李學(xué)娟，劉四喜，陳澤彬，魏紅，楊衛(wèi)國，溫鵬強(qiáng)（.深圳市兒童醫(yī)院藥劑科，廣東深圳58038；.深圳市兒童醫(yī)院血液科，廣東深圳 58038；3.深圳市兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東深圳 58038；.深圳市兒童醫(yī)院兒科研究所，廣東深圳 58038）

高效液相色譜法測定人血漿中伏立康唑的濃度Δ

李學(xué)娟1＊，劉四喜2，陳澤彬1#a，魏紅1，楊衛(wèi)國3#b，溫鵬強(qiáng)4（1.深圳市兒童醫(yī)院藥劑科，廣東深圳518038；2.深圳市兒童醫(yī)院血液科，廣東深圳 518038；3.深圳市兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東深圳 518038；4.深圳市兒童醫(yī)院兒科研究所，廣東深圳 518038）

目的：建立測定人血漿中伏立康唑濃度的方法。方法：血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，以酮康唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜法測定。色譜柱為Dionex U-3000 Dimonsil C18，流動(dòng)相為三乙胺-冰醋酸-水混合溶液（1∶1∶98，V/V/V，pH約為4.0）-乙腈（40∶60，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為255 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：伏立康唑血藥濃度在0.2～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.2 μg/mL，最低檢測限為0.03 μg/mL；日內(nèi)、日間RSD均小于10%；方法回收率為92.06%～106.26%（RSD＜5%，n＝5），提取回收率為75.62%～90.59%（RSD＜5%，n＝5）。采用該法測得10例患兒體內(nèi)伏立康唑的血藥濃度為0.22～4.90 μg/mL（n＝10）。結(jié)論：該方法簡單、快速、專屬性強(qiáng)，可用于伏立康唑治療藥物監(jiān)測。

伏立康唑；血藥濃度；高效液相色譜法

伏立康唑（Voriconazole，VRC）主要用于治療侵襲性曲霉病、氟康唑耐藥型念珠菌引起的嚴(yán)重侵襲性感染、足放線病菌屬和鐮刀菌屬病原菌引起的嚴(yán)重感染，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、分布范圍廣泛、組織濃度高、非線性代謝等特點(diǎn)，是目前臨床上抗深部真菌感染的一線藥物[1-4]?；诮】凳茉囌叩乃巹?dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，VRC血藥濃度存在顯著的個(gè)體差異，并與其臨床療效及不良反應(yīng)密切相關(guān)[4-7]。Friberg LE等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，兒童藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的個(gè)體差異要較成人顯著。因此，通過血藥濃度監(jiān)測調(diào)整VRC劑量對(duì)患兒的臨床治療具有重要的意義。本研究結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)和自身實(shí)驗(yàn)室條件，建立了一種測定人血漿中VRC濃度的高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法，并將其應(yīng)用于臨床，以期為兒科臨床用藥方案的調(diào)整提供參考。

1 材料

1.1 儀器

U-3000型HPLC儀，包括U-3000型四元梯度泵、VWD-3000型紫外檢測器、WPS-3000型自動(dòng)進(jìn)樣器（美國Dionex公司）；Master-S型超純水儀（上海和泰儀器有限公司）；BP221S型電子天平（德國Sartorius公司）；DT5-6型醫(yī)用低速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；HC-2518型醫(yī)用高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；MS3型渦旋混合儀（德國IKA公司）。

1.2 藥品與試劑

VRC對(duì)照品（批號(hào)：100862-201402，純度：98.9%）、酮康唑?qū)φ掌罚▋?nèi)標(biāo)，批號(hào)：100294-201203，純度：99.0%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；注射用伏立康唑（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20064493，批號(hào)：150806，規(guī)格：100 mg）；伏立康唑片（成都泰合健康科技集團(tuán)股份有限公司華神制藥廠，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20055840，批號(hào)：160705，規(guī)格：50 mg）；乙腈、甲醇為色譜純，三乙胺、冰醋酸為分析純，水為超純水。

1.3 空白血漿

空白血漿由深圳市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dionex U-3000 Dimonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：三乙胺-冰醋酸-水混合溶液（1∶1∶98，V/V/V，pH約為4.0）-乙腈（40∶60，V/V），經(jīng)超聲脫氣后使用；流速：1.0 mL/min；檢測波長：255 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的配制

精密稱取VRC對(duì)照品25 mg，用乙腈定容至25 mL，得質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的VRC貯備液，置于4℃冰箱中保存。臨用時(shí)將上述貯備液用乙腈稀釋，得質(zhì)量濃度分別為4、10、25、50、100、200、400 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品2.5 mg，用乙腈定容至25 mL，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL內(nèi)標(biāo)貯備液，置于4℃冰箱中保存，備用。

2.3 血漿樣品處理

取空白血漿適量，加入100 μg/mL內(nèi)標(biāo)貯備液10 μL，混勻，加入乙腈1 mL，渦旋混勻，靜置5 min后，以離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速13 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL，進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿+VRC+內(nèi)標(biāo)、患兒血漿樣品+內(nèi)標(biāo)各適量，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，VRC與內(nèi)標(biāo)的峰形良好，保留時(shí)間分別為4.7、6.0 min，且空白血漿在相應(yīng)保留時(shí)間處并未見有色譜峰出現(xiàn)，詳見圖1。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、定量下限和最低檢測限的考察 取空白血漿適量、“2.2”項(xiàng)下各質(zhì)量濃度的VRC系列標(biāo)準(zhǔn)溶液25 mL，配制成VRC質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.233x+0.032（r＝0.998 9）。結(jié)果表明，VRC血藥濃度在0.2～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.2 μg/mL[信噪比（S/N）≥10]，最低檢測限為0.03 μg/mL（S/N≥3）。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 配制VRC低、中、高質(zhì)量濃度（0.5、5.0、10.0 μg/mL，下同）的血漿樣品，各質(zhì)量濃度重復(fù)配制5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)測質(zhì)量濃度，考察日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)、日間RSD均小于10%（n＝5），詳見表1。

圖1 高相液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.4 方法回收率試驗(yàn) 配制VRC低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，各質(zhì)量濃度重復(fù)配制5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測質(zhì)量濃度，以實(shí)測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，計(jì)算方法回收率。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品的方法回收率分別為92.85%～99.43%、92.06%～103.57%、99.20%～106.26%（RSD＜5%，n＝5），詳見表1。

2.4.5 提取回收率試驗(yàn) 配制VRC低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，各質(zhì)量濃度重復(fù)配制5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，得VRC色譜峰峰面積（A）；將未添加VRC對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的空白血漿按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，加入VRC對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)各適量，使最終質(zhì)量濃度與前者對(duì)應(yīng)，進(jìn)樣分析，得VRC色譜峰峰面積（B）。提取回收率＝A/B×100%。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品的提取回收率分別為75.62%～83.81%、79.50%～85.14%、81.15%～90.59%（RSD＜5%，n＝5），內(nèi)標(biāo)的提取回收率為95.40%，詳見表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（s，n＝5）Tab 1Results of precision and recovery tests（±s，n＝5）

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（s，n＝5）Tab 1Results of precision and recovery tests（±s，n＝5）

理論質(zhì)量濃度，μg/mL 0.5 5.0 10.0日內(nèi)精密度實(shí)測質(zhì)量濃度，μg/mL 0.47±0.02 4.97±0.26 10.20±0.12 RSD，%3.02 5.28 1.20日間精密度實(shí)測質(zhì)量濃度，μg/mL 0.48±0.25 5.04±0.22 10.18±0.01 RSD，%2.34 4.31 2.40方法回收率計(jì)算值，%096.77±2.74 100.92±4.87 101.88±2.54 RSD，%2.49 4.84 2.68提取回收率計(jì)算值，%80.23±3.43 82.35±2.71 85.33±4.01 RSD，%4.60 3.23 4.47

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 配制VRC低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，分別考察其在室溫下放置8、24 h，反復(fù)凍融3次（－20℃～室溫）的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在上述條件下，各血漿樣品的穩(wěn)定性良好，VRC質(zhì)量濃度均未出現(xiàn)明顯變化（RSD＜6%，n＝3），詳見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of stability tests

2.5 臨床應(yīng)用

采用上述HPLC法測定10例患兒體內(nèi)VRC的血藥濃度。10例患兒中，男、女性各半。其中，4例為侵襲性真菌感染，6例為經(jīng)驗(yàn)性用藥。參照VRC藥品說明書，待連續(xù)用藥6 d后即可達(dá)穩(wěn)態(tài)，于下次給藥前30 min抽取患兒外周靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，以離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心5 min，分離上清層（血漿）至1.5 mL EP管中，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，每例患兒各測定1次。結(jié)果顯示，10例患兒體內(nèi)VRC的血藥濃度為0.22～4.90 μg/mL（n＝10），詳見表3。

3 討論

測定唑類藥物血藥濃度的方法主要包括HPLC法、液質(zhì)聯(lián)用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）法以及微生物學(xué)方法（Microbiological methods）[9-10]。其中，LC-MS法成本高、操作煩瑣，難以用于臨床大樣本的監(jiān)測；微生物學(xué)方法雖較HPLC法簡便易行且成本更低，但靈敏度和特異性相對(duì)較差；應(yīng)用HPLC法檢測VRC血藥濃度，不同的流動(dòng)相（包括緩沖液和有機(jī)溶劑）和不同的樣品預(yù)處理方法（包括濕法萃取和蛋白沉淀等）已經(jīng)有報(bào)道[4，9，11]，但操作相對(duì)煩瑣。本研究結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)室條件，對(duì)色譜條件、樣品預(yù)處理方法等進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化，建立了測定人血漿中VRC濃度的HPLC法，并將其應(yīng)用于臨床。

由于VRC的分子結(jié)構(gòu)中含有三唑環(huán)、吡啶環(huán)等堿性基團(tuán)，因此在流動(dòng)相中加入一定比例的三乙胺，一方面可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，另一方面可以作為掃尾劑，防止色譜峰拖尾，改善峰形。酮康唑和VRC同為抗真菌藥，二者結(jié)構(gòu)中均含有咪唑環(huán)，在255 nm波長下均有較強(qiáng)響應(yīng)，且分離度良好；其次，酮康唑因其肝毒性及耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，已基本不再用于真菌感染的臨床治療，因此作為內(nèi)標(biāo)時(shí)可排除其對(duì)VRC血藥濃度監(jiān)測的影響，故最終選擇酮康唑作為內(nèi)標(biāo)化合物[12]。血漿樣品的前處理一般采用蛋白沉淀法，所用的溶劑包括高氯酸和三氟乙酸[4，9，11]。但筆者考慮到上述兩種物質(zhì)具有強(qiáng)氧化性，在血漿樣品的處理過程中，可能會(huì)對(duì)VRC和內(nèi)標(biāo)造成氧化破壞，且其強(qiáng)酸性也會(huì)對(duì)色譜柱造成一定損傷。因此，本研究采用乙腈作為蛋白沉淀試劑。本課題組在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血漿與乙腈體積比為1∶1時(shí)，蛋白雖可沉淀完全，但容易再出現(xiàn)渾濁；而當(dāng)血漿與乙腈的體積比為1∶2時(shí)，蛋白可沉淀完全，且無渾濁出現(xiàn)。色譜條件經(jīng)過優(yōu)化后，方法學(xué)考察的結(jié)果顯示，該方法具有簡便、快速、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)。

表3 10例患兒的基本情況及VRC血藥濃度檢測結(jié)果Tab 3 General information of 10 pediatric patients and plasma concentrations of VRC

采用上述HPLC法測得10例患兒體內(nèi)VRC的血藥濃度為0.22～4.90 μg/mL。相關(guān)研究顯示，VRC正常血藥濃度應(yīng)維持在1.5～4.5 μg/mL范圍內(nèi)[4，7]。本研究檢測的10例患兒中，有8例低于該范圍，1例在該范圍以內(nèi)，1例則超出該范圍。筆者認(rèn)為，VRC血藥濃度普遍偏低可能與維持給藥劑量偏低有關(guān)。藥品說明書指出，2歲以上患兒VRC的維持給藥劑量應(yīng)為7 mg/kg，而本研究中的10例患兒由于病情復(fù)雜、同時(shí)聯(lián)合使用了多種藥物，其平均給藥劑量僅為4.67 mg/kg。值得注意的是，有1例患兒體內(nèi)VRC的血藥濃度超出了正常范圍，筆者認(rèn)為可能與其低血漿白蛋白有關(guān)，該患兒血漿白蛋白為21.5 g/L，結(jié)合藥物的量減少，從而導(dǎo)致游離藥物濃度升高；但該患兒在應(yīng)用VRC治療期間并未出現(xiàn)肝腎功能損傷及視力損害等不良反應(yīng)。此外本研究結(jié)果還顯示，不同患兒體內(nèi)VRC血藥濃度的差異明顯，這些差異可能與VRC 給藥劑量、細(xì)胞色素 P450（Cytochrome P450，CYP）2C19基因多態(tài)性、藥物相互作用等因素有關(guān)[5，13]，同時(shí)也再次提示了開展VRC治療藥物監(jiān)測的必要性。

綜上所述，該方法簡便、快速、專屬性強(qiáng)，可用于VRC治療藥物監(jiān)測，可為臨床用藥方案的調(diào)整提供參考。

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Determination of Voriconazole in Human Plasma by HPLC

LI Xuejuan1，LIU Sixi2，CHEN Zebin1，WEI Hong1，YANG Weiguo3，WEN Pengqiang4（1.Dept.of Pharmacy，Shenzhen Children’s Hospital，Guangdong Shenzhen 518038，China；2.Dept.of Hematology，Shenzhen Children’s Hospital，Guangdong Shenzhen 518038，China；3.Dept.of Pediatric Intensive Care，Shenzhen Children’s Hospital，Guangdong Shenzhen 518038，China；4.Institute of Pediatrics，Shenzhen Children’s Hospital，Guangdong Shenzhen 518038，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of voriconazole in human plasma.METHODS：Plasma samples were precipitated with acetonitrile.Using ketoconazole as internal standard，HPLC method was adopted.The determination was performed on Dionex U-3000 Dimonsil C18column with mobile phase consisted of triethylamine-glacial acetic acid-water mixed solution（1∶1∶98，V/V/V，pH was about 4.0）-acetonitrile（40∶60，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 255 nm.The column temperature was 40 ℃，and sample size was 20 μL.RESULTS：The linear range of voriconazole was 0.2-20.0 μg/mL.The limits of quantification was 0.2 μg/mL，and the minimum detection limit was 0.03 μg/mL.RSDs of inter-day and intra-day were lower than 10%.The method recoveries were 92.06%-106.26%（RSD＜5%，n＝5），and extraction recoveries were 75.62%-90.59%（RSD＜5%，n＝5）.The plasma concentration of voriconazole in 10 children ranged 0.22-4.90 μg/mL（n＝10）.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，specific and can be used for drug monitoring of voriconazole.

Voriconazole；Plasma concentration；HPLC

R917

A

1001-0408（2017）32-4499-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.32.09

深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目（No.201402053）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0755-83008256。E-mail：xuejuanli@126.com

#通信作者a：主任藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥事管理、臨床藥學(xué)。電話：0755-83008225。E-mail：13602602625@126.com

#通信作者b：主任醫(yī)師，碩士。研究方向：兒科危重癥。電話：0755-83008193。E-mail：replicater@163.com

2017-02-23

2017-08-30）（編輯：張?jiān)拢?/p>