許有嬪, 廖海澄, 陳金華, 羅 櫞, 宿 加, 鄒成東,李偉滔, 王 靜, 馬炳田, 賀 閩, 陳學(xué)偉

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所, 四川省教育廳作物重大病害實(shí)驗(yàn)室, 雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,雜交水稻長江流域協(xié)同創(chuàng)新中心, 成都 611130)

利用綠色熒光蛋白GFP研究稻瘟病菌與水稻的互作

許有嬪, 廖海澄, 陳金華, 羅 櫞, 宿 加, 鄒成東,李偉滔, 王 靜, 馬炳田, 賀 閩*, 陳學(xué)偉

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所, 四川省教育廳作物重大病害實(shí)驗(yàn)室, 雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,雜交水稻長江流域協(xié)同創(chuàng)新中心, 成都 611130)

稻瘟病菌Magnaportheoryzae嚴(yán)重威脅水稻的產(chǎn)量與質(zhì)量,明確稻瘟病菌與水稻互作過程及機(jī)理,對(duì)防治稻瘟病具有重要意義。本研究利用稻瘟病菌常用致病菌株GUY11和ZB25,構(gòu)建了綠色熒光蛋白GFP的過量表達(dá)菌株,并通過熒光顯微觀察菌株侵染寄主水稻過程中侵染結(jié)構(gòu)的形成與發(fā)育,包括孢子萌發(fā)、附著胞形成、侵染釘形成、侵染菌絲增殖、壞死斑形成及產(chǎn)孢。另外,通過比較過量表達(dá)菌株對(duì)稻瘟病高抗水稻和易感水稻的侵染過程,發(fā)現(xiàn)侵染過程的差異主要集中于侵染釘?shù)拇┩负颓秩揪z的定殖。本研究為分析稻瘟病菌對(duì)寄主水稻的定殖規(guī)律提供了一種有效工具。

稻瘟病菌; 綠色熒光蛋白; 侵染過程; 水稻

水稻是我國主要糧食作物之一,保障水稻生產(chǎn)安全對(duì)我國國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展至關(guān)重要[1]。稻瘟病菌Magnaportheoryzae作為水稻主要病原菌之一,嚴(yán)重威脅水稻的產(chǎn)量與質(zhì)量[2]。培育及種植水稻抗病品種是防治稻瘟病主要措施,但稻瘟病菌生理小種多、繁殖變異快、流行性強(qiáng),在自然條件下長期種植單一抗性品種易導(dǎo)致新的致病生理小種的累積及流行[3]。稻瘟病菌屬于半活體寄生菌,它在水稻組織內(nèi)生長繁殖力與其致病性密切相關(guān),實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)稻瘟病菌在寄主水稻組織內(nèi)動(dòng)態(tài)生長情況,將有助于揭示稻瘟病菌與水稻之間互作過程,對(duì)分析稻瘟病菌致病流行性具有重要意義。

稻瘟病菌是絲狀真菌分子生物學(xué)和致病機(jī)理研究的模式菌,其侵染寄主水稻過程主要包括接觸、侵入、擴(kuò)展等階段[4-8]。當(dāng)前關(guān)于稻瘟病菌侵染過程的研究主要使用水稻易感材料,而對(duì)于以提高抗病性為目標(biāo)的水稻抗病育種而言,急需明確稻瘟病菌與抗病品種之間的互作關(guān)系。研究病原菌與植物互作的傳統(tǒng)方法有組織印跡法、GUS染色法和放射性標(biāo)記核酸探針法等,這些非活體檢測(cè)相比于活體觀察手段均具有一定局限性[9-13]。來源于水母Aequoreavictoria的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定、觀察方便、對(duì)細(xì)胞無毒害、無物種特異性以及無需底物等優(yōu)點(diǎn)[13],可用于直觀、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病原菌發(fā)生、定殖和侵染過程,目前已成為生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的重要分子標(biāo)記之一[14]。

本研究構(gòu)建過量表達(dá)GFP的ZB25和Guy11轉(zhuǎn)基因菌株,將過量表達(dá)菌株接種水稻葉片或葉鞘后,觀察稻瘟病菌在寄主水稻上侵染器官的發(fā)育、侵染菌絲增殖和產(chǎn)孢過程,并比較GFP過量表達(dá)菌株在水稻抗感材料上侵染過程的異同。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試劑

稻瘟病菌生理小種Guy11和ZB25、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α菌株、水稻品種‘CO39’、‘地谷’(Digu)、‘麗江新團(tuán)黑谷’(LTH)均由本實(shí)驗(yàn)室保存,稻瘟病菌的培養(yǎng)、保存及基因組提取參照常規(guī)方法[15]。載體TSC13-GFP[16]、pEASY-Blunt-BAR由實(shí)驗(yàn)室保存。pEASY-Blunt載體購于全式金公司(貨號(hào)K41009);Taq酶、KOD-Plus-高保真酶購于TOYOBO公司;限制性內(nèi)切酶購于Fermentas公司;QuantiNova SYBR Green PCR Kit 購于QIAGEN(貨號(hào)208054);草銨膦購于Sigma公司(貨號(hào)45520);無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit購于康為世紀(jì)生物科技有限公司(貨號(hào)CW2104M)。

1.2.1 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR載體的構(gòu)建

以Guy11基因組為模板,用引物對(duì)RP27pro-For/RP27pro-Rev擴(kuò)增得到RP27基因啟動(dòng)子片段,同時(shí)使用引物對(duì)GFP-RP27-For/GFP-ELO-Rev-SacI,從載體TSC13-GFP中擴(kuò)增GFP片段,使用引物對(duì)RP27pro-For/GFP-ELO-Rev-SacI將兩個(gè)片段融合成RP27pro-GFP片段后,克隆至pEASY-Blunt載體,經(jīng)SacI酶切后,切膠回收2 kb的DNA片段,最后將其連接至真菌篩選載體pEASY-Blunt-BAR的SacI位點(diǎn),形成終載體pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR,驗(yàn)證正確后,提取pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR質(zhì)粒備用。PCR引物序列見表1。

表1本研究所用的引物

Table1Primersusedinthisstudy

引物名稱Primer序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)擴(kuò)增片段AmpliconRP27pro?ForRP27pro?RevCGAGCTCATAAATGTAGGTATTACCTTTGAAGATTGGGTTCCTACGRP27proGFP?RP27?ForGFP?ELO?Rev?SacICGTAGGAACCCAATCTTCAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGCGAGCTCGTGGAGATGTGGAGTGGGCGCGFPOsUBI＿FOsUBI＿RTTCTGGTCCTTCCACTTTCAGACGATTGATTTAACCAGTCCATGAUbiquitinMoPot2＿FMoPot2＿RACGACCCGTCTTTACTTATTTGGAAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGATMoPot2

1.2.2 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

參照Talbot[17]所述方法進(jìn)行稻瘟病菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,并使用草銨膦進(jìn)行重組菌株的篩選。

1.2.3 過量表達(dá)菌株的致病性檢測(cè)

采用葉片點(diǎn)滴接種方法檢測(cè)稻瘟病菌致病性。制備過量表達(dá)菌株的孢子懸浮液,接種于生長4周的易感水稻品種‘CO39’葉片,以接種無菌水的葉片作為陰性對(duì)照,置于25℃暗培養(yǎng)1 d后光照培養(yǎng),5 d后觀察發(fā)病情況。

1.2.4 過量表達(dá)菌株的熒光顯微鏡觀察

通過河長制管理，全市河道水環(huán)境面貌得到較大改觀，各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)重視程度得到明顯提高，公眾保護(hù)水環(huán)境的意識(shí)得到大幅度增強(qiáng)，河道水環(huán)境面貌得到明顯改善。2013年，全市納管河道環(huán)境衛(wèi)生達(dá)到優(yōu)秀的河道長度由1 338.5km增加到1 616.2km，同比上升20.75%；感官水質(zhì)黑臭的河道長度由332.68km減少到275.92km，同比下降17.06%。全市河道劣V類水質(zhì)的比例由85%下降到62%，全市河道水質(zhì)總體實(shí)現(xiàn)好轉(zhuǎn)。

制備過量表達(dá)菌株孢子懸浮液,參照文獻(xiàn)報(bào)道方法[18]接種水稻葉片或葉鞘,通過熒光顯微鏡觀察稻瘟病菌侵染過程。

1.2.5 水稻組織內(nèi)稻瘟病菌生長量的定量PCR檢測(cè)

采用文獻(xiàn)報(bào)道方法定量檢測(cè)侵染水稻葉片中的稻瘟病菌生物量[19],對(duì)侵染之后的水稻葉片,用CTAB法提取基因組DNA,再以稻瘟病菌的一段倒位重復(fù)序列MoPot2為擴(kuò)增靶標(biāo)、水稻基因Ubiquitin作為均一化內(nèi)參基因,進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR融合表達(dá)載體的構(gòu)建

稻瘟病菌核糖體蛋白27(ribosomal protein 27)的編碼基因RP27具有組成型高表達(dá)特點(diǎn)[18]。本研究利用該基因啟動(dòng)子來調(diào)控綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)。參照材料與方法中所述方法構(gòu)建并獲得了稻瘟病菌GFP過量表達(dá)載體pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR(圖1)。載體圖譜詳見圖2。

圖1 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR載體構(gòu)建Fig.1 Construction of the vector pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR

圖2 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR載體圖譜Fig.2 Restriction map of vector pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR

2.2 GFP過量表達(dá)菌株的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選

Guy11為國際通用的稻瘟病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株,它具有較強(qiáng)致病性,廣泛用于稻瘟病菌致病機(jī)理研究[20],而ZB25是根據(jù)我國7個(gè)常規(guī)水稻稻瘟病鑒定品種而鑒別出的一個(gè)強(qiáng)致病性菌株[21]。本文以這兩個(gè)菌株為材料構(gòu)建了表達(dá)pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR載體的重組菌株。對(duì)轉(zhuǎn)化獲得的過量表達(dá)菌株Guy11-GFPox、ZB25-GFPox進(jìn)行熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)菌絲(圖3a)及孢子細(xì)胞(圖3b)中均能觀察到較強(qiáng)綠色熒光,說明GFP過量表達(dá)元件已在稻瘟病菌中穩(wěn)定整合并表達(dá)。

2.3 過量表達(dá)菌株的生長及致病力檢測(cè)

為分析GFP基因的轉(zhuǎn)入是否影響稻瘟病菌營養(yǎng)生長及產(chǎn)孢,將野生型菌株和過量表達(dá)菌株接種于CM培養(yǎng)基,培養(yǎng)10 d后測(cè)量菌落直徑及產(chǎn)孢量,發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)菌株具有與野生型菌株一致的營養(yǎng)生長及產(chǎn)孢量(圖4),這表明GFP基因的轉(zhuǎn)入不影響稻瘟病菌的生長及產(chǎn)孢。

圖3 GFP過量表達(dá)菌株的熒光分析Fig.3 Epifluorescent analysis of the Magnaporthe oryzae transformants overexpressing GFP

圖4 GFP過表達(dá)菌株在CM瓊脂平板上的菌絲生長及產(chǎn)孢Fig.4 Mycelial growth and sporulation of the transformants overexpressing GFP on CM media

菌株致病性分析結(jié)果表明,過量表達(dá)菌株及野生型菌株在葉片上產(chǎn)生的病斑大小之間無差異(圖5a)。此外,定量PCR檢測(cè)感病葉片中真菌生長量,發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)菌株與野生型菌株在葉片中的定殖與侵染能力無差異(圖5b，c)。上述結(jié)果表明GFP基因的轉(zhuǎn)入不影響稻瘟病菌致病力。

圖5 稻瘟病菌的致病力分析Fig.5 Pathogenicity of Magnaporthe oryzae

2.4 過量表達(dá)菌株侵染生活史的熒光顯微觀察

為分析稻瘟病菌侵染水稻過程,將易感水稻‘CO39’葉片接種過量表達(dá)菌株并進(jìn)行熒光顯微觀察。結(jié)果表明,侵染0 h時(shí),過量表達(dá)菌株Guy11-GFPox與ZB25-GFPox的分生孢子可黏附于水稻葉片;侵染3 h后,這兩個(gè)過量表達(dá)菌株分生孢子均可萌發(fā)出芽管;隨著時(shí)間推移,芽管不斷延伸,并在芽管頂端膨大,分化形成侵染器官附著胞;15 h時(shí),附著胞分化成熟,形成了黑色素(圖6)。此外,葉片侵染6 d后,在離侵染點(diǎn)較遠(yuǎn)的葉片內(nèi)未出現(xiàn)侵染菌絲,而在葉脈內(nèi)已出現(xiàn)許多侵染菌絲(圖7),這表明稻瘟病菌在水稻葉片中定殖時(shí)可能優(yōu)先沿葉脈擴(kuò)展;還發(fā)現(xiàn)葉片上侵染位點(diǎn)附近的部位極易形成水浸狀斑點(diǎn),并且該斑點(diǎn)在侵染菌絲還沒擴(kuò)展到的地方就已形成(圖7)。

圖6 熒光顯微觀察稻瘟病菌侵染水稻葉片的過程Fig.6 Epifluorescent microscopy examination of the life cycle of Magnaporthe oryzae invading rice leaves

圖7 GFP過量表達(dá)菌株侵染水稻葉片后的病斑觀察Fig.7 Rice leaves infected with the GFP overexpressing strain

為進(jìn)一步分析稻瘟病菌在水稻組織內(nèi)的生長定殖情況,本研究采用透明的水稻葉鞘作為侵染材料,來觀察侵染釘及侵染菌絲在水稻組織中的生長。熒光顯微觀察表明,侵染24 h之內(nèi),稻瘟病菌在葉鞘與葉片上的孢子萌發(fā)和附著胞形成過程相一致;侵染24 h之后,葉鞘內(nèi)可見附著胞已分化形成侵染釘,并且侵染釘在植物細(xì)胞內(nèi)形成多重分支的次生侵染菌絲;侵染48 h后侵染菌絲大量擴(kuò)增,已占據(jù)多個(gè)植物細(xì)胞(圖8)。葉片侵染5～6 d后形成壞死斑,并在病斑處產(chǎn)生分生孢子梗及侵染單元分生孢子(圖6)。因此,GFP過量表達(dá)菌株可用于熒光觀察稻瘟病菌侵染循環(huán)各個(gè)階段的發(fā)育結(jié)構(gòu),包括分生孢子附著于寄主表面(圖9a)、分生孢子萌發(fā)及附著胞的產(chǎn)生(圖9b)、侵染釘?shù)男纬?圖9c)、侵染菌絲的產(chǎn)生(圖9d)、葉片病斑形成(圖9e)及病斑處產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)(圖9f)。

圖8 熒光分析水稻葉鞘中稻瘟病菌的附著胞和侵染菌絲的發(fā)育Fig.8 Epifluorescent analysis of the development of appressorium and infectious hyphae of Magnaporthe oryzae in rice sheathes

圖9 稻瘟病菌侵染循環(huán)Fig.9 Infection cycle of Magnaporthe oryzae

2.5 過量表達(dá)菌株對(duì)感病和抗病水稻品種的侵染過程觀察

目前已有大量報(bào)道闡述稻瘟病菌對(duì)親和性易感水稻的侵染過程[4, 7, 22],但有關(guān)稻瘟病菌與非親和性高抗水稻之間的互作過程還不是十分清楚。為分析稻瘟病菌在親和與非親和水稻品種侵染過程之間的差異,我們以易感水稻品種‘麗江新團(tuán)黑谷’(LTH)和高抗水稻品種‘地谷’(Digu)為材料,比較了過量表達(dá)菌株Guy11-GFPox對(duì)兩者的侵染過程。結(jié)果表明,侵染5 h時(shí),兩個(gè)水稻品種上均可觀察到分生孢子萌發(fā)形成附著胞(圖10);16 h時(shí),兩種水稻葉片及葉鞘上的附著胞均可分化成熟并黑色素化(圖10)。這表明稻瘟病菌侵染易感和高抗水稻品種時(shí),在穿透植物表皮之前的發(fā)育過程沒有明顯差異。

圖10 GFP過量表達(dá)菌株對(duì)感病和抗病水稻材料的侵染過程觀察Fig.10 Infection processes of GFP overexpression strain in susceptible and resistant rice

侵染葉鞘至24 h時(shí),易感水稻‘麗江新團(tuán)黑谷’葉鞘中大部分附著胞產(chǎn)生侵染釘,刺破水稻表皮而使侵染菌絲進(jìn)入植物內(nèi)部組織細(xì)胞,但在高抗水稻‘地谷’葉鞘中,只有極少數(shù)附著胞可形成侵染釘;36 h時(shí),易感水稻中侵染菌絲已占滿初次侵染的植物細(xì)胞,并侵入臨近植物細(xì)胞,而在高抗水稻中僅見極短的侵染菌絲,而且侵染菌絲不能在高抗水稻細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增(圖10a)。上述結(jié)果表明,稻瘟病菌對(duì)易感和高抗水稻侵染過程的差異主要集中于侵染釘?shù)拇┩负颓秩揪z的增殖。

3 討論

建立對(duì)稻瘟病菌生理小種的快速準(zhǔn)確示蹤方法,了解稻瘟病菌侵染過程及規(guī)律,將有利于水稻抗病品種的篩選和抗病性監(jiān)測(cè)[23]。GFP具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定、觀察方便、無毒害等優(yōu)點(diǎn),將其作為報(bào)告基因,應(yīng)用十分廣泛。本研究構(gòu)建了過量表達(dá)GFP的稻瘟病菌重組菌株,并利用過量表達(dá)菌株觀察了稻瘟病菌對(duì)水稻的動(dòng)態(tài)侵染過程,發(fā)現(xiàn)侵染水稻時(shí),稻瘟病菌經(jīng)歷孢子附著、萌發(fā)、分化附著胞、形成侵染釘及侵染菌絲、分化產(chǎn)生分生孢子梗和孢子(圖6～9),這一侵染過程與前人報(bào)道的稻瘟病菌在水稻組織中的黏附[24]、萌發(fā)、穿透[25]、定殖[26]過程相一致。本研究豐富了GFP標(biāo)記在稻瘟病菌研究中的應(yīng)用,為進(jìn)一步分析稻瘟病菌在水稻中定殖、擴(kuò)展規(guī)律,揭示稻瘟病菌的生物學(xué)特性與病害發(fā)生之間的關(guān)系提供了一種有效的示蹤手段。

本研究發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌侵染水稻表皮早期發(fā)育過程,包括分生孢子萌發(fā)、芽管形成、附著胞發(fā)育及成熟,在水稻抗感材料上沒有明顯差異。但在穿透及定殖植物表皮階段,稻瘟病菌可穿透易感水稻表皮并大量增殖,但對(duì)高抗水稻的穿透增殖能力卻顯著受到抑制(圖10)。這表明,抗病品種對(duì)稻瘟病菌的防衛(wèi)反應(yīng)主要針對(duì)附著胞穿透和侵染菌絲定殖生長,這與Li等[27]的研究中提到抗病水稻可識(shí)別早期的附著胞發(fā)育,并啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)的論述一致?？共〔牧现泻邢鄳?yīng)抗性基因,當(dāng)受到病原菌侵染后,水稻啟動(dòng)抗性基因的表達(dá),以抵御病原菌的入侵。

本研究還發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌在水稻葉片中優(yōu)先選擇葉脈處擴(kuò)展增殖(圖7),而且葉片侵染位點(diǎn)的組織周圍易形成水浸狀病斑(圖7)。稻瘟病菌定殖植物組織時(shí),其生長依賴于宿主產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)。我們推測(cè)稻瘟病菌沿著植物運(yùn)輸通道葉脈生長,可能更有利于獲取營養(yǎng)。此外,前人研究表明[28],稻瘟病菌在水稻組織細(xì)胞中分泌BAS1和BAS4等多種效應(yīng)蛋白,以調(diào)控宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究觀察到侵染葉片上形成水浸狀病斑,其原因可能是侵染菌絲生長過程中所分泌的效應(yīng)蛋白影響了宿主的免疫力,從而以水浸狀斑點(diǎn)表現(xiàn)出來。后續(xù)研究解析稻瘟病菌如何調(diào)控水稻免疫力及致病過程,將有助于深化對(duì)稻瘟病菌與水稻分子互作機(jī)理的認(rèn)識(shí)。

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(責(zé)任編輯： 田 喆)

FluorescentmicroscopicanalysisoftheplantinfectionprocessofMagnaportheoryzaeusinggreenfluorescentprotein

Xu Youpin, Liao Haicheng, Chen Jinhua, Luo Yuan, Su Jia, Zou Chengdong,Li Weitao, Wang Jing, Ma Bingtian, He Min, Chen Xuewei

(CollaborativeInnovationCenterforHybridRiceinYangtzeRiverBasin,StateKeyLaboratoryofHybridRice,KeyLaboratoryofMajorCropDiseasesofSichuanDepartmentofEducation,RiceResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)

Blast disease caused by the fungusMagnaportheoryzaeleads to tremendous loss in production and quality of rice worldwide. To effectively control rice blast disease, we need to understand the infection process and pathogenic mechanism ofM.oryzae. Green fluorescent protein (GFP) has been widely used as a labelling tool in life science research. Here we report the construction of a vector overexpressing GFP and the successful introduction of the vector into two commonly usedM.oryzaestrains Guy11 and ZB25. By using the resulting fungal transformants overexpressing GFP, we observed the successional and dynamic plant infection processes byM.oryzaeincluding conidial germination, germ tube elongation, formation of an appressorium and penetration peg, proliferation of infection hyphae within the rice tissue, appearance of blast lesion, development of conidiophore and production of conidia at the blast lesion. We also compared the infection processes ofM.oryzaebetween interactions with compatible rice host and incompatible host, and found thatM.oryzaeunderwent normal appressorium on both rice hosts. After the formation of appressorium,M.oryzaewas able to develop penetration peg and invasive hyphae within rice tissue in a compatible interaction, but lost these abilities in an incompatible interaction. Our study proves that theM.oryzaeexpressing GFP facilitates our observation of the processes ofM.oryzaeinfection on rice plant, thus providing an effective tool for examination of pathogen-plant interaction.

Magnaportheoryzae; green fluorescent protein (GFP); infection process; rice

2017-02-24

2017-03-29

國家自然科學(xué)基金(31301626);四川省科技廳國際合作項(xiàng)目(2014HH0066);國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX0800903B,2016ZX08001002)

* 通信作者 E-mail:cqhemin_1983@163.com

S 435.111.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.008