沈唯軍 時 晨 丁 婷 （無錫市輔仁高級中學 江蘇無錫 214123）

學生“D IY”凝膠染色，用于“探究影響酶活性的因素”

沈唯軍 時 晨 丁 婷 （無錫市輔仁高級中學 江蘇無錫 214123）

在教師的指導下，學生整合了凝膠電泳和“探究影響酶活性的因素”的實驗。通過創(chuàng)新地引入凝膠分割和染色條件控制，學生“DIY”進行了凝膠酶活性染色。實驗不僅操作性更強、能夠培養(yǎng)實驗興趣，而且開拓了學生的思路，充分體現(xiàn)了實驗的探究性和開放性。

凝膠染色 淀粉酶 過氧化氫酶 溫度 pH

筆者在與丹麥交流生的交談中，發(fā)現(xiàn)歐美生物課程并不是采用線性的方法去驗證結(jié)論，而是鼓勵學生“跳躍思維”運用各種技術(shù)去探究問題。為此筆者以“探究影響酶活性的因素”實驗為支點，指導學生查閱各種資料，獨立設(shè)計了各種實用的實驗方法。其中，聯(lián)系到人教版選修1“SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳——血紅蛋白的分離與純度檢測”，學生創(chuàng)新地整合了兩個實驗并取得了較好的實驗效果。

1 實驗原理

蛋白酶的凝膠電泳分離：在電場的驅(qū)動下，攜帶負電荷的蛋白酶能從聚丙烯酰胺凝膠的負極向正極泳動，其電泳的距離和樣品的分子量有關(guān)。

過氧化氫酶的活性染色：在凝膠上無過氧化氫酶的區(qū)域，H2O2能與FeCl3-K3Fe(CN)6反應(yīng)呈現(xiàn)藍色，而在有過氧化氫酶的區(qū)域則能將H2O2分解為H2O和O2，這樣在凝膠的藍色背景下就會呈現(xiàn)透明區(qū)帶，并且區(qū)帶亮度越大，表明活性越高。

淀粉酶的活性染色：在凝膠上無淀粉酶的區(qū)域，淀粉溶液能與碘溶液反應(yīng)呈現(xiàn)暗藍色，而在有淀粉酶的區(qū)域則能分解淀粉，同樣會在暗藍色背景上出現(xiàn)淺黃色區(qū)帶，并且區(qū)帶亮度越大，表明活性越高。

2 試劑配制（以下試劑由教師提前配制或直接購買）

質(zhì)量分數(shù)為30%的丙烯酰胺溶液：稱取14.55 g丙烯酰胺和0.45 g N，N'-甲叉雙丙烯酰胺，先用40 mL蒸餾水攪拌溶解，再用蒸餾水定容至50 mL，過濾。用棕色瓶4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

物質(zhì)量濃度為0.5 mol/L的Tris-HCl(pH6.8)溶液：稱取3.03 g Tris溶解在40 mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8。再用蒸餾水定容至50 mL。保存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

物質(zhì)量濃度為1.5 mol/L的Tris-HCl（pH8.9)溶液：稱取18.16 g Tris溶解在80 mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH至8.9。再用蒸餾水定容至100 mL，保存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

質(zhì)量分數(shù)為10%的過硫酸銨：稱取0.1 g過硫酸銨用蒸餾水定容至1.0 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

電極緩沖液：稱取15.14 g Tris和72.07 g甘氨酸，用蒸餾水定容至5 L。

樣品：購買商品化的過氧化氫酶和淀粉酶（鄭州碩源生物科技有限公司），稱取1 g酶粉和2 mg溴酚藍，加入1 mL 0.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)溶液和0.5 mL甘油，用蒸餾水定容到10 mL。

過氧化氫酶染色液：A液：量取1 mL市售質(zhì)量分數(shù)為30%的H2O2溶液，用蒸餾水定容至1 L；B液：稱取FeCl3和K3Fe(CN)6各10 g，用蒸餾水定容至1 L。

淀粉酶染色液：A液：稱取10 g可溶性淀粉和12 g NaCl，用蒸餾水定容至1 L；B液：量取50 mL醋酸，用蒸餾水定容至1L；C液：稱取30mg KI和13mg I2，用蒸餾水定容至1 L。

3 凝膠的配制(由學生自主操作，教師指導)

（1）將玻璃板、膠墊、梳子用蒸餾水洗凈，并用酒精棉球擦拭，按說明安裝好電泳槽。

（2）按表1所示，配制12%分離膠和5%濃縮膠。

（3）先將分離膠倒入兩塊玻璃板間，直至前端離頂端2.5 cm左右，在膠頂部緩緩加入約0.5 cm的蒸餾水，待分離膠聚合完全后，傾去上層的蒸餾水，用吸水紙吸去殘余的水滴。將濃縮膠倒入玻璃板夾層，插上梳子，待濃縮膠聚合完全后，拔去梳子，立即用蒸餾水清洗點樣孔。

4 電泳

加入電極緩沖液，用移液槍將10 μL樣品點入點樣孔底部。電泳在4℃的冰箱中進行，保持電壓100 V，直至溴酚藍到達凝膠底部終止。

表1 分離膠和濃縮膠的配置

5 凝膠分割

使用直尺和飛鷹刀片，將不同泳道的凝膠進行分割。

6 凝膠活性染色

（1）參考Wu,Cui,Tao and Yang的方法：將凝膠條移到大培養(yǎng)皿中，用蒸餾水浸泡15 min。其后，將凝膠在 pH 為 3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 的 A 液中浸泡25 min，然后小心地用蒸餾水洗滌后放入B液中染色。當達到最大對比度，用蒸餾水漂洗凝膠使反應(yīng)停止。

（2）參考黃紅英、易道生和高建林的方法：把凝膠條浸入 A 液，在 0、25、50、75、100 ℃保溫 30 min，取出凝膠用蒸餾水洗凈再放置于B液中浸泡5 min。然后取出沖洗后再放置于C液中浸泡，直至在暗藍色背景上出現(xiàn)淺黃色區(qū)帶。

7 實驗結(jié)果

學生通過自主的的探究活動，可以得出如下結(jié)論：如圖1所示，凝膠中的過氧化氫酶在不同pH條件下顯示的條帶深淺各不相同，即過氧化氫酶的活性與pH緊密相關(guān)的。過氧化氫酶的最適pH為6.0，pH上升（pH7.5,pH9.0）或下降（pH3.0，pH4.5）時，酶的活性都會顯著下降。如圖2所示，凝膠中淀粉酶的條帶著色也隨著溫度而變化。當在溫度為50℃時，活性最高，酶帶較寬。溫度低于或高于50℃時，酶帶逐漸變窄，酶活性顯著下降。

8 教學反思

8.1 采用凝膠染色，體驗分子技術(shù)

圖1 利用凝膠活性染色探究pH對過氧化氫酶的活性的影響

圖2 淀粉酶的凝膠活性染色

隨著實驗硬件的改善，昔日“高大上”的分子實驗，開始“飛入”尋常高中的課堂。但是由于實踐運用上的局限，學校很少能夠有效地開展凝膠電泳實驗。相較于純粹地理論講解，通過親身實驗可以使學生更加真實地體驗到分子生物學的奧秘。

8.2 操作性更強，培養(yǎng)實驗興趣

原教材的探究實驗雖然簡單易行，但是也剝奪了學生動手實踐的機會。生物學本質(zhì)是實驗性的科學，更多的實踐操作會為學生打下更加堅實的科研基礎(chǔ)。此外，相較于直接觀察氣泡或顏色的變化，由學生“DIY”的凝膠染色，明顯增加了實驗的趣味性。

8.3 自主設(shè)計實驗，開拓探究思路

本實驗從設(shè)計到最終的實施，都有學生的參與。學生在參考文獻的同時并不是簡單地模仿。為了適應(yīng)實驗?zāi)康?，學生創(chuàng)新地進行了凝膠分割和染色條件控制，充分體現(xiàn)了實驗的探究性和開放性。

[1] 沈唯軍.探究pH和溫度對多酚氧化酶活性的影響[J].生物學教學,2016,41(10):49-50.

[2] G.P.曼琴科.酶的凝膠電泳檢測[M].化學工業(yè)出版社,2008.[3] 許黎黎,邵雪玲.鯽魚不同組織過氧化氫酶同工酶活性的比較[J].氨基酸和生物資源,2003,25(4):69-71.

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文件編號：1003-7586(2017)10-0044-02