許 萌，周春華，張雪寧，亢澤坤（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000）

·臨床藥學(xué)與研究·

LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中加巴噴丁的濃度Δ

許 萌＊，周春華#，張雪寧，亢澤坤（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000）

目的：建立測(cè)定人血漿中加巴噴?。℅BP）濃度的方法。方法：血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，以磺胺甲噁唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為水（含0.05%甲酸）-甲醇，梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行正離子掃描，用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 172.0→154.1（GBP）、m/z 279.0→124.0（內(nèi)標(biāo)）。結(jié)果：GBP血藥濃度在13.4～10 720.4 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.992 3，n＝5），定量下限為13.4 ng/mL，最低檢測(cè)限為4.0 mg/mL；日內(nèi)、日間RSD均小于10%，相對(duì)誤差為－4.93%～5.10%；提取回收率為86.2%～90.3%（RSD＜5%，n＝6），基質(zhì)效應(yīng)為87.6%～92.1%。采用該法測(cè)得10例癲癇患者體內(nèi)GBP的血藥濃度為2 075.19～4 078.87 ng/mL（n＝20）。結(jié)論：本方法靈敏度高、專屬性好、適用性強(qiáng)，可用于癲癇患者體內(nèi)GBP的血藥濃度監(jiān)測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究。

加巴噴?。灰合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜；血藥濃度；癲癇患者

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導(dǎo)致短暫大腦功能障礙的一種慢性疾病，也是我國(guó)神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管疾病的第二大頑癥[1]。加巴噴丁（Gabapenitn，GBP）是新一代抗癲癇藥，對(duì)腦組織具有較高的親和力。與其他抗癲癇藥相比，GBP副作用小，可用于常規(guī)抗癲癇藥不能有效控制或不能耐受的局限性發(fā)作患者，以及局限性發(fā)作并繼發(fā)全身性癲癇患者的附加治療[2]。由于GBP的藥動(dòng)學(xué)特征存在個(gè)體差異，藥物劑量與中毒等不良反應(yīng)關(guān)系密切，且中毒癥狀與疾病癥狀不易區(qū)分[3]，因此GBP血藥濃度監(jiān)測(cè)對(duì)保證患者臨床用藥安全具有重要意義。目前，GBP藥物濃度的測(cè)定方法主要包括高效液相色譜（HPLC）法、毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法等，但均存在樣品前處理過(guò)程煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)[4-7]。本研究在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了一種快速檢測(cè)人血漿中GBP濃度的LC-MS/MS法，并將其應(yīng)用于臨床，以期為GBP的臨床研究及合理使用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（配有在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Agilent公司）；QTrapTM3200型三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀[配有電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）]；Analyst 1.5.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)AB公司）；TGL-16B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MTN-2800D型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；XH-C型旋渦混合器（金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠）；GT-1860QTS型超聲波清洗儀（廣東固特超聲股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

GBP對(duì)照品（上海士鋒生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：EB02064，純度：99%）；磺胺甲噁唑?qū)φ掌罚▋?nèi)標(biāo)，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100025-3200904，純度：99.6%）；加巴噴丁膠囊（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030662，批號(hào)：20151102，規(guī)格：0.1 g）；甲醇、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水?？瞻籽獫{由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院健康受試者提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：水（A相，含0.05%甲酸，pH＝3.6）-甲醇（B相），梯度洗脫（0～3 min，95%B；＞3～3.1 min，95%→20%B；＞3.1～13 min，20%B，進(jìn)樣前按流動(dòng)相初始條件平衡6 min）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

ESI，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式掃描，正離子方式檢測(cè)；噴射電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度：650℃；霧化氣（GS1，N2）壓力：413.70 kPa；輔助氣（GS2，N2）壓力：448.18 kPa；氣簾氣（N2）壓力：206.85 kPa。用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 172.0→154.1[GBP，解簇電壓（DP）：40 V，碰撞能（CE）：17 eV]、m/z 279.0→124.0（內(nèi)標(biāo)，DP：30 V，CE：21 eV）。

2.2 溶液的制備

精密稱取GBP對(duì)照品適量，置5 mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲（頻率：40 kHz）1 min使溶解，并用50%甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為1 072 μg/mL的對(duì)照品貯備液。取上述貯備液適量，用50%甲醇稀釋，得質(zhì)量濃度分別為 0.268、1.07、8.58、17.2、21.4、42.8、107.2、214.4 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；同法制備低、中、高質(zhì)量濃度（0.67、21.4、160.8 μg/mL）的對(duì)照品溶液，用于質(zhì)控（QC）樣品的制備。

精密稱取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品適量，置2 mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲（頻率：40 kHz）1 min使溶解，并用50%甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為1 035.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。取上述貯備液適量，用50%甲醇稀釋，得質(zhì)量濃度為20.7 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

上述所有溶液均置于4℃冰箱中保存，備用。

2.3 血漿樣品處理

取血漿樣品100 μL，置1.5 mL離心管中，精密加入甲醇和內(nèi)標(biāo)溶液各5 μL，渦旋混勻15 s，加入甲醇290 μL沉淀蛋白，渦旋混勻1 min，以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速15 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 在“2.1”項(xiàng)色譜與質(zhì)譜條件下，取空白血漿、空白血漿+GBP+內(nèi)標(biāo)、患者用藥后的血漿樣品+內(nèi)標(biāo)，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余均按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，考察方法的專屬性。結(jié)果顯示，在“2.1”項(xiàng)色譜與質(zhì)譜條件下，GBP和內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰形良好，保留時(shí)間分別為5.69、5.95 min，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物的測(cè)定，表明該方法專屬性良好。典型色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 典型色譜圖Fig 1 Representative MRM chromatograms

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、定量下限和最低檢測(cè)限的考察精密量取“2.2”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各適量，加入至空白血漿100 μL中，得GBP質(zhì)量濃度分別為13.4、53.6、428.8、857.6、1 072.0、2 144.1、5 360.2、10 720.4 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測(cè)物血藥濃度為橫坐標(biāo)（x）、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），采用加權(quán)最小二乘法（w＝1/x2）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.070 1×10－3x+0.021 3（r＝0.992 3，n＝5），表明其血藥濃度在13.4～10 720.4 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為13.4 ng/mL，最低檢測(cè)限為4.0 ng/mL。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 參照《化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]，精密量取“2.2”項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各適量，加至空白血漿100 μL中，配制成低、中、高質(zhì)量濃度（33.5、1 072.0、8 040.0 ng/mL）的QC樣品，同時(shí)制備定量下限質(zhì)量濃度（13.4 ng/mL）的血漿樣品，每質(zhì)量濃度取6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，按當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，考察精密度和準(zhǔn)確度，其中精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示，準(zhǔn)確度以相對(duì)誤差（RE）表示。結(jié)果顯示，各樣品日內(nèi)、日間RSD均小于10%，RE為－4.93%～5.10%。精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision and accuracy tests

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率考察 取空白血漿100 μL，置1.5 mL離心管中，加入甲醇200 μL，渦旋混勻15 s，以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速15 000 r/min離心10 min，分離上清液，吹干；在殘?jiān)蟹謩e加入GPB低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各適量，加入甲醇290 μL，渦旋混勻1 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析，記錄峰面積（B）。以水代替空白血漿進(jìn)行上述操作，進(jìn)樣分析，記錄峰面積（A）。取當(dāng)日低、中、高質(zhì)量濃度的QC樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄峰面積（C）。每質(zhì)量濃度取6樣本分析，基質(zhì)效應(yīng)＝B/A×100%，提取回收率＝C/B×100%?；|(zhì)效應(yīng)考察低、高質(zhì)量濃度（33.5和8 040.0 ng/mL）血漿樣品，提取回收率考察低、中、高質(zhì)量濃度（33.5、1 072.0、8 040.0 ng/mL）血漿樣品。結(jié)果表明，提取回收率分別為90.3%、86.2%、89.9%，內(nèi)標(biāo)的提取回收率為91.2%，RSD為2.0%～4.3%（n＝6）；基質(zhì)效應(yīng)為87.6%、92.1%，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為90.4%，表明在“2.1”項(xiàng)色譜與質(zhì)譜條件下，可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響[9]。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各適量，加至空白血漿100 μL中，配制成低、中、高質(zhì)量濃度（33.5、1 072.0、8 040.0 ng/mL）的QC樣品各3份。分別考察室溫下放置4 h、－20℃放置40 h、－20℃至室溫反復(fù)凍融3次、－20℃冷凍保存60 d的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各QC樣品在上述條件下均穩(wěn)定，RSD＜10%（n＝3）。

2.5 臨床應(yīng)用

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)后，GBP血藥濃度測(cè)定在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院進(jìn)行。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法選取2016年2－4月我院服用GBP治療的門(mén)診癲癇患者10例，年齡18～50歲，均為原發(fā)性癲癇（診斷符合國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟2001年制定的癲癇和癲癇綜合征的診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)[10]）。所有患者按藥品說(shuō)明書(shū)口服GBP膠囊：第1天晚上給藥0.3 g；第2天為每日2次，每次0.3 g；從第3天開(kāi)始，每日3次，每次0.3 g。于第5天晨起服藥前抽取靜脈血5 mL（參考藥品說(shuō)明書(shū)，其消除半衰期為5～7 h，此時(shí)血藥濃度已達(dá)穩(wěn)態(tài)），置肝素離心管中，于4℃下，以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速15 000 r/min離心10 min，取上層血漿于－20℃保存，待測(cè)。

采用上述LC-MS/MS法測(cè)定各患者體內(nèi)GBP的血藥濃度，每例患者平行測(cè)定2次。結(jié)果顯示，10例患者體內(nèi)GBP的血藥濃度為2 075.19～4 078.87 ng/mL（n＝20），詳見(jiàn)表2。

表2 患者臨床資料和GBP血藥濃度檢測(cè)結(jié)果Tab 2 Clinical data of patients and results of plasma concentration determination of GBP

3 討論

色譜條件是實(shí)現(xiàn)待測(cè)物良好分離效果的前提。本研究采用Diamonsil C18反相色譜柱，并于前期試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇作為有機(jī)相時(shí)，待測(cè)物色譜峰峰形優(yōu)于乙腈。在流動(dòng)相中加入甲酸，可提高待測(cè)物的離子化效率，改善其色譜峰峰形，同時(shí)還可提高檢測(cè)靈敏度。因此，本課題組前期試驗(yàn)考察了不同濃度甲酸（0.1%、0.5%、0.01%、0.05%）對(duì)待測(cè)物色譜行為的影響。結(jié)果顯示，流動(dòng)相中加入0.05%甲酸可以達(dá)到改善峰形、提高靈敏度的目的，故最終確定水（含0.05%甲酸）-甲醇作為流動(dòng)相。

由于GBP極性較大，沒(méi)有合適的萃取溶劑可將其從血漿中萃取出來(lái)，且固相萃取法成本較高；同時(shí)，由于GBP無(wú)紫外吸收，也不會(huì)發(fā)射熒光，若直接采用HPLC法測(cè)定則難度較大，且樣品需經(jīng)過(guò)衍生化處理，操作復(fù)雜[7]；國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，采用LC-MS/MS法測(cè)定人血清中GBP的含量，采用液-液萃取法進(jìn)行樣品預(yù)處理，需要用氮?dú)獯蹈?，過(guò)程煩瑣且耗時(shí)[11]。本研究在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上建立了新的LC-MS/MS法，樣品處理采用簡(jiǎn)單、快速、易操作的蛋白沉淀法。前期試驗(yàn)分別考察了甲醇和乙腈作為沉淀試劑對(duì)待測(cè)物血藥濃度測(cè)定的影響。結(jié)果顯示，以甲醇作為沉淀試劑時(shí)，GBP的響應(yīng)值較高，并且與流動(dòng)相的有機(jī)相一致，因此將沉淀試劑選定為甲醇。

癲癇是神經(jīng)科常見(jiàn)的慢性臨床綜合征，其藥物治療仍有諸多問(wèn)題亟待解決[12-13]。抗癲癇藥主要包括傳統(tǒng)的一線藥物和新型抗癲癇藥兩大類。其中，傳統(tǒng)的抗癲癇藥不良反應(yīng)較多，而新型抗癲癇藥（如GBP）以其不良反應(yīng)少、妊娠期患者耐受性好等優(yōu)點(diǎn)一直受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注[14]。本研究采用LC-MS/MS法測(cè)定我院10例癲癇患者體內(nèi)GBP的濃度。結(jié)果顯示，這10例患者的血藥濃度均在有效治療濃度范圍（有效治療濃度一般為2 000～7 000 ng/mL[3]）內(nèi)。但在治療過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)有1例患者出現(xiàn)明顯的嗜睡，有2例出現(xiàn)惡心及胃腸不適等不良反應(yīng)。GBP膠囊的不良反應(yīng)大多與劑量相關(guān)，且常見(jiàn)于用藥早期[3]。因此，為理想地控制癲癇發(fā)作，同時(shí)最大限度地減少不良反應(yīng)，建議臨床在治療時(shí)，應(yīng)從小劑量開(kāi)始，緩慢地增加劑量至完全控制發(fā)作[3]。

本文建立了測(cè)定人血漿中GBP的LC-MS/MS法，該方法分析靈敏度高、專屬性好、適用性強(qiáng)，具有良好的精密度及準(zhǔn)確度，可用于臨床血藥濃度的監(jiān)測(cè)及藥動(dòng)學(xué)的研究。將該方法應(yīng)用于臨床癲癇患者的血藥濃度監(jiān)測(cè)，有助于臨床及時(shí)發(fā)現(xiàn)治療中存在的問(wèn)題，開(kāi)展個(gè)體化治療，保障患者用藥的安全、有效。

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Determination of the Concentration of Gabapentin in Human Plasma by LC-MS/MS

XU Meng，ZHOU Chunhua，ZHANG Xuening，KANG Zekun（Dept.of Pharmacy，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of gabapentin（GBP）in human plasma.METHODS：After precipitated by methanol，using sulfamethoxazole as internal standard，LC-MS/MS method was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consisted of water（containing 0.05%formic acid）-methanol using a gradient elution program at the flow rate of 1 mL/min.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 20 μL.The ESI was equipped and quantitative analysis was operated in positive ion and MRM mode.The mass transition ion-pairs were followed as m/z 172.0→154.1（GBP）and m/z 279.0→124.0（internal standard）.RESULTS：The linear range of GBP was 13.4-10 720.4 ng/mL（r＝0.992 3，n＝5）.The limit of quantitation was 13.4 ng/mL，and the minimum detection limit was 4.0 ng/mL.RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%.Relative errors ranged－4.93%-5.10%.The recoveries ranged 86.2%-90.3%（RSD＜5%，n＝6），and matrix effects ranged 87.6%-92.1%.The plasma concentration of GBP in 10 epileptic patients ranged 2 075.19-4 078.87 ng/mL（n＝20）.CONCLUSIONS：The method is proved to be sensitive，specific，practical and suitable for plasma concentration monitoring and pharmacokinetic study of GBP in epileptic patients.

Gabapentin；LC-MS/MS；Plasma concentration；Epileptic patients

R917

A

1001-0408（2017）32-4496-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.32.08

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目（No.20120082）

＊藥師，碩士。研究方向：藥物的質(zhì)量研究與控制。電話：0311-66007385。E-mail：xumeng0622@126.com

#通信作者：副主任藥師，碩士。研究方向：藥物分析、臨床藥學(xué)。電話：0311-66007385。E-mail：zhouchunhua80@126.com

2016-12-12

2017-08-18）（編輯：張?jiān)拢?/p>