田路路，孟慶玲，喬 軍，于偉偉，孟 丹，李重陽，才學(xué)鵬 ，陳創(chuàng)夫

(1.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院， 新疆石河子 832003； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所， 蘭州 730046)

綿羊肺炎支原體延伸因子EF-P基因的克隆、表達及其重組蛋白免疫原性研究

田路路1，孟慶玲1，喬 軍1，于偉偉1，孟 丹1，李重陽1，才學(xué)鵬2，陳創(chuàng)夫1

(1.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院， 新疆石河子 832003； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所， 蘭州 730046)

為篩選綿羊肺炎支原體(MO)免疫相關(guān)蛋白，以MO新疆流行株基因組DNA為模板，通過PCR擴增其EF-P基因，測序后對其編碼蛋白進行分子特征分析；用生物信息學(xué)軟件預(yù)測其抗原表位集中區(qū)編碼片段；進一步將該基因片段克隆入pET-32a(+)中，構(gòu)建原核表達載體pET-32a(+)-EF-P，將pET-32a(+)-EF-P質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞EscherichiacoliBL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達后，檢測重組蛋白反應(yīng)原性和免疫原性。SDS-PAGE結(jié)果顯示，EF-P重組蛋白分子質(zhì)量為29.5 ku；Western blot結(jié)果顯示，該重組蛋白可被MO陽性血清特異性識別，證實其具有良好的反應(yīng)原性；小鼠免疫試驗結(jié)果顯示，該重組蛋白可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體，采用正向間接血凝方法檢測效價可達1∶64，提示其具有較強的免疫原性。

綿羊肺炎支原體；EF-P；克??；表達；免疫原性

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae, MO)是綿羊呼吸道疾病的重要致病菌之一，也可引起山羊呼吸道疾病[1-2]，其定殖于呼吸道黏膜表面，可引起呼吸道感染，并導(dǎo)致咳嗽、呼吸困難和生長不良，還可引起免疫抑制現(xiàn)象[3]。該病已廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[4-5]。目前，疫苗免疫接種已被證實是一種有效防控MO感染的主要手段。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑

MO新疆流行株(MO XJ1株)分離自新疆某羊場疑似MO感染羊的病料[14]。E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)和pET-32a(+) 質(zhì)粒由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)寄生蟲實驗室保存。pMD19-T載體、DNA marker、核酸限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA Ligase和蛋白Marker購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自諾維森(北京)生物科技有限公司；MO正向間接血凝診斷試劑盒(IHA)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。MO陽性血清分離自新疆塔城地區(qū)感染MO的綿羊；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG購自中彬金橋公司；增強型HRB-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；昆明系雌鼠購自石河子大學(xué)實驗動物中心。

1.2 總DNA的提取

取MO感染羊的肺組織，加入去離子水進行研磨，將研磨液置于1.5 mL EP管中，按照TaKaRa公司的病毒基因組DNA提取試劑盒操作說明提取綿羊肺炎支原體的DNA， -20 ℃保存，備用。

1.3 引物設(shè)計與合成

用Primer 5.0軟件，根據(jù)GenBank中發(fā)表的MO基因序列(登錄號: NZ_AFHO01000009)，設(shè)計擴增全長EF-P基因的特異性引物：EF-P(C)-F：5′-ATGTCACGAAAATTTGAACTA-3′；EF-P(C)-X：5′-TTAGTCGTCAGATTTGATTGC-3′；同時設(shè)計擴增EF-P基因編碼抗原表位集中區(qū)序列的特異性引物，并根據(jù)pET-32a(+)載體上的多克隆位點選擇限制性內(nèi)切酶，在上游引物中引入EcoRⅠ 酶切位點，下游引物中引入XhoⅠ酶切位點。上游引物EF-PE-F：5′-GAATTCAGACAAGCAACAAATTATG-3′，下游引物EF-PX-R：5′- CTCGAGTGCTGCTTTGTCTTGTAA-3′(下劃線處分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點)，引物由華大基因生物公司合成。

1.4MO新疆株EF-P基因的PCR擴增及分子特征分析

采用20 μL反應(yīng)體系進行PCR擴增：ddH2O 7 μL，2×PCR Mix 10 μL，模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性94 ℃ 50 s，退火61 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 30 s，共32個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段，與pMD19-T載體4 ℃過夜連接；轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細胞中。通過菌液PCR篩選陽性菌落，并送華大基因生物公司測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T-EF-P。利用生物在線軟件對其編碼氨基酸序列分子質(zhì)量、糖基化位點、跨膜區(qū)、信號肽、高級結(jié)構(gòu)等進行預(yù)測分析。

在女主人公的生活故事中，構(gòu)成兩性關(guān)系影響的男人有五位，他們是劍、李木、子墨、老師和“他”（抑或“金岳霖”）。這些男子分作兩組，與女主人公形成兩個“多角戀”關(guān)系。第一個多角戀即構(gòu)成了“江山嬌”敘述線。其戀情關(guān)系發(fā)生在江山嬌與劍、李木和老師之間，時間在江山嬌與李木結(jié)婚前。最終以江山嬌與李木結(jié)婚而告結(jié)。第二個多角戀構(gòu)成了“伊一”敘述線。其戀情關(guān)系在伊一與子墨、李木和“他”之間進行。這個戀情是無解的，乃至一直到伊一絕塵而去。

1.5重組表達載體pET-32a(+)-EF-P構(gòu)建

將測序正確的pMD19-T-EF-P質(zhì)粒與pET-32a(+) 質(zhì)粒用EcoRⅠ和XhoⅠ在37 ℃條件下同時進行雙酶切，反應(yīng)結(jié)束后分別回收目的片段和載體片段，用T4DNA連接酶4 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞E.coliDH5α中，挑取單個菌落，進行PCR鑒定。取陽性克隆提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定正確的重組表達載體質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-EF-P。

1.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達及免疫印跡分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-EF-P轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)中，次日挑取單個菌落37 ℃搖菌過夜，取150 μL菌液接種于15 mL含Amp抗性的液體LB培養(yǎng)基中，用1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4、6和8 h，12 000 r/min離心1 min后收集菌體，同時設(shè)置空載體和未加IPTG誘導(dǎo)的重組菌做陰性對照，進行SDS-PAGE電泳分析；以MO陽性血清為一抗，辣根酶標(biāo)記的兔抗羊IgG為二抗，進行Western blot 分析。

1.7 EF-P重組蛋白的免疫原性研究

將10只25日齡的昆明系雌鼠隨機分成試驗組和對照組，每組各5只。免疫制劑的制備：50 μg EF-P重組蛋白與弗氏完全佐劑按體積比1∶1充分乳化后形成油包水型的制劑。試驗組：V(50 μg EF-P重組蛋白溶液)∶V(弗氏完全佐劑)=1∶1；對照組：V(PBS緩沖液)∶V(弗氏完全佐劑)=1∶1。采用皮下多點注射方式進行首次免疫，免疫劑量為200 μL。首免14 d后進行二次免疫，試驗組：V(50 μg EF-P重組蛋白溶液)∶V(弗氏不完全佐劑)=1∶1；對照組：V(PBS緩沖液)∶V(弗氏不完全佐劑)=1∶1。7 d后采血，分離血清，用MO IHA試劑盒測定小鼠(試驗組和對照組)血清樣品的抗體效價。

2 結(jié)果與分析

2.1EF-P基因的擴增及其編碼蛋白的分子特征

對EF-P基因進行PCR擴增，條帶大小與目的條帶相符(圖1)。經(jīng)測序，EF-P基因全長2 085 bp，編碼694個氨基酸，理論等電點5.38，該基因中G+C占37.27%，高于MO全基因組的平均G+C含量(28.85%)。利用網(wǎng)上在線工具預(yù)測EF-P蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，發(fā)現(xiàn)其無跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽。通過Motif Scan在線軟件對結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測分析，顯示在73～76、343～346位氨基酸處有2個酰胺化位點，在340～343、679～682位氨基酸處有2個潛在的N-糖基化位點，在17～24位氨基酸處有一個ATP/GTP結(jié)合位點，在245～248位氨基酸處有1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點，有13個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和12個蛋白激酶磷酸化位點，在60～65、157～162、372～377、549～554位氨基酸處有4個N-?；稽c，在51～66 位氨基酸處有1個GTP結(jié)合延伸因子標(biāo)簽(圖2)。利用在線軟件BepiPred 1.0b Server預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在109～205位氨基酸處有4個優(yōu)勢抗原表位；經(jīng)DNAMAN 分析發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)不存在終止密碼子，可正常翻譯；Motif Scan在線軟件分析發(fā)現(xiàn)該段氨基酸序列存在多個功能結(jié)構(gòu)域。

M.DNA marker DL2000; 1～4.菌液PCR產(chǎn)物 PCR products of bacterial liquid

圖1MOEF-P基因的PCR擴增
Fig.1AmplificationofEF-PgeneofMObyPCR

圖中有2個酰胺化位點(下劃線)，4個N端酰基化位點(斜體加粗)，2個N端糖基化位點(波浪線)，1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(雙下劃線)，13個酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位點(陰影部分)，12個蛋白激酶磷酸化位點(加粗)。

There are two amidation site (underlined),four N-terminal acylation sites (bold italic),two N-glycosylation sites (wave),one cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site(double-underline),thirteen casein kinase Ⅱ phosphorylation site(shaded)and twelve protein kinase C phosphorylation site(bold).

圖2MOEF-P基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列
Fig.2NucleotidesequenceandencodedaminoacidsequenceofEF-PgeneofMO

2.2 EF-P蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用PSIPRED在線軟件對EF-P基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測顯示，其α-螺旋占40.63%，β-折疊占17.44%，無規(guī)卷曲占41.93%，無β-轉(zhuǎn)角，利用Swiss-Model 數(shù)據(jù)庫在線模擬EF-P蛋白的3D結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.3 EF-P蛋白基因遺傳進化分析

對基于該段基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析并繪制遺傳進化樹發(fā)現(xiàn)，MOEF-P基因與殊異支原體、豬肺炎支原體和絮狀支原體具有較高的同源性，綿羊肺炎支原體屬間高度同源，兩者氨基酸序列相似性高達99.14%，與豬肺炎支原體氨基酸相似性為93.66%，說明兩者親緣關(guān)系較近；與大腸桿菌和芽孢桿菌屬不在同一支，說明親緣關(guān)系較遠(圖4)。

2.4 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定

用特異性引物成功擴增優(yōu)勢抗原表位基因264 bp (圖5)，pET-32a(+)-EF-P經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到目的片段和pET-32a(+)載體片段(圖 6)，表明成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)-EF-P。

2.5表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Westernblot分析

SDS-PAGE分析顯示，IPTG誘導(dǎo)的樣品在29.5 ku處有明顯條帶，且與理論分析值相符，重組菌在IPTG誘導(dǎo)8 h時表達量達到最高。

Western blot分析結(jié)果表明，重組蛋白可被MO陽性血清識別，說明重組蛋白EF-P具有較好的反應(yīng)原性(圖7)。

圖3 PSIPRED軟件預(yù)測的EF-P二級與三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted secondary and tertiary structure of EF-P by using PSIPRED software

圖4 EF-P基因系統(tǒng)進化關(guān)系Fig.4 Phylogenetic tree of Mycoplasma species based on EF-P gene

M.DNA marker DL2000;1～3.菌液PCR產(chǎn)物 PCR products of bacterial liquid

圖5EF-P的PCR鑒定
Fig.5IdentificationofEF-PbyPCR

M.DNA marker DL5000; 1～2.pET-32a(+)-EF-P雙酶切產(chǎn)物 The products from pET-32a(+)-EF-Pby double enzyme digestion

圖6pET-32a(+)-EF-P的雙酶切鑒定
Fig.6IdentificationofpET-32a(+)-EF-Pbydoubleenzymedigestion

2.6 重組蛋白的小鼠免疫試驗

小鼠經(jīng)重組蛋白免疫 2 次后，采血分離血清，用MO IHA試劑盒檢測，結(jié)果證實重組表達的EF-P能刺激機體產(chǎn)生相對較強的免疫反應(yīng)，抗體效價大于1∶64。表明重組蛋白EF-P具有較好的免疫原性。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein marker; 1.pET-32a(+)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達產(chǎn)物 pET-32a(+)plasmid induced by IPTG; 2～5.pET-32a(+)-EF-P重組菌IPTG誘導(dǎo)2、4、6、8 h的表達產(chǎn)物 pET-32a(+)-EF-Pplasmid induced 2 h,4 h,6 h and 8 h by IPTG; 6.未加誘導(dǎo)劑IPTG的 pET-32a(+)-EF-P重組菌的Western blot分析 Western blotting of the pET-32a(+)-EF-Pplasmid without IPTG;7.純化的重組蛋白的Western blot分析 Western blotting of the purified recombinant using antiserum ofM.ovipneumoniae.

圖7重組蛋白EF-P的SDS-PAGE和Westernblot分析
Fig.7AnalysisofrecombinantEF-PproteinbySDS-PAGEandWesternblot

3 討 論

MO是一種無細胞壁的微生物，與細菌相比，其基因組編碼的蛋白雖然較少，但其保護性抗原蛋白目前尚未被鑒定。對人肺炎支原體、豬肺炎支原體、結(jié)核分枝桿菌的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EF-Tu可作為一種潛在的抗原[15]。Alonso等[16]為鑒定潛在的診斷抗原，從自然感染的動物血清抗體中篩選出絲狀支原體亞種，成功構(gòu)建基因組文庫，并在大腸桿菌中表達。Western blot分析表明，重組EF-Tu蛋白可被牛傳染性胸膜肺炎陽性血清特異性識別。有研究表明，EF-Tu 是MO膜相關(guān)蛋白，動物免疫試驗證實該重組蛋白能夠誘導(dǎo)Th1、Th2型免疫應(yīng)答產(chǎn)生較高的抗體水平，并且可促進干擾素-γ的表達量增加[17]。Dallo等[18]對肺炎支原體(M.pneumoniae)EF-Tu進行克隆，并在大腸桿菌中表達。通過His-tag親和柱層析純化后免疫動物，能刺激動物機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。全細胞放射性免疫沉淀試驗顯示，重組EF-Tu蛋白能夠抑制支原體對纖連蛋白的黏附作用，證實EF-Tu蛋白是M.pneumoniae表面毒力因子。Pinto等[19]通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體7 447株的EF-Tu也具有免疫原性。許健等[20]利用雙向電泳及免疫印跡的方法對MO MoGH3-3株抗原蛋白進行篩選，篩選到EF-Tu抗原。延伸因子P(EF-P)是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白翻譯因子，主要參與富含脯氨酸密碼子的mRNA的翻譯，是細菌中富含脯氨酸蛋白生物合成必不可少的翻譯因子。研究發(fā)現(xiàn)，富含脯氨酸的蛋白質(zhì)不僅對細菌的生長極為重要，而且與致病菌(沙門氏菌或腸出血性大腸桿菌)的適應(yīng)性和毒力密切相關(guān)。缺乏EF-P的腸道細菌適應(yīng)性減弱，毒力也明顯降低。然而，到目前為止對于EF-P的確切功能仍不是很清楚。Doerfel等[21]研究發(fā)現(xiàn)EF-P可作為新一代抗生素(antibiotic)一個有潛力的新靶點，用藥物阻斷EF-P可以削弱致病細菌的適應(yīng)性，對抗耐藥病原體引起的感染。本研究利用DNAStar、在線軟件ABCpred及BepiPred 1.0 Server對EF-P蛋白抗原表位進行預(yù)測，截取優(yōu)勢抗原表位集中區(qū)第120～208 位氨基酸處的片段，對其進行克隆、表達及免疫原性分析。 EF-P優(yōu)勢抗原表位集中區(qū)片段長度為264 bp，編碼88個氨基酸，在該段氨基酸序列中有N-?；稽c、蛋白激酶磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和延伸因子Tu GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域各1個。SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果證實，EF-P重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性；小鼠免疫試驗證實，該重組蛋白能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，證實EF-P蛋白具有較強的免疫原性。本研究為MO血清學(xué)診斷及新型疫苗研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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CorrespondingauthorQIAO Jun, male, Ph.D, professor.Research area: pathogenic molecular biology.E-mail: qj710625@163.com

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

CloningandExpressionofEF-PGeneofMycoplasmaovipneumoniaeandImmunogenicityofRecombinantProtein

TIAN Lulu1, MENG Qingling1,QIAO Jun1, YU Weiwei1, MENG Dan1, LI Chongyang1,CAI Xuepeng2and CHEN Chuangfu1

(1.College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003, China; 2.Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China)

In order to screen the related immune proteins ofMycoplasmaovipneumoniae(MO),EF-Pgene ofMycoplasmaovipneumoniae(MO) isolated from sheep was amplified by PCR and it’s molecular characteristics was analyzed after was sequenced in this study.It’s epitope clustering region was screened, cloned and expressed in prokaryotic cells.and then geneEF-Pwas amplified by PCR.It was synthesized and subcloned to pET-32a (+) to generate pET-32a(+)-EF-P.Then the pET-32a(+)-EF-Pwas transformed into competent cells ofE.coliBL21 (DE3) for expression after induced by IPTG.and it’s reactogenicity and were analyzed.SDS-PAGE showed that the molecular mass of recombinant protein was 29.5 ku.Western blot analysis showed that the recombinant protein was specifically recognized by the MO positive serum, and it had good reactogenicity.The immunization tests in mice showed that the recombinant protein could induce anti-serum antibody with the IHA titer of 1∶64, which confirmed that the recombinant protein had a strong immunogenicity.

Mycoplasmaovipneumoniae;EF-P;Cloning;Prokaryotic expression;Immunogenicity

2016-09-03

2016-09-30

China International Cooperation Program of Science and Technology (No.2014DFR31310); the Program of Youth Leading Talents in Science and Technology Innovation of Xinjiang Production and Construction Corps(No.2016BC001).

TIAN Lulu, female, master student.Research area: pathogenic molecular biology.E-mail:928929323@qq.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.006.html

2016-09-03

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國家國際科技合作專項(No.2014DFR31310)；兵團中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計劃(2016BC001)。

田路路，女，碩士研究生，研究方向為病原分子生物學(xué)。E-mail: 928929323@qq.com

喬 軍，男，博士，教授，主要從事畜禽病原分子生物學(xué)研究。E-mail: qj710625@163.com

S858.26

A

1004-1389(2017)11-1577-07