吳廣升 惠光艷

載microRNA-148b殼聚糖/透明質(zhì)酸納米粒制備及鑒定

吳廣升 惠光艷

目的制備并評(píng)價(jià)殼聚糖/透明質(zhì)酸(CS/HA)納米粒負(fù)載microRNA-148b(miR-148b)的效果。方法制備CS/HA/miR-148b納米粒, 用激光納米測(cè)量?jī)x和透射電鏡對(duì)其粒徑、電位和形態(tài)進(jìn)行觀察。通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)觀察CS/HA 納米粒對(duì)miR-148b的包載情況。用CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CS/HA/miR-148b納米粒對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 的細(xì)胞毒性; 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果CS/HA/miR-148b納米粒呈球形，粒徑為160～370 nm，電位為+15 mV～+41 mV。氮磷比為20可以達(dá)到最佳的包封效果。CS/HA/miR-148b納米粒對(duì)大鼠MSCs無細(xì)胞毒性并且具有較高的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)論CS/HA 納米?？梢园踩行У貙iR-148b轉(zhuǎn)染入MSCs中。

微小RNA； 殼聚糖； 納米粒； 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)

微小核糖核酸(MicroRNA, miRNA)是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，大約由21～25 個(gè)核苷酸組成。miRNA通過翻譯水平抑制或促進(jìn)目的mRNAs的降解而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，如miRNA可以調(diào)控干細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及癌變等。miRNA 在干細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮了非常重要的作用，被廣泛應(yīng)用于骨再生方面的研究[1-3]。然而，極易降解、細(xì)胞攝取性差及潛在的免疫源性等缺點(diǎn)限制了miRNA的臨床應(yīng)用。因此，選擇合適的載體負(fù)載miRNA提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率是目前研究的熱點(diǎn)。

非病毒性基因載藥系統(tǒng)，如殼聚糖/透明質(zhì)酸(chitosan/hyaluronic acid, CS/HA)納米粒具有良好的生物相容性、生物降解性、高穩(wěn)定性、低宿主免疫反應(yīng)等特點(diǎn)，可以作為基因載體用于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。殼聚糖(CS)是一種帶高正電荷的天然高分子多糖，可以與帶負(fù)電荷的基因、生長(zhǎng)因子、 抗腫瘤藥物等結(jié)合形成納米粒。透明質(zhì)酸(HA)是一種天然陰離子多糖，已經(jīng)被廣泛用于藥物投遞系統(tǒng)的研究。miR-148b是一種強(qiáng)促成骨miRNA，轉(zhuǎn)染干細(xì)胞后可以高效地促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)[4]。本實(shí)驗(yàn)制備CS/HA/miR-148b納米粒并對(duì)其理化性質(zhì)、細(xì)胞毒性及轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，為CS/HA/miR-148b納米粒進(jìn)一步應(yīng)用于促進(jìn)體內(nèi)骨再生研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

醫(yī)用級(jí)殼聚糖(脫乙酰度90%，相對(duì)分子質(zhì)量100 000，金殼，浙江)，透明質(zhì)酸(相對(duì)分子質(zhì)量10 000，福瑞達(dá)，山東)，胎牛血清 (Hyclone，美國(guó))，α-MEM培養(yǎng)液 (低糖型，Gibco，美國(guó))，胰蛋白酶(Sigma，美國(guó))，乙酸(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán))， CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Heraeus，德國(guó))，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)。miR-148b (吉瑪, 上海)。

1.2 方法

1.2.1 CS/HA/miR-148b納米粒的制備 參考相關(guān)文獻(xiàn)制備CS/HA納米粒[5]。將適量CS溶于2%的乙酸并調(diào)整pH值至5.5， 適量HA溶于去離子水中。將CS和HA溶液過慮除菌(0.22 μm)后以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、 7∶1的體積比混合并在磁力攪拌器上攪拌30 min(3 000 r/min)。HA濃度保持11.25 μg/ml不變，CS的濃度為:5.625、11.25、22.5、33.75、45、56.25、67.5、78.25 μg/ml。 將適量的20 μmol/L miR-148b以不同的N/P(CS的氨基與miRNA的磷酸基團(tuán)的摩爾比例)加入CS/HA納米粒體系，混勻后室溫下靜置30 min獲得CS/HA/miR-148b。

1.2.2 CS/HA/miR-148b納米粒的性質(zhì) 通過激光納米粒徑測(cè)量?jī)x (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, UK) 檢測(cè)CS/HA/miR-148b納米粒的粒徑、電位。采用透射電鏡(JEM-1200EX, JEOL Ltd., Japan)觀察納米粒形態(tài)。

1.2.3 凝膠電泳實(shí)驗(yàn) 評(píng)價(jià)CS/HA納米粒miR-148b包封情況采用2%的瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)。將裸miR-148b及不同N/P (1∶1、 5∶1、 10∶1、 15∶1、 20∶1、 25∶1) CS/HA/miR-148b納米粒體系加入2%瓊脂糖中，電泳緩沖液為乙酸-EDTA緩沖液(pH 8.0)。在110V電壓電泳20 min后凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照 (GDS-8000, UVP, USA)。

1.2.4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)原代培養(yǎng)及鑒定 參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]， 頸椎脫臼處死3 周齡SD大鼠后，分離股骨，剪斷兩端后α-MEM沖洗，離心，重懸，原代培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[7]的方法，對(duì)第3 代MSCs進(jìn)行成脂及成骨誘導(dǎo)及鑒定。

1.2.5 CS/HA/miR-148b納米粒細(xì)胞毒性檢測(cè)

MSCs以2×104/孔接種96 孔板中， 24 h后換液，CS/HA/miR-148b納米粒以25、 50、 100、 200 μg/ml的濃度加入96 孔板中，對(duì)照組不含納米粒。在孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后采用CCK-8試劑盒(七海生物，上海)進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。

1.2.6 CS/HA/miR-148b納米粒轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)不同濃度的CS/HA/miR-148b(miR-148b被Cy3標(biāo)記)對(duì)大鼠MSCs轉(zhuǎn)染效率。以 5×104/孔的密度將MSCs加入24 孔板， 24 h 后每孔加入含不同濃度的CS/HA/miR-148b納米粒的(0、 50、 100、 150、 200 nmol/L)α-MEM培養(yǎng)液各0.5 ml(不含血清)。轉(zhuǎn)染 4 h 后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 20 h。然后棄上清，PBS沖洗 2 次，1%多聚甲醛固定 30 min。通過流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)檢測(cè)MSCs中Cy3的熒光強(qiáng)度評(píng)價(jià)CS/HA/miR-148b轉(zhuǎn)染的效率。同時(shí)將24孔板內(nèi)的MSCs進(jìn)行DAPI染色，倒置熒光顯微鏡下定性觀察CS/HA/miR-148b對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 CS/HA/miR-148b納米粒的性質(zhì)

CS/HA/miR-148b納米粒的粒徑為160～370 nm，電位為+15 mV～+41 mV。CS∶HA為4∶1時(shí)納米粒粒徑最小(圖 1)為160 nm，電位為+34 mV。 透射電鏡觀察CS/HA/miR-148b納米粒呈球形分散分布(圖 2)。

2.2 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

如圖 3所示，隨著CS/HA/miR-148b中N/P的比率增加， CS/HA納米粒對(duì)miR-148b包封作用越來越明顯，當(dāng)N/P為20時(shí)，可以達(dá)到最佳的包封率。

圖 1 CS/HA/miR-148b納米粒的性質(zhì)

圖 2 透射電鏡觀察CS/HA/miR-148b 納米粒形態(tài)

(A: ×10 000, B: ×40 000)

Fig 2 TEM images of CS/HA/miR-148b nanoparticles

(A: ×10 000, B: ×40 000)

圖 3 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(N/P=1∶1～25∶1)

Fig 3 Gel retardation analysis of HA/CS/miR-148b nanoparticles(N/P=1∶1～25∶1)

2.3 原代培養(yǎng)培養(yǎng)MSCs及多向分化鑒定

原代培養(yǎng)獲得大鼠MSCs，茜素紅染色及油紅染色證明其具有成骨及成脂多向方向分化潛能(圖 4)。

2.4 CS/HA/miR-148b納米粒細(xì)胞毒性檢測(cè)

如圖 5所示， 25～200 μg/ml CS/HA/miR-148b納米粒對(duì)MSCs的增殖均未有明顯抑制作用，說明 CS/HA納米粒是一種安全的基因載體，CS/HA/miR-148b納米粒可以用于進(jìn)一步細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.5 CS/HA/miR-148b納米粒轉(zhuǎn)染效率

如圖 6所示，隨著CS/HA/miR-148b納米粒濃度由50 nmol/L增加至150 nmol/L，其轉(zhuǎn)染效率逐漸增高。但是，當(dāng)CS/HA/miR-148b納米粒濃度達(dá)到200 nmol/L時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率較150 nmol/L沒有明顯增加，說明CS/HA/miR-148b納米粒在150 nmol/L時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了最佳。圖 7顯示在150 nmol/L時(shí)，大量紅色的miR-148b(Cy3標(biāo)記)圍繞在藍(lán)色的MSCs核周圍(DAPI染色)。

A: 茜素紅染色； B: 油紅O染色

圖 5 HA/CS/miR-148b納米微粒細(xì)胞毒性

*:vs0組,Plt; 0.001; #、 ##和###:vs50 nmol/L組,Plt;0.05、Plt;0.01和Plt;0.001; @:vs100 nmol/L組，Plt;0.05

圖 6 不同濃度HA/CS/miR-148b納米粒轉(zhuǎn)染效率

*：vs0 group，Plt;0.001; #， ## and ###：vs50 nmol/L，Plt;0.05, 0.01 and 0.001; @：vs100 nmol/L，Plt;0.05

Fig 6 Transfection efficiency of HA/CS/miR-148b nanoparticles with various doses

圖 7 熒光顯微鏡觀察HA/CS/miR-148b納米粒內(nèi)吞情況/(150 nmol/L)

3 討 論

細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等已經(jīng)被廣泛用于組織再生中，然而，蛋白質(zhì)類生長(zhǎng)因子由于內(nèi)在穩(wěn)定性差、成本高、半衰期短等缺點(diǎn)限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用[8]。基因治療提供了一種新的選擇，近年來 miRNA吸引了很多學(xué)者的興趣，因?yàn)樗梢酝ㄟ^調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)廣泛影響細(xì)胞功能，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及其他代謝過程[9]。miRNA在促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)體內(nèi)成骨方面起到了重要作用。Wu等[10]以脂質(zhì)體為載體將miR-148b包載后凍干在培養(yǎng)板表面，發(fā)現(xiàn)miR-148b可以成功地轉(zhuǎn)染入MSCs內(nèi)并顯著提高堿性磷酸酶、骨鈣素、Ⅰ型膠原等成骨相關(guān)基因的表達(dá)。

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的關(guān)鍵在于安全和較高的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染載體的選擇尤為重要。病毒和脂質(zhì)體是最常見的轉(zhuǎn)染載體，但前者在安全性上存在隱患，后者價(jià)格較貴且毒性較大，限制了它們的臨床應(yīng)用。因此，尋找高效、低毒且價(jià)格低廉的載體是基因轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵。殼聚糖由于其良好的細(xì)胞相容性、生物可降解性、無毒性、無免疫原性及抗菌活性等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域倍受關(guān)注，殼聚糖作為一種新型的非病毒載體，具有低毒、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，是近年來基因轉(zhuǎn)染載體的研究熱點(diǎn)之一[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)通過殼聚糖帶正電荷的氨基與透明質(zhì)酸帶負(fù)電荷的羧基間凝聚形成HA /CS納米粒，再吸附帶負(fù)電荷的miR-148b從而形成 HA/CS/miR-148b納米粒。CS∶HA為4∶1時(shí)納米粒的粒徑為160 nm，電位為+34 mV，有利于細(xì)胞的黏附和吞噬，從而順利地將miR-148b轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。Liu等[13]制備了油酰殼聚糖/透明質(zhì)酸/質(zhì)粒DNA納米粒并利用此轉(zhuǎn)染體系對(duì)Caco-2細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)此納米粒轉(zhuǎn)染體系具有低細(xì)胞毒性，高轉(zhuǎn)染效率的特點(diǎn)。我們制備了HA/CS/miR-148b納米粒并將其用于MSCs的轉(zhuǎn)染，同樣取得了低毒、高效的轉(zhuǎn)染效果。

HA /CS納米粒是一個(gè)安全、高效的miRNA載體，將HA/CS/miR-148b納米粒用于轉(zhuǎn)染干細(xì)胞并促進(jìn)骨再生具有廣闊的研究前景。

[1] Li Y, Fan L, Liu S, et al. The promotion of bone regeneration through positive regulation of angiogenic-osteogenic coupling using microRNA-26a[J]. Biomaterials, 2013, 34(21):5048-5058.

[2] Sriram M, Sainitya R, Kalyanaraman V, et al. Biomaterials mediated microRNA delivery for bone tissue engineering[J]. Int J Biol Macromol, 2015, 74:404-412.

[3] Goff LA, Boucher S, Ricupero CL, et al. Differentiating human multipotent mesenchymal stromal cells regulate microRNAs: Prediction of microRNA regulation by PDGF during osteogenesis[J]. Exp Hematol, 2008, 36(10):1354-1369.

[4] Qureshi AT, Monroe WT, Dasa V, et al. miR-148b-nanoparticle conjugates for light mediated osteogenesis of human adipose stromal/stem cells[J]. Biomaterials, 2013, 34(31):7799-7810.

[5] Lu HD, Zhao HQ, Wang K, et al. Novel hyaluronic acid-chitosan nanoparticles as non-viral gene delivery vectors targeting osteoarthritis[J]. Int J Pharm, 2011, 420(2):358-365.

[6] Jia S, Yang X, Song W, et al. Incorporation of osteogenic and angiogenic small interfering RNAs into chitosan sponge for bone tissue engineering[J]. Int J Nanomedicine, 2014, 9:5307-5316.

[7] Gao LN, An Y, Lei M, et al. The effect of the coumarin-like derivative osthole on the osteogenic properties of human periodontal ligament and jaw bone marrow mesenchymal stem cell sheets[J]. Biomaterials, 2013, 34(38):9937-9951.

[8] Peng B, Chen Y, Leong KW. MicroRNA delivery for regenerative medicine[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 88:108-122.

[9] Chen RR, Mooney DJ. Polymeric growth factor delivery strategies for tissue engineering[J]. Pharm Res, 2003, 20(8):1103-1112.

[10]Wu K, Xu J, Liu M, et al. Induction of osteogenic differentiation of stem cells via a lyophilized microRNA reverse transfection formulation on a tissue culture plate[J]. Int J Nanomedicine, 2013, 8:1595-1607.

[11]董培紅, 鄭建建, 盧中秋, 等. 納米殼聚糖攜帶miR-29b轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2013, 23(2):332-337.

[12]陳玉陽(yáng), 謝富強(qiáng), 張赟, 等. 納米殼聚糖骨形成蛋白水凝膠修復(fù)下頜骨缺損實(shí)驗(yàn)研究[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 30(5):624-628.

[13]Liu Y, Kong M, Cheng XJ, et al. Self-assembled nanoparticles based on amphiphilic chitosan derivative and hyaluronic acid for gene delivery[J]. Carbohydr polym, 2013, 94(1):309-316.

(收稿： 2016-10-22 修回： 2016-11-19)

Preparationandcharacterizationofchitosan/hyaluronicacidnanoparticlesformicroRNA-148bdelivery

WUGuangsheng,HUIGuangyan.

266071,NavyQingdaoFirstSanatorium,China

Objective: To prepare and characterize chitosan/hyaluronic acid (CS/HA) nanoparticles for miRNA-148b(miR-148b) delivery.MethodsCS/HA/miR-148b nanoparticles were prepared. The particle size, zeta potential, morphology were investigated by nano laser granulometer and TEM respectively. The encapsulation efficiency of CS/HA nanoparticles was evaluated by gel retarding analysis. The cytotoxicity and transfection efficiency of CS/HA/miR-148b nanoparticles on rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) were evaluated by CCK-8 assay, transfection assay and FCM respectively.ResultsThe CS/HA/miR-148b nanoparticles were discrete spherical particles with the diameter of 160 to 370 nm and zeta potential of +15 to +41 mV. N/P ratio at 20∶1 of the nanoparticles showed the optimum encapsulation efficiency for miR-148b. CS/HA/miR-148b nanoparticles exhibited no cytotoxicity to MSCs and could deliver miR-148b to the MSCs at high transfection efficiency.ConclusionCS/HA/miR-148b nanoparticles are safe and effective for miR-148b delivery into MSCs.

microRNA;Chitosan;Nanoparticle;Mesenchymalstemcells(MSCs)

青島市市南區(qū)公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)： 2014-14-047-SW)

266071， 海軍青島第一療養(yǎng)院

惠光艷 E-mail: huiguangyan1968@126.com

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.007