孫曉強(qiáng) 王淑靜 羅春雄 侯本祥

營(yíng)養(yǎng)缺乏和堿性環(huán)境對(duì)糞腸球菌侵入人工微管系統(tǒng)的影響

孫曉強(qiáng) 王淑靜 羅春雄 侯本祥

目的研究不同環(huán)境因素對(duì)糞腸球菌侵入人工微管系統(tǒng)能力的影響和微流芯片的適用性。方法采用軟光刻技術(shù)制作微流芯片，觀察細(xì)菌在牛腦心浸出液(BHI)、PBS和pH 10的情況下在微流芯片中的生長(zhǎng)情況，測(cè)定和比較細(xì)菌在相應(yīng)微管內(nèi)的最大侵入深度。結(jié)果糞腸球菌在營(yíng)養(yǎng)缺乏和堿性環(huán)境下生長(zhǎng)速度明顯下降，侵入小管徑微管的深度顯著下降(Plt;0.01)。結(jié)論營(yíng)養(yǎng)缺乏和堿性環(huán)境可顯著降低糞腸球菌侵入微管系統(tǒng)的能力。微流芯片具有高通量、平行對(duì)比和可觀察性好等特點(diǎn)，有望為今后相關(guān)研究提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

牙本質(zhì)小管； 糞腸球菌； 微流芯片； 持續(xù)性根尖周炎

糞腸球菌與根管治療失敗和持續(xù)性根尖周炎關(guān)系密切，在持續(xù)性根尖周炎患牙根管內(nèi)糞腸球菌的檢出率高達(dá)24%～77%[1-2]，被認(rèn)為是導(dǎo)致根管治療失敗和持續(xù)性根尖周炎的主要致病菌。研究顯示糞腸球菌可侵入側(cè)、副根管、根管峽部以及根管側(cè)壁的牙本質(zhì)小管內(nèi)[3]，很難通過目前的器械預(yù)備和化學(xué)預(yù)備方法完全清除。同時(shí)，糞腸球菌還具有對(duì)惡劣生存環(huán)境極強(qiáng)的適應(yīng)性，可耐受營(yíng)養(yǎng)缺乏[4]和堿性環(huán)境[5]而在根管中長(zhǎng)期生存。目前對(duì)糞腸球菌在壓力環(huán)境下對(duì)牙本質(zhì)小管等根管微結(jié)構(gòu)的侵入情況研究較少[6]。

本實(shí)驗(yàn)利用基于牙本質(zhì)小管大小與結(jié)構(gòu)制作的微流芯片[7]，觀察糞腸球菌在這2 種壓力環(huán)境下對(duì)微管系統(tǒng)的侵入情況，探討不同壓力環(huán)境對(duì)糞腸球菌侵入微管能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

E.faecalis標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212；聚二甲基硅氧烷 (polydimethylsiloxane、PDMS)前聚體(GE Toshiba日本)；SU-8系列光膠及顯影液(MicroChem，美國(guó))；牛腦心浸出液(BHI)(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；1×PBS 、10×PBS(上海百賽生物技術(shù)有限公司)；0.2 mol/L NaHCO3緩沖液、0.2 mol/L K2CO3緩沖液(分析純，北京化學(xué)制劑廠)； NIS軟件(Nikon，版本3.10)；尼康Ti-E全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)(尼康，日本)。

1.2 方法

1.2.1 不同環(huán)境培養(yǎng)基的配置 BHI培養(yǎng)基和1×PBS分別模擬營(yíng)養(yǎng)豐富和營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)[8]；堿性環(huán)境由0.2 mol/L NaHCO3緩沖液和0.2 mol/L K2CO3緩沖液將BHI培養(yǎng)基調(diào)整為pH=10[9]，消毒后4 ℃冰箱保存，3 d內(nèi)使用。

1.2.2 細(xì)菌準(zhǔn)備 將細(xì)菌置于37 ℃恒溫箱中活化2 h，將細(xì)菌懸液加入不同條件培養(yǎng)基中，菌密度調(diào)整為OD600=0.1。

1.2.3 微流芯片的制作與準(zhǔn)備 根據(jù)牙本質(zhì)小管的特點(diǎn)和Sigusch等[10]的研究，采用標(biāo)準(zhǔn)的軟光刻技術(shù)設(shè)計(jì)和制作微流芯片。主要結(jié)構(gòu)包括中央孔(紫色)、緩沖區(qū)(桔紅色)和不同管徑和長(zhǎng)度的微管系統(tǒng)(紅色)，1 塊微流芯片由4 個(gè)相同的單位構(gòu)成(圖 1)[7]，芯片預(yù)處理完成后，隨機(jī)將其中4 個(gè)相同單位分為空白對(duì)照組、BHI組、營(yíng)養(yǎng)缺乏組(PBS)和堿性環(huán)境組(pH=10)。

圖 1 本實(shí)驗(yàn)中使用的微流芯片示意圖

1.2.4 時(shí)序照片觀察點(diǎn)和時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定 將芯片置于時(shí)序顯微鏡下，BHI組、營(yíng)養(yǎng)缺乏組(PBS)和堿性環(huán)境組(pH=10)分別隨機(jī)選取每個(gè)直徑單元各10 個(gè)作為觀察單元。觀察點(diǎn)設(shè)定完畢后自中央孔加入菌液進(jìn)行時(shí)序觀察。

1.2.5 觀察各組細(xì)菌的生長(zhǎng)情況并測(cè)定各組細(xì)菌在微管內(nèi)最大平均侵入深度 使用Image J 軟件測(cè)定72 h各組各管徑20～30 個(gè)長(zhǎng)度500 μm微管內(nèi)細(xì)菌侵入最大深度，計(jì)算平均最大侵入深度，分析不同環(huán)境對(duì)細(xì)菌侵入深度的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 18.0軟件進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌在BHI培養(yǎng)基環(huán)境對(duì)微管系統(tǒng)的侵入情況

平行空白對(duì)照組72 h微管系統(tǒng)內(nèi)無細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液不渾濁。BHI組，細(xì)菌在腔室內(nèi)生長(zhǎng)迅速，并維持較高密度(圖 2)。2 h細(xì)菌逐漸充滿腔室并接近微管口，在2 μm和3 μm管徑的微管中近腔室側(cè)細(xì)菌排列較為密集，向末端逐漸變得稀疏，呈間斷排列(圖 3)；在5 μm和10 μm管徑的微管中排列密集。72 h不同管徑500 μm長(zhǎng)度微管內(nèi)細(xì)菌平均最大侵入深度分別為(339.3±63.6)、(389.6±35.3)、(487.8±11.3)、(500.0±0.0) μm(表 1)。

Tab 1 The depth of bacterial invasion in microtubes of different sizes at 72 h (μm, ±s)

注： ①與BHI組比較，Plt;0.01

2.2 營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境對(duì)糞腸球菌在微管侵入的影響

在營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境下，細(xì)菌在微流芯片內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖明顯減弱， 6～8 h逐漸由腔室接近微管系統(tǒng)(圖 2)。細(xì)菌對(duì)小管徑微管的侵入深度顯著下降(表 1)，72 h，腔室內(nèi)充滿細(xì)菌，但只有少量細(xì)菌進(jìn)入微管系統(tǒng)。小管徑各微管間細(xì)菌侵入情況差異較大，微管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量稀少，密集區(qū)域少見(圖 3)。

2.3 堿性環(huán)境(pH=10)對(duì)糞腸球菌在微管侵入的影響

細(xì)菌在pH=10的環(huán)境下生長(zhǎng)明顯受到抑制，6～8 h開始侵入微管，細(xì)菌在腔室內(nèi)表現(xiàn)出特殊的存在狀態(tài)，多呈鏈狀或團(tuán)塊狀存在，微管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量較少(圖 2～3)，除10 μm管徑微管外，細(xì)菌侵入微管深度顯著下降(表 1)。

圖 2 微管系統(tǒng)腔室內(nèi)細(xì)菌在不同環(huán)境下的時(shí)序變化

圖 3 72 h細(xì)菌在3 種環(huán)境下在管徑2 μm微管內(nèi)的侵入情況

Fig 3 Images of the bacterial invasion in 2 μm ×2 μm microtubes under different conditions at 72 h

3 討 論

糞腸球菌導(dǎo)致持續(xù)性根尖周炎與其較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力密切相關(guān)。糞腸球菌在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏狀態(tài)下可繼續(xù)生存，研究[3]顯示糞腸球菌可在根管治療后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的根管內(nèi)生存12 個(gè)月之久。本實(shí)驗(yàn)中采用了George等[8]實(shí)驗(yàn)的方法，用1×PBS模擬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的狀態(tài)。氫氧化鈣是目前根管治療中的最為常用消毒藥物[11]，糞腸球菌對(duì)其產(chǎn)生的堿性環(huán)境有很強(qiáng)的耐受能力[12]，可耐受的堿性極值達(dá)pH 11.1[5]。由于牙本質(zhì)的緩沖作用，根管內(nèi)氫氧化鈣產(chǎn)生的堿性環(huán)境pH值通常不會(huì)高于10[13]，因此本實(shí)驗(yàn)采用Appelbe等[9]的方法，使用2 種緩沖鹽將BHI培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為10，模擬氫氧化鈣在根管內(nèi)所產(chǎn)生的堿性環(huán)境。

此前研究[6,8]發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)可顯著影響糞腸球菌侵入牙本質(zhì)小管的能力，本研究顯示在營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下，細(xì)菌侵入微管的深度和數(shù)量均顯著下降。與冉淑君等[14]的研究結(jié)果相似，在營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境下，糞腸球菌的生長(zhǎng)速度明顯減慢，表現(xiàn)為細(xì)菌充盈腔室所需的時(shí)間明顯增加，密度明顯下降。細(xì)菌生長(zhǎng)速度下降可能是導(dǎo)致細(xì)菌侵入微管深度下降的原因之一。一方面由細(xì)菌密度不同產(chǎn)生的梯度所導(dǎo)致的擴(kuò)散作用減小，另一方面細(xì)菌在微管內(nèi)通過繁殖產(chǎn)生的主動(dòng)侵入能力也下降。但本研究結(jié)果也顯示，在24 h后，細(xì)菌在腔室內(nèi)的密度逐漸增高，并沒有發(fā)生可由此產(chǎn)生的向微管內(nèi)明顯的擴(kuò)散，在一些微管內(nèi)甚至沒有細(xì)菌的存在。推測(cè)可能有以下幾點(diǎn)原因：①管徑因素，隨著管徑的縮小，擴(kuò)散作用明顯減弱，細(xì)菌不容易通過擴(kuò)散進(jìn)入小管徑微管[7,10]；②細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)缺乏的狀態(tài)下可能更容易形成生物膜，生物膜結(jié)構(gòu)是細(xì)菌抵御外界不良環(huán)境的一種重要的方式。在Liu等[15]和劉紅艷等[16]實(shí)驗(yàn)中就證實(shí)細(xì)菌在饑餓狀態(tài)下可產(chǎn)生生物膜。生物膜的存在可能使處于游離狀態(tài)的細(xì)菌減少，生物膜的形成還可能堵塞微管的入口，使后續(xù)的細(xì)菌難以進(jìn)入微管系統(tǒng);③從本實(shí)驗(yàn)的時(shí)序觀察可以看到，在營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下，細(xì)菌即使進(jìn)入腔室，但向微管內(nèi)遷移的能力很弱。此前的研究[7]顯示糞腸球菌可能通過隨機(jī)運(yùn)動(dòng)侵入微管，外界環(huán)境的改變可能使細(xì)菌外在蛋白的表達(dá)、所帶電荷等性狀發(fā)生改變，隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的能力可能減弱，導(dǎo)致了細(xì)菌向微管內(nèi)侵入的能力下降。

本研究顯示在pH 10環(huán)境下，細(xì)菌不僅生長(zhǎng)速度明顯下降，還表現(xiàn)出特殊的狀態(tài)，多呈鏈狀或團(tuán)塊狀存在，這種變化隨著時(shí)間延長(zhǎng)更加明顯，與在BHI和PBS中的形態(tài)存在顯著差異。Ran等[17]報(bào)道糞腸球菌在堿性環(huán)境下，細(xì)胞外形和胞質(zhì)均會(huì)出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，同時(shí)細(xì)菌的疏水性顯著提高。研究[6,9]還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在堿性環(huán)境下包括調(diào)控細(xì)胞分裂的多種基因的表達(dá)受到影響。以上這些因素可能是導(dǎo)致糞腸球菌在堿性環(huán)境下表現(xiàn)出特殊形態(tài)的原因。

在pH 9、10的條件下，細(xì)菌對(duì)牙本質(zhì)小管的侵入較正?？煞謩e下降50%和80%以上[6]。本研究結(jié)果也顯示，細(xì)菌在pH 10的堿性環(huán)境下對(duì)微管系統(tǒng)的侵入深度顯著下降。Ran等[6]認(rèn)為堿性環(huán)境下細(xì)菌侵入能力的下降不能簡(jiǎn)單歸因于細(xì)菌生長(zhǎng)速度的下降，而可能與細(xì)菌在此環(huán)境下表現(xiàn)出的疏水性增加有關(guān)。有研究還觀察到糞腸球菌在堿性環(huán)境下更容易形成生物膜[5]，如前所述生物膜的形成也可能會(huì)妨礙細(xì)菌侵入牙本質(zhì)小管的深部。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到的細(xì)菌在堿性環(huán)境下的特殊存在方式也說明堿性環(huán)境造成細(xì)菌侵入能力下降可能是多方面因素的綜合結(jié)果。

本研究結(jié)果表明糞腸球菌在營(yíng)養(yǎng)缺乏和堿性環(huán)境下，對(duì)微管系統(tǒng)尤其是小管徑微管的侵入深度和數(shù)量均顯著下降。這一方面可能與在這2 種環(huán)境下細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制有關(guān)，更有可能是細(xì)菌在壓力環(huán)境下通過某些基因的調(diào)控來適應(yīng)外界不良環(huán)境的表現(xiàn)。結(jié)果也表明該微流芯片具有制作精度高、高通量、平行對(duì)比和便于觀察等特點(diǎn)，適于對(duì)細(xì)菌在微小空間內(nèi)的生長(zhǎng)做連續(xù)觀察，可為今后相關(guān)研究提供標(biāo)準(zhǔn)化的研究平臺(tái)。

[1] Fouad AF, Zerella J, Barry J, et al. Molecular detection ofEnterococcusspeciesin root canals of therapy-resistant endodontic infections[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2005, 99(1):112-118.

[2] 張富華，張建鳳，何愛民，等. 完善根管充填后治療失敗感染根管中糞腸球菌的活菌研究[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2015, 31(3):365-368.

[3] Peters LB, Wesselink PR, Buijs JF, et al. Viable bacteria in root dentinal tubules of teeth with apical periodontitis[J]. J Endod, 2001, 27(2): 76-81.

[4] Sedgley CM, Lennan SL, Appelbe OK. Survival ofEnterococcusfaecalisin root canalsexvivo[J]. Int Endod J, 2005, 38(10):735-742.

[5] Distel JW, Hatton JF, Gillespie MJ. Biofilm formation in medicated root canals[J]. J Endod, 2002, 28(10):689-693.

[6] Ran S, Wang J, Jiang W，et al. Assessment of dentinal tubule invasion capacity ofEnterococcusfaecalisunder stress conditionsexvivo[J]. Int Endod J, 2015, 48(4):362-372.

[7] Sun X, Wang S, Yang Y, et al. Study of invasion and colonization ofE.faecalisin microtubes by a novel device[J]. Biomed Microdevices, 2016, 18(5): 82.

[8] George S, Kishen A, Song KP. The role of environmental changes on monospecies biofilm formation on root canal wall byEnterococcusfaecalis[J]. J Endod, 2005, 31(12):867-872.

[9] Appelbe OK, Sedgley CM. Effects of prolonged exposure to alkaline pH onEnterococcusfaecalissurvival and specific gene transcripts[J]. Oral Microbiol Immunol, 2007, 22(3): 169-174.

[10]Sigusch BW, Kranz S, Klein S, et al. Colonization ofEnterococcusfaecalisin a new SiO/SiO2-microtubeinvitromodel system as a function of tubule diameter[J]. Dent Mater, 2014,30(6):661-668.

[11]Siqueira JF Jr, Lopes HP. Mechanisms of antimicrobial activity of calcium hydroxide: A critical review[J]. Int Endod J, 1999, 32(5):361-369.

[12]van der Waal SV, van der Sluis LW, ?zok AR, et al. The effects of hyperosmosis or high pH on a dual-species biofilm ofEnterococcusfaecalisandPseudomonasaeruginosa: Aninvitrostudy[J]. Int Endod J, 2011, 44(12):1110-1117.

[13]Haapasalo HK, Siren EK, Waltimo TM, et al. Inactivation of local root canal medicaments by dentine: Aninvitrostudy[J]. Int Endod J, 2000, 33(2):126-131.

[14]冉淑君,鄂佳,朱彩蓮， 等. 不同理化條件對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)周期及生物膜形成能力的影響[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2013，48(9):529-534.

[15]Liu H，Wei X，Ling J，et al．Biofilm formation capability ofEnterococcusfacealiscells in starvation phase and its susceptibility to sodium hypochlorite[J]．J Endod，2010, 36(4):630-635.

[16]劉紅艷，韋曦，凌均棨. 饑餓狀態(tài)糞腸球菌生物膜胞外多糖的合成能力[J].中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志(電子版), 2012, 6(10):16-20.

[17]Ran S, He Z, Liang J. Survival ofEnterococcusfaecalisduring alkaline stress: Changes in morphology, ultrastructure, physiochemical properties of the cell wall and specific gene transcripts[J]. Arch Oral Biol, 2013, 58(11):1667-1676.

(收稿： 2016-08-18 修回： 2016-09-18)

TheeffectsofenvironmentalchangesonE.faecalisgrowthandpenetrationintomicrotubesinamicrofluidchip

SUNXiaoqiang1,WANGShujing2,LUOChunxiong2,HOUBenxiang1.

1.100050,DepartmentofEndodontics,SchoolofStomatologyCapitalMedicalUniversityBeijing,China; 2.StateKeyLaboratoryforArtificialMicrostructuresandMesoscopicPhysics,SchoolofPhysicsPekingUniversityBeijing

Objective: To evaluate the effects of different growth conditions onE.faecalisgrowth in the microfluid chip and the penetration ofE.faecalisinto microtubes.MethodsFour units on the chip were randomly selected as control, BHI, nutrient-Tdeprived(PBS) and pH 10 groups. The growth ofE.faecaliswas monitored by microscope for a period of 72 h after the suspension ofE.faecalishad been added into the chip.ResultsThe microscopic analysis showed a distinct variation in the growth rate and morphological feature under different experimental conditions. he depth of bacterial penetration was significantly greater in BHI group.ConclusionThis study demonstrated that environmental changes can significantly influence the growth and penetration ofE.faecalisinto the micro tubes.

Dentinaltubules;Enterococcusfaecalis;Microfluidics;Persistentapicalperiodontitis

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)： 81170952, 11174012, 11434001)； 北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(編號(hào)： XMLX201301)

100050， 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院牙體牙髓科(孫曉強(qiáng) 侯本祥)； 北京大學(xué)定量生物學(xué)中心，前沿交叉學(xué)科研究院(王淑靜 羅春雄)

侯本祥 010-57099230 E-mail: houbenxiang@gmail.com

R780.2

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.011