羅 歡, 賈國(guó)庚, 范小燕, 劉海峰, 裴東方, 鄧建新, 周 燚

(長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 荊州 434025)

一種波斯菊葉枯病新病原菌的分離與鑒定

羅 歡, 賈國(guó)庚, 范小燕, 劉海峰, 裴東方, 鄧建新*, 周 燚*

(長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 荊州 434025)

波斯菊是一種重要的觀賞植物,葉枯病的發(fā)生影響其生長(zhǎng)及市場(chǎng)價(jià)值。本文從陜西楊凌地區(qū)采集波斯菊病葉，通過保濕培養(yǎng)、單孢分離方法獲得2株分離物。將分離菌的純培養(yǎng)物接種健康寄主植物，發(fā)病后再分離的分離物與原接種病原菌菌株特征相同。采用形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS、EF-1α和GAPDH基因序列分析相結(jié)合的方法對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，兩株菌株均為侵染向日葵鏈格孢Alternariahelianthiinficiens。這是國(guó)內(nèi)外波斯菊上A.helianthiinficiens的首次報(bào)道。

侵染向日葵鏈格孢; 波斯菊; 葉枯病; 形態(tài)學(xué); 多基因序列

波斯菊Cosmosbipinnatus,一年生菊科秋英屬觀賞植物,原產(chǎn)于墨西哥和南美洲。因其花美葉茂、易栽培,被廣泛應(yīng)用于公園及道路等基礎(chǔ)栽植區(qū),環(huán)境效益優(yōu)良[1]。波斯菊醫(yī)藥潛能巨大,既可作為傳統(tǒng)中藥材,治療黃疸、間歇熱、脾腫大等疾病,還可作為抗氧化劑,用于DNA氧化損傷治療[2]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌[3]、植原體[4]、真菌[5-8]均可侵染波斯菊。

本文通過對(duì)波斯菊葉枯病病葉進(jìn)行保濕培養(yǎng),采用單孢分離法分離獲得病原菌,依據(jù)柯赫氏法則驗(yàn)證其致病性,最后通過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行種類鑒定,為波斯菊葉枯病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

2016年于陜西省西安市楊凌植物園采集波斯菊病葉,切取病健交界處,保濕培養(yǎng)后用無菌玻璃針進(jìn)行單孢分離,將獲得的純培養(yǎng)物保存于PDA斜面及15%甘油中。

1.2 致病性測(cè)定

將分離物的菌絲轉(zhuǎn)接于V8培養(yǎng)基上,在22℃恒溫條件下,每天光照8 h,培養(yǎng)7 d后,用無菌水洗脫分生孢子,過濾后離心,再用滅菌水將濾液配制成孢子懸浮液(105個(gè)/mL)。用無菌毛筆蘸取配制好的孢子懸浮液刷在健康的波斯菊葉片上,以無菌水作對(duì)照,室溫培養(yǎng)于無菌保濕裝置中,觀察并記錄發(fā)病情況。利用相同的方法對(duì)發(fā)病葉片中的病原菌進(jìn)行再分離,并與原分離物進(jìn)行對(duì)比,驗(yàn)證柯赫氏法則。重復(fù)3次。

1.3 病原菌鑒定

選取分離的病原菌菌株YZU 161169及YZU 161170進(jìn)行形態(tài)學(xué)與基因序列分析鑒定。

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài): 供試菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d后用直徑6 mm的無菌打孔器切取菌落邊緣的菌絲塊,轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的90 mm培養(yǎng)皿中央,25℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d,觀察菌落形態(tài)、分泌物顏色等,并測(cè)量菌落直徑。

孢子形態(tài): 挑取少量待試菌株菌絲轉(zhuǎn)接于PCA(馬鈴薯20 g、胡蘿卜20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL)培養(yǎng)基上,在22℃恒溫條件下,每天8 h光照,培養(yǎng)7 d后,觀察并記錄其分生孢子產(chǎn)孢方式、分生孢子與分生孢子梗的形態(tài)、顏色等,并隨機(jī)測(cè)量50個(gè)成熟分生孢子的大小。

1.3.2 多基因位點(diǎn)序列分析

將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d,刮取適量菌絲用液氮研磨后采取改良CTAB法提取DNA。PCR擴(kuò)增和測(cè)序所用引物為ITS5和ITS4[9]、gpd1和gpd2[9]、EF446F和EF1473r[10],均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。用體積為40 μL的2×Taq預(yù)混反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Genstar,北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)。獲得的PCR產(chǎn)物在含核酸染料(GoldenView,北京博邁德基因技術(shù)有限公司)的1%瓊脂凝膠上電泳后,在凝膠成像系統(tǒng)下成像,擴(kuò)增產(chǎn)物由北京六合華大基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化,并利用正反引物測(cè)序。對(duì)獲得的正反兩個(gè)序列進(jìn)行校正后,將完整的序列利用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)分析,再利用Mega 7.0.26軟件,將本研究序列與其他比對(duì)序列的3個(gè)基因序列拼接合并,最后利用RaxML軟件構(gòu)建ML(maximum likelihood)系統(tǒng)發(fā)育樹,以自展法(bootstrap)進(jìn)行檢測(cè),1 000次循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 波斯菊葉枯病危害癥狀及致病性測(cè)定

波斯菊葉枯病6月初開始發(fā)病,受高溫和多濕氣候影響,7月中旬為發(fā)病高峰期。發(fā)病初期,病葉多見于植物中下部,受侵染葉片的葉尖部出現(xiàn)褐色壞死,靠近壞死部的葉組織常伴有褪綠現(xiàn)象(圖1a),條件適宜時(shí)病害發(fā)展迅速,后期整個(gè)葉片黃萎枯死(圖1b)。根據(jù)體視顯微鏡下觀察到的分生孢子形態(tài)特征將所獲得菌株初步判斷為鏈格孢屬真菌。將分離菌株的分生孢子接種于健康波斯菊葉片,接種24 h后葉片出現(xiàn)水漬狀褐色斑點(diǎn),2 d后接種葉片有明顯壞死癥狀,3 d后整個(gè)葉尖大面積枯死(圖1c),對(duì)照組未見發(fā)病癥狀。從接種后發(fā)病葉片上再分離的分離物與原接種病原菌菌株特征相同,表明所分離的鏈格孢是引起波斯菊葉枯病的病原菌。

圖1 波斯菊葉枯病癥狀Fig.1 Leaf blight symptom and pathogenicity tests on Cosmos bipinnatus

2.2 病原菌形態(tài)特征

選取的兩株病原菌YZU 161169及YZU 161170的菌落形態(tài)及孢子形態(tài)一致。在PDA培養(yǎng)基上,25℃黑暗培養(yǎng)7 d后的菌落圓形,黃灰色,中央氣生菌絲顏色稍淺、絮狀,邊緣呈絨毛狀(圖2a)。菌落背面中央淺棕色,有黃色色素產(chǎn)生、邊緣呈淡黃色(圖2b)。菌落大小為45～49 mm。

圖2 波斯菊病原菌在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of the pathogen from Cosmos bipinnatus on PDA plate at 25℃ for 7 days

分離物在PCA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢表型如圖3a所示,分生孢子單生或產(chǎn)生2個(gè)分生孢子的短鏈。分生孢子梗單生,直立或彎曲,黃褐色,具隔膜2～8個(gè),大小為(54～130)μm×(4.8～6.5)μm。分生孢子倒棒狀、長(zhǎng)橢圓形或卵形,淺棕色至黃褐色,孢身具3～8個(gè)橫隔膜,橫隔膜間常有1～2個(gè)縱隔膜或斜隔膜,大小為(45～90)μm×(16～23.5)μm,無喙或有喙。喙圓柱狀或絲狀,常有1～3個(gè)隔膜,大小為(67～197)μm×(2.5～5.5)μm(圖3b)。

通過形態(tài)學(xué)比較分析,發(fā)現(xiàn)菌株YZU 161169及YZU 161170的形態(tài)學(xué)特征與Alternariahelianthiinficiens一致[11],形態(tài)學(xué)研究表明該病原菌為A.helianthiinficiens。

圖3 波斯菊病原菌在PCA培養(yǎng)基上22℃下培養(yǎng)7 d的孢子形態(tài)Fig.3 Conidial morphology of the pathogen from Cosmos bipinnatus on PCA plate at 22℃ for 7 days

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

將分離菌株YZU 161169和YZU 161170的rDNA-ITS、GAPDH、EF-1α基因序列利用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)各序列與Alternariahelianthiinficiens的相似度均為100%,測(cè)序結(jié)果提交至GenBank獲得的登錄號(hào)見表1。將兩株病原菌與其相近種的3個(gè)基因序列合并分析(共1197 bp),構(gòu)建ML(maximum likelihood)系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示該病原菌與Alternariahelianthiinficiens聚為一簇,bootstrap支持率為100%(圖4)。表明波斯菊葉枯病的病原菌為A.helianthiinficiens。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)波斯菊葉枯病病原菌進(jìn)行了單孢分離、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)鑒定,以及rDNA-ITS、GAPDH、EF-1α基因序列分析,研究表明: 陜西楊凌波斯菊葉枯病的病原菌為鏈格孢屬的Alternariahelianthiinficiens。Simmons[11]以Roberts從向日葵種子上分離的病原菌為模式菌株建立此種。Vrandecic等[12]首次報(bào)道其引起克羅地亞地區(qū)向日葵葉枯病及莖枯病,發(fā)病率10%～50%。孫霞[13]在我國(guó)新疆及云南兩地的向日葵上首次報(bào)道此菌,并通過形態(tài)學(xué)鑒定確定其為侵染向日葵鏈格孢A.helianthiinficiens,并指出該種寄生性較強(qiáng)。本研究通過致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),如果條件適宜,供試菌株可快速侵染波斯菊致其嚴(yán)重發(fā)病。此外,將供試菌株的菌絲塊和孢子液接種離體向日葵、苦苣菜及飛蓬葉片,均可侵染導(dǎo)致發(fā)病。

表1參考菌株的編號(hào)、寄主、地理分布及GenBank登錄號(hào)

Table1SpeciesandtheirGenBankaccessionnumbersusedinthephylogenetictree

種Species菌株編號(hào)Strain寄主Host來源CountryGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionnumberITSGAPDHEF?1α鏈格孢A．a(chǎn)lternataCBS916．96落花生Arachishypogaea印度IndiaAF347031AY278808KC584634假格鏈格孢A．a(chǎn)lternantheraeCBS124392茄Solanummelongena中國(guó)ChinaKC584179KC584096KC584633蕓薹生鏈格孢A．brassicicolaATCC96836甘藍(lán)Brassicaoleracea美國(guó)USAJX499031KC584103KC584642蕓薹鏈格孢A．brassicaeCBS116528甘藍(lán)Brassicaoleracea美國(guó)USAKC584185KC584102KC584641A．carotiincultaeCBS109381胡蘿卜Daucuscarota美國(guó)USAKC584188KC584106KC584645雪葉蓮鏈格孢A．cinerariaeCBS116495橐吾Ligulariasp．美國(guó)USAKC584190KC584109KC584648侵染向日葵鏈格孢A．helianthiinficiensCBS117370向日葵Helianthusannuus英國(guó)UKKC584200KC584119KC584661CBS208．86向日葵Helianthusannuus美國(guó)USANR077213KC584120EU130548YZU161169波斯菊Cosmosbipinnatus中國(guó)ChinaMF414165MF414167MF414169YZU161170波斯菊Cosmosbipinnatus中國(guó)ChinaMF414166MF414168MF414170日本鏈格孢A．japonicaCBS118390青菜Brassicachinensis美國(guó)USAKC584201KC584121KC584663蔥鏈格孢A．porriEGS48．147洋蔥Alliumcepa美國(guó)USADQ323700KC584132KC584679苦苣菜鏈格孢A．sonchiCBS119675花葉滇苦菜Sonchusasper加拿大CanadaKC584220KC584142KC584691

圖4 基于rDNA-ITS、GAPDH、EF-1α基因序列用ML方法構(gòu)建的菌株YZU 161169及YZU 161170系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the pathogenic strains YZU 161169 and YZU 161170 based on rDNA-ITS, GAPDH, EF-1α gene sequences

波斯菊是優(yōu)良的園林綠化材料,其種植面積不斷擴(kuò)大,而病害的發(fā)生極大地影響了其觀賞價(jià)值。目前,國(guó)外已報(bào)道Alternariacosmosa[5],Cercosporafagopyri[6],Colletotrichumacutatum[7]和Diaporthestewartii[8]等病原真菌可侵染波斯菊引起病害,其中同為鏈格孢屬的真菌A.cosmosa引起波斯菊葉枯病在癥狀上與A.helianthiinficiens并無明顯差異。本研究首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了波斯菊為Alternariahelianthiinficiens新寄主,為該菌引起的波斯菊葉枯病的防治提供了可靠依據(jù)。

[1] Kiger R W.CosmosCavanilles [M]∥ Flora of North America Editorial Committee. Flora of North America North of Mexico. Volume 21: Magnoliophyta: Asteridae, part 8: Asteraceae, part 3. New York-Oxford: Oxford University Press, 2006: 203-205.

[2] Jang I C, Park J H, Park E, et al. Antioxidative and antigenotoxic activity of extracts from cosmos (Cosmosbipinnatus) flowers[J].Plant Foods for Human Nutrition,2008,63:205-210.

[3] Yugo K, Osamu N, Takamichi N, et al. First report of bacterial leaf blight on cosmos (CosmosbipinnatusCav.) caused byPseudomonascichoriiin Japan[J]. Journal of General Plant Pahtology, 2014, 80: 499-503.

[4] Sawayanagi T, Jung H Y, Komatsu K, et al. Phytoplasma detected from yellow cosmos (Cosmossulphureus) showing yellows symptoms (abstract in Japanese)[J]. Japanese Journal Phytopathology, 2002, 68: 258.

[5] Deng Jianxin, Lee J H, Paul N C, et al. Occurrence of leaf blight on cosmos caused byAlternariacosmosain Korea[J]. Plant Pathology Journal, 2015, 31(1): 78-82.

[6] Groenewald J Z, Nakashima C, Nishikawa J, et al. Species concepts inCercospora: spotting the weeds among the roses[J]. Studies in Mycology, 2013, 75: 115-170.

[7] Kwon J H, Kang S W, Son K E, et al. Anthracnose of cosmos caused byColletotrichumacutatumin Korea [J]. Plant Pathology Journal, 1999, 15: 172-174.

[8] Udayanga D, Liu Xingzhong, Crous P W, et al. A multi-locus phylogenetic evaluation ofDiaporthe(Phomopsis)[J]. Fungal Diversity, 2012, 56(1): 157-171.

[9] 李河, 周國(guó)英, 徐建平. 一種新油茶炭疽病原多基因序列鑒定[J].植物保護(hù),2015, 41(2): 92-96.

[10] 宋博, 徐兵強(qiáng), 朱曉鋒, 等. 南疆紅棗黑斑病病原鑒定及其保守基因序列分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2017, 47(3): 411-415.

[11] Simmons E G.Alternaria: an identification manual [M]. CBS Fungal Biodiversity Centre Utrecht Press (Netherlands),2007.

[13] 孫霞. 鏈格孢屬真菌現(xiàn)代分類方法研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

(責(zé)任編輯： 楊明麗)

IsolationandidentificationofanewpathogencausingleafblightonCosmosbipinnatus

Luo Huan, Jia Guogeng, Fan Xiaoyan, Liu Haifeng, Pei Dongfang, Deng Jianxin, Zhou Yi

(CollegeofAgriculture,YangtzeUniversity,Jingzhou434025,China)

Cosmosbipinnatusis an important ornamental plant. The leaf blight disease can affect plant growth and market value. In this study, the causal agent was obtained from diseased leaves by single spore isolation and its pathogenicity was tested to fulfill the Koch’s rule. Based on the morphological characteristics and phylogenetic analysis of a combined gene sequence dataset (rDNA-ITS, EF-1α and GAPDH), the pathogen was identified asAlternariahelianthiinficiens. It’s the first report of leaf blight disease onC.bipinnatuscaused byA.helianthiinficiensin the world.

Alternariahelianthiinficiens;Cosmosbipinnatus; leaf blight; morphology; sequence analysis

2017-06-28

2017-07-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(31400014)；長(zhǎng)江大學(xué)青年人才基金(2016cqr08)

* 通信作者 E-mail: djxin555@hotmail.com;zhouyi@yangtzeu.edu.cn

S 436.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.032