是需要從流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)合才能區(qū)別診斷；鏈球菌會(huì)引起的神經(jīng)癥狀，也會(huì)引起敗血癥死亡，需要實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌分離鑒別診斷。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行李氏桿菌診斷，鏡檢明顯的是革蘭氏陽(yáng)性小桿菌，常見(jiàn)的致病性革蘭氏陽(yáng)性小桿菌還有丹毒桿菌，需要區(qū)別診斷，不能僅僅通過(guò)鏡檢革蘭氏陽(yáng)性確診。

3.3 李氏桿菌的防治

李氏桿菌病可以發(fā)生在多種動(dòng)物上，各種環(huán)境都是李氏桿菌生長(zhǎng)繁殖的場(chǎng)所，水貂飼料主要是各種肉食，有的養(yǎng)殖場(chǎng)飼喂病死動(dòng)物、有的飼料品質(zhì)不良或者被污染都會(huì)引發(fā)該病的發(fā)生。李氏桿菌的生長(zhǎng)條件比較特殊，在1~45℃都可以生長(zhǎng)，就是說(shuō)放在冷藏的肉食若有李氏桿菌感染，細(xì)菌是一直生長(zhǎng)的，這也是造成冷藏條件下引起食物中毒一個(gè)原因。李氏桿菌發(fā)病一般都是散發(fā)，平時(shí)注意的比較少，隨著養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病的增多，需要特別的注意預(yù)防。減少水貂養(yǎng)殖場(chǎng)李氏桿菌病的發(fā)生，禁止飼喂來(lái)源不明的病死動(dòng)物，植物性飼料保存得當(dāng)，特別注意滅鼠，老鼠會(huì)傳播李氏桿菌。發(fā)生疾病需要及時(shí)鑒別診斷，確診后及時(shí)使用抗生素預(yù)防治療，發(fā)生疾病的一般治療效果較差，關(guān)鍵是大群的預(yù)防。

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（2017–05–09）

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1007-1733(2017)11-0033-03