羅銳 張睿智 龔正林 張萍

c-fos調(diào)控p16/CyclinD1信號(hào)途徑并促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖和遷移

羅銳 張睿智 龔正林 張萍

目的探討c-fos對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖和遷移的影響及作用機(jī)制。方法免疫組化法分別檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本和正?？谇火つそM織標(biāo)本(n=60)中的CyclinD1、p16和c-fos。根據(jù)不同處理將HN6和SCC9細(xì)胞分為空白對(duì)照組、siRNA-scramble組、siRNA-c-fos組。檢測(cè)各組細(xì)胞中CyclinD1和p16 mRNA和蛋白表達(dá)量的變化，以及細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。結(jié)果與正常組比較，病例組中c-fos和CyclinD1表達(dá)增加，p16表達(dá)降低;與空白對(duì)照組相比，siRNA-c-fos組HN6和SCC9細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)顯著降低，p16表達(dá)明顯上升，細(xì)胞的增殖能力和遷移能力都顯著下降。結(jié)論c-fos可以通過p16/CyclinD1信號(hào)途徑增強(qiáng)口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖和遷移。

c-fos； 細(xì)胞周期蛋白D1； 口腔鱗狀細(xì)胞癌； 增殖； 遷移

口腔鱗狀細(xì)胞癌是一種具有較高入侵潛力和極易向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤[1]。細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)是細(xì)胞周期G1期細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白[2]。在正常細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)呈低水平，CyclinD1蛋白的過表達(dá)被認(rèn)為是細(xì)胞惡變過程中的早期標(biāo)志。在細(xì)胞周期G1-S期間，CyclinD1、p16、pRB是重要的調(diào)控因子，其含量表達(dá)變化會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。研究表明，轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1在細(xì)胞的增殖和遷移中至關(guān)重要[3]，AP-1家族蛋白主要包含c-fos、fosB。但c-fos對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞腫瘤細(xì)胞p16/CyclinD1信號(hào)以及對(duì)增殖和遷移影響目前尚不清楚[4]。本文探討c-fos對(duì)p16/CyclinD1信號(hào)途徑以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移的影響，從而為腫瘤的治療和預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

60 例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本(病例組)和60例正常口腔黏膜組織標(biāo)本(正常組)來自2012～2013 年陜西安康中心醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)患者，其中男性62 例，女性58 例；年齡20～89 歲，平均年齡為49 歲。經(jīng)過本院倫理委員會(huì)審查同意并且所有患者均簽訂知情同意書。

1.2 細(xì)胞株和主要試劑

人口腔鱗狀細(xì)胞癌系HN6和SCC9由西安交通大學(xué)第一附屬院中心試驗(yàn)室提供。胎牛血清、DMEM液體培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、山羊抗兔IgG-HRP、Western免疫印跡的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒以及抗體CyclinD1、抗體c-fos和抗體p16(美國(guó)Sigma公司)。Transwell試劑盒(美國(guó)Corning公司)。引物合成由上海英俊公司完成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 將石蠟包埋的60 例病例組切片和60 例正常組切片經(jīng)過脫蠟、脫二甲苯、脫水處理，3%甲醇雙氧水中封閉10 min；清水沖洗3 遍后加入枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)，95 ℃抗原修復(fù)20 min，PBS洗后滴加一抗，分別加入CyclinD1、p16和c-fos抗體(1∶200稀釋)。4 ℃過夜。PBS 洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)，37°C孵育30 min；再次振洗后滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶孵育 30 min，DAB 顯色、蘇木精復(fù)染。

染色背景清晰，檢測(cè)蛋白定位于細(xì)胞的胞質(zhì)或(和)胞核中。本研究以鏡下組織胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)棕色或者棕黃色染色為陽(yáng)性(+)標(biāo)準(zhǔn)。著色強(qiáng)度分為 4 個(gè)等級(jí)：無著色計(jì)0 分、淺棕黃色計(jì)1 分、棕黃色計(jì)2 分、棕褐色計(jì)3 分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分為4 個(gè)等級(jí)：百分比lt;10%計(jì)0 分、10%～30%計(jì)1 分、31%～60%計(jì)2 分、gt;60%計(jì) 3分。本研究結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比及著色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)相加后分級(jí)，所得分?jǐn)?shù)為 0～1 分時(shí)，分級(jí)為(-)；2～3 分為(+)；4～5分為(++)；6 分為(+++)，其中-為陰性組、+～+++為陽(yáng)性組，結(jié)果由病理專家根據(jù)相應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)賦值[5]。

1.3.2 HN6和SCC9細(xì)胞分組 分別將HN6和SCC9常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。分別分組如下：①空白對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)，不加處理；②siRNA-scramble組：按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000試劑盒說明將pLK0.1-Scramble通過脂質(zhì)體TM2000分別轉(zhuǎn)染HN6和SCC9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，用含有2 μg/ml嘌呤毒素的DMEM培養(yǎng)基篩選[6]；③siRNA-c-fos組：分別轉(zhuǎn)染pLK0.1-siRNA-c-fos載體。

1.3.3 熒光定量PCR 用RNA抽提試劑盒提取各組細(xì)胞中總RNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)p16和CyclinD1轉(zhuǎn)錄的mRNA水平，所用引物如下：CyclinD1-F 5'-GAACAAACAGATCATCCGCAAAC-3'和CyclinD1-R 5'-GCGGTAGTAGGAAGGAAGTTG-3'；p16-F 5'ACCCCCTCCATCTGTGC-3'和p16-R 5'-TTCTGGACACGGGTG-3'。采用β-actin作為內(nèi)參基因來作為對(duì)照，每個(gè)樣品平行試驗(yàn)2 次。

1.3.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞加入裂解液提取蛋白，BCA法總蛋白定量。調(diào)整上樣量為25 μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過夜。分別加入一抗(CyclinD1和p16)(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入II抗即辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)室溫中反應(yīng)1 h。洗膜，采用Image J軟件測(cè)定各條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)的β-actin灰度值的比值作為CyclinD1和p16蛋白的表達(dá)水平。

1.3.5 各組細(xì)胞增殖能力分析 分別各組細(xì)胞按照密度為2.5×103個(gè)/ml孔接種于96 孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育待細(xì)胞貼壁后，每孔加入10 μl CCK-8后分別置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 和96 h，酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm處的吸光度A值，每個(gè)樣品平行試驗(yàn)3 次。

1.3.6 各組細(xì)胞遷移能力分析 調(diào)整各組細(xì)胞使其密度為4×104個(gè)/ml。在Transwell下室加入1 ml含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，上室加入0.5 ml濃度為4×104個(gè)/ml的待測(cè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，去除上室的細(xì)胞，用4%多聚甲醛溶液固定黏附在Transwell小室膜下表面細(xì)胞15 min，再用0.05%結(jié)晶紫染色40 min，然后使用Leica DC 300F正置顯微鏡隨機(jī)選取10 個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，求其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化分析

與正常組相比，60 例病例組中CyclinD1表達(dá)明顯升高，p16表達(dá)降低(Plt;0.05)。c-fos在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均出現(xiàn)陽(yáng)性染色，在病例組和正常組之間差異也存在顯著性(Plt;0.05)(表 1)。

2.2 各組細(xì)胞中CyclinD1和p16的mRNA相對(duì)表達(dá)量

與空白對(duì)照組相比，siRNA-c-fos組中CyclinD1的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，p16的mRNA相對(duì)表達(dá)量上升(Plt;0.05)(圖 1)。

2.3 各組細(xì)胞中CyclinD1和p16蛋白表達(dá)量變化

與空白對(duì)照組相比，siRNA-c-fos組中CyclinD1的表達(dá)量明顯降低，p16的表達(dá)量明顯上升(Plt;0.05)(表 2，圖 2)。

表 1 CyclinD1、p16和c-fos蛋白在病例組和對(duì)照組中的表達(dá) (n=60)

Tab 1 CyclinD1, p16 and c-fos expression in the case and control groups (n=60)

圖 1 3 組HN6和SCC9細(xì)胞中CyclinD1和p16的mRNA的表達(dá)

空白對(duì)照組siRNA?scramble組siRNA?c?fos組SCC9HN6SCC9HN6SCC9HN6CyclinD10．916±0．0380．900±0．0470．822±0．0190．839±0．0150．165±0．020①0．170±0．018①p160．398±0．0250．409±0．0690．425±0．0470．412±0．0751．129±0．310①1．120±0．029①

注： ①與空白對(duì)照組相比,Plt;0.05

圖 2 3 組HN6和SCC9細(xì)胞中CyclinD1和p16蛋白表達(dá)

Fig 2 CyclinD1 and p16 protien expression in SCC9 and HN6 cells of the 3 groups

2.4 各組細(xì)胞增殖能力分析

與空白對(duì)照組相比，siRNA-c-fos組細(xì)胞中A值顯著下降，細(xì)胞增殖受到明顯抑制(圖 3)。

2.5 各組細(xì)胞遷移能力比較

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)siRNA-c-fos組HN6和SCC9中Transwell小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(55±6)、(58±3) 個(gè)，與siRNA-scrmble組數(shù)據(jù)[(150±9)、(148±8) 個(gè)]和空白對(duì)照組數(shù)據(jù)[(153±5)、(146±3) 個(gè)]相比明顯減少(Plt;0.05)(圖 4)。

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔面部常見的惡性腫瘤，其癌細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移機(jī)制比較復(fù)雜，并且尚未被明確報(bào)道[7]。侵襲和轉(zhuǎn)移過程在口腔鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移發(fā)展過程中有著至關(guān)重要的作用[8]。這些過程伴隨著分子特征的變化有助于深入了解口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制，同時(shí)為這類癌癥的診斷、治療和預(yù)防提供新的有效手段。

圖 3 3 組HN6和SCC9細(xì)胞增殖能力比較

圖 4 各組細(xì)胞遷移狀態(tài)

研究表明，惡性腫瘤與細(xì)胞周期調(diào)控失常有密切聯(lián)系。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期到分裂期的調(diào)節(jié)蛋白[9]，與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK) 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合[10]，控制CDK對(duì)蛋白磷酸化作用的強(qiáng)度[11]，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在正常細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)是低水平的。但在癌癥發(fā)生時(shí)，CyclinD1蛋白的表達(dá)會(huì)隨著病程惡化而急劇增加[12]。p16作為CDK4,6特異的抑制劑[13]，可以抑制其活性，使細(xì)胞停滯在G1期[14]。因此，p16/CyclinD1信號(hào)途徑的異常變化與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有密切關(guān)系。本研究顯示，CyclinD1在口腔癌患者組織中的表達(dá)明顯高于正?？谇火つそM織中的表達(dá)量，而p16蛋白表達(dá)降低。CyclinD1與口腔癌患者組織間這種正相關(guān)表達(dá)的關(guān)系，有助于從下調(diào)CyclinD1的表達(dá)或改變p16/CyclinD1信號(hào)途徑等方面探索診斷和治療口腔癌新手段。

細(xì)胞增殖周期中許多原癌基因的激活或者抑癌基因的失活是惡性腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制[15]。原癌基因c-fos屬于即時(shí)早期(immediate early gene)家族的成員，編碼的核蛋白Fos具有結(jié)核特異DNA序列和激活基因轉(zhuǎn)錄的功能。在本研究中，c-fos在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)量明顯增加，而在正常黏膜組織中表達(dá)較少。因此，原癌基因c-fos可能和口腔癌的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。然而通過沉默c-fos基因，發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC9和HN6中CyclinD1表達(dá)量明顯降低，p16蛋白表達(dá)增加，降低細(xì)胞的增殖和遷移能力。因此，我們推斷沉默c-fos可以影響p16/CyclinD1信號(hào)途徑，并且抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌組織細(xì)胞的增殖能力和遷移能力。這有助于進(jìn)一步的研究和探索c-fos的作用機(jī)制，以便于為口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新的有效方案。

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(收稿： 2016-10-22 修回： 2016-12-14)

c-fosmodulatesp16/CyclinD1signalingpathwaysandpromotestheproliferationandmigrationoforalsquamouscellcarcinoma

LUORui,ZHANGRuizhi,GONGZhenglin,ZHANGPing.

725000,DepartmentofStomatology,AnkangCityCenterHospitalofShaanxi,China

Objective: To investigate the effect of c-fos on the proliferation and migration of oral squamous cell carcinoma and potential mechansism.MethodsThe expression of c-fos, CyclinD1 and p16 in 60 oral squamous cell carcinoma samples and 60 oral mucosa tissue samples was examined by immunohistochemistry. HN6 and SCC9 cells were respectively transfected with siRNA-c-fos and siRNA-scramble, then were respectively divided into control group, siRNA-scramble group and siRNA-c-fos group. The mRNA and protein expressions of CyclinD1 and p16 were decteted, meanwhile cell proliferation and migration were tested.ResultsCompared with the oral mucosa tissue samples，the expressions of CyclinD1 and c-fos were increased in the carcinoma samples, while the expression of p16 was reduced. Compared with control group, the expressions of CyclinD1 in siRNA-c-fos group were significantly reduced, while p16 enpression was increased, with the inhibition of cell proliferation and migration.Conclusionc-fos may regulate p16/CyclinD1 signaling pathways and promote the proliferation and migration of oral squamous cell carcinoma.

c-fos;CyclinD1;Oralsquamouscellcarcinoma;Proliferation;Migration

725000，安康市中心醫(yī)院口腔科

羅銳 E-mail: huanghai598@163.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.022