梁運(yùn)濤 盧斌山 張強(qiáng) 高悅禹 夏彥玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱,150040)

梅花鹿鹿茸組織PDGFA基因cDNA克隆及序列分析1)

梁運(yùn)濤 盧斌山 張強(qiáng) 高悅禹 夏彥玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱,150040)

為了探討PDGFA基因的結(jié)構(gòu)和功能，采用RT-PCR方法獲得梅花鹿PDGFA基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對其序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：梅花鹿PDGFA基因開放閱讀框大小為591 bp，共編碼196個(gè)氨基酸，蛋白的分子質(zhì)量約為22 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為8.53，是親水性蛋白，具有信號肽。二級結(jié)構(gòu)分析顯示，含有47.45%無規(guī)則卷曲、39.29%α-螺旋、13.27%擴(kuò)展鏈。進(jìn)化分析顯示，PDGFA蛋白與白尾鹿(Odocoileusvirginianustexanus)、家牛(Bostaurus)、山羊(Caprahircus)、野豬(Susscrofa)、白犀牛(Ceratotheriumsimum)、小鼠(Musmusculus)、密西西比鱷(Alligatormississippiensis)、原雞(Gallusgallus)、絨啄木鳥(Picoidespubescens)的蛋白質(zhì)序列相似度分別為98%、97%、96%、94%、93%、89%、81%、79%、78%。

梅花鹿；PDGFA基因；克隆；序列分析；進(jìn)化分析

鹿茸為雄鹿(馴鹿除外)未骨化而帶有茸毛的幼角，含有多種生理活性物質(zhì)，具有提高身體機(jī)能、補(bǔ)腎壯陽、生精益血和補(bǔ)髓健骨的作用。鹿茸在哺乳動(dòng)物角中的獨(dú)特之處在于其會周期性的脫落和再生，其細(xì)胞增殖速度遠(yuǎn)高于腫瘤細(xì)胞增殖速度，所以鹿茸的生長發(fā)育機(jī)制一直都是科學(xué)家研究和關(guān)注的熱點(diǎn)。

血小板衍生生長因子A(PDGFA)是血小板衍生生長因子大家族的一員，由多種細(xì)胞產(chǎn)生[1]，其通過結(jié)合和活化高度特異的細(xì)胞膜表面受體PDGFRα來激活PDGF/PDGFR通路，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[2]。PDGFA主要表達(dá)于表皮細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)元前體，對胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和組織損傷反應(yīng)過程有重要的作用，并在一些生理過程中刺激細(xì)胞的增殖和遷移[3]。本研究以梅花鹿(Cervusnippon)鹿茸組織為研究對象，克隆了PDGFA基因的CDS全序列，利用生物信息學(xué)方法分析基因序列，為進(jìn)一步研究該基因在梅花鹿鹿茸生長發(fā)育中的調(diào)控作用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取人工飼養(yǎng)的1頭東北梅花鹿，切取鹿茸頂端約5 cm，將其表面消毒并剖開，取其頂端組織樣品，保存于液氮中。

1.2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取樣本組織的總RNA[4]，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測提取的總RNA質(zhì)量和濃度。取1 μL總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作合成梅花鹿鹿茸的cDNA。

1.3 PDGFA基因的cDNA克隆

參照GenBank上家牛的PDGFA基因序列設(shè)計(jì)1對同源引物(F：5′-GATGAGGACCTGGGCTTG-3′，R：5′-TCAGGAATGTAACACGCCA-3′)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)，rTaqDNA聚合酶0.25 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，cDNA 2 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O 16.75 μL。擴(kuò)增條件為，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，57 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

按照pMD18-T載體說明書將純化的目的片段與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在37 ℃震蕩培養(yǎng)箱中搖床1 h后接種到LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜恒溫培養(yǎng)；利用藍(lán)白斑篩選，選取單個(gè)、飽滿的白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h；對菌液進(jìn)行PCR鑒定，將陽性克隆檢測的樣品送到華大公司進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

將測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST分析比對，運(yùn)用ORF Finder程序分析基因的CDS區(qū)[5]。運(yùn)用ExPASy在線服務(wù)器上的ProtParam程序、ProtScale程序、TMpred程序進(jìn)行蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親疏水性和蛋白跨膜區(qū)分析。運(yùn)用SignalP 3.0程序進(jìn)行信號肽預(yù)測分析。運(yùn)用PSORT在線服務(wù)器中的PSORT Ⅱ程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析[6]。運(yùn)用Predict protein程序進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析[7]。運(yùn)用ExPASy服務(wù)器上的SWISS-MODLE程序進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)同源建模[8]，并應(yīng)用SWISS-PdbViewer(Deep View)軟件來評估此次建模的質(zhì)量[9]。最后，運(yùn)用Clustal程序進(jìn)行物種間氨基酸多序列的完全對比，通過MEGA6.0軟件構(gòu)建NJ-系統(tǒng)進(jìn)化樹來分析梅花鹿PDGFA基因與其他物種的PDGFA基因進(jìn)化的遠(yuǎn)近關(guān)系[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDGFA基因的cDNA克隆

從梅花鹿頂端組織中提取總RNA，電泳后清晰可見3條帶，OD260/OD280比值為1.98。RT-PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在500～750 bp出現(xiàn)單一條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR鑒定后，送生物公司測序。測序結(jié)果表明，獲得的PDGFA基因cDNA序列為657 bp。

M.DL2000Maker；1.PDGFA基因編碼區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 序列分析

將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，確認(rèn)是梅花鹿的PDGFA基因。運(yùn)用NCBI的ORF Finder程序分析梅花鹿PDGFA基因，獲得長591 bp的編碼區(qū)(圖2)，其CDS區(qū)共編碼196個(gè)氨基酸殘基。PDGFA基因A、T、G、C堿基組成分別為22.40%、14.30%、33.84%、29.84%。(G+C)%為63.68%高于(A+T)，說明PDGFA編碼區(qū)的DNA雙鏈比較穩(wěn)定。

2.3 PDGFA基因的分析進(jìn)化

應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫中Blastp功能對比后，從GenBank下載9個(gè)物種PDGFA蛋白的氨基酸序列，梅花鹿PDGFA蛋白氨基酸序列與這些物種相似度為78%～98%，其中與白尾鹿(Odocoileusvirginianustexanus)相似度最高，梅花鹿PDGFA蛋白序列與白尾鹿、家牛(Bostaurus)、山羊(Caprahircus)、野豬(Susscrofa)、白犀牛(Ceratotheriumsimum)、小鼠(Musmusculus)、密西西比鱷(Alligatormississippiensis)、原雞(Gallusgallus)、絨啄木鳥(Picoidespubescens)的同源性分別為98%、97%、96%、94%、93%、89%、81%、79%、78%。結(jié)果分析顯示，梅花鹿PDGFA基因具有較高的保守性，生物學(xué)功能在進(jìn)化中比較穩(wěn)定。

運(yùn)用Blastp程序和Clustal X軟件對PDGFA蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，利用MEGA 6.0軟件中Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，從基因座位上看，梅花鹿與白尾鹿、家牛、山羊、野豬親緣關(guān)系較近(圖3)，與物種傳統(tǒng)分類學(xué)情況類似，符合進(jìn)化關(guān)系[11]。

圖3 PDGFA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 蛋白質(zhì)特性

2.4.1 蛋白質(zhì)一級序列

ProtParam程序分析結(jié)果顯示，梅花鹿PDGFA蛋白由196個(gè)氨基酸組成；相對分子質(zhì)量為22 072.41；理論等電點(diǎn)(pI)為8.53；氨基酸組成中谷氨酸氨酸(Glu)占總體的11.7%，其次為精氨酸(Arg)和丙氨酸(Ala),均為9.7%；分子式為C957H1565N293O284S11；總原子數(shù)為3 110，帶負(fù)電荷的殘基數(shù)(Asp+Glu)為27，帶正電荷的殘基數(shù)(Arg+Lys)為31；不穩(wěn)定系數(shù)為63.06，是不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為85.61；總平均親水性為-0.458，是親水性蛋白；消光系數(shù)為16 095,在哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞的半衰期為30 h。

2.4.2 親疏水性

運(yùn)用ExPASy服務(wù)器上的ProtScale程序中Kyte and Doolitlle算法(大于0.5的區(qū)域?yàn)槭杷畢^(qū)，小于-0.5的區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)，在0.5和-0.5之間的區(qū)域?yàn)閮尚詤^(qū)域)對PDGFA蛋白親疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，最小值達(dá)到-2.856，最大值為2.356，PDGFA蛋白親水性較強(qiáng)(圖4)。

圖4 PDGFA蛋白的親疏水性預(yù)測

2.4.3 信號肽預(yù)測

利用在線分析工具SignalP 3.0中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(NN)對PDGFA蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測(圖5)。結(jié)果表明，PDGFA蛋白具有信號肽，位點(diǎn)為20～21:ALA～EE，是分泌性蛋白。

2.4.4 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測

運(yùn)用ExPASy在線服務(wù)器上的TMpred程序?qū)DGFA蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測分析(圖6)。結(jié)果顯示，在氨基酸1～19位點(diǎn)從內(nèi)到外螺旋的得分為1 375，從外到內(nèi)螺旋得分為1 253，推測PDGFA是跨膜蛋白，與信號肽位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果一致。

圖5 PDGFA蛋白信號肽預(yù)測

圖6 PDGFA蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測

2.4.5 亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用PSORT在線服務(wù)器中的PSORT Ⅱ程序?qū)DGFA蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析，結(jié)果顯示，PDGFA蛋白有55.6%的可能性分泌到細(xì)胞外，有22.2%的可能性存在于線粒體中，有11.1%的可能性存在于細(xì)胞核內(nèi)，有11.1%的可能性存在于分泌系統(tǒng)囊泡中。

2.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用ExPASy在線服務(wù)器上的GOR4程序?qū)DGFA蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析(圖7)。結(jié)果表明，PDGFA基因以無規(guī)則卷曲為主，其次為α-螺旋和擴(kuò)展鏈，分別占47.45%、39.29%、13.27%。

2.6 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用ExPASy在線服務(wù)器上的SWISS-MODLE程序?qū)DGFA蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模(圖8A)，并運(yùn)用軟件SWISS-PdbViewer(Deep View)進(jìn)行檢測來評估此次建模的質(zhì)量(圖8B)。分析顯示，PDGFA蛋白殘基集中于中心區(qū)域內(nèi)，說明此空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，SWISS-MODLE程序?qū)DGFA蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)同源建模結(jié)果可靠。

圖8 PDGFA蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(A)及建模檢測(B)

3 討論

研究證實(shí)PDGFA與多種腫瘤及血管性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、肺部高壓、腎臟疾病、心瓣手術(shù)再狹窄，還有一些纖維性疾病如肺纖維化、肝硬化、硬皮病、腎小球硬化癥、心臟纖維化等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[12]。而且它是調(diào)控腫瘤血管生成的重要因子，其通過募集周細(xì)胞來刺激腫瘤血管生成，并保證腫瘤細(xì)胞的生長和生存[13]。另外，PDGFA還能促進(jìn)結(jié)締組織細(xì)胞增殖，對造血干細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板，以及骨髓微環(huán)境的血小板生成素合成有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。在PDGF信號發(fā)揮作用的腫瘤性疾病中，可以使用一些抑制劑進(jìn)行治療。有研究報(bào)道，在多形性惡性膠質(zhì)瘤中，PDGFA結(jié)合右旋糖酐后再與PDGFRα結(jié)合，已經(jīng)成為潛在的治療新靶點(diǎn)[14]。

本研究成功克隆了梅花鹿PDGFA基因cDNA序列，該基因開放閱讀框包含591 bp，編碼196個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),PDGFA蛋白具有信號肽，屬于分泌性蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,PDGFA蛋白以無規(guī)則卷曲為主，其次為α-螺旋，擴(kuò)展鏈最少。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,PDGFA蛋白氨基酸序列與白尾鹿的相似度達(dá)到了98%，與家牛、山羊和野豬的親緣關(guān)系也比較近，符合傳統(tǒng)的分類學(xué)進(jìn)化關(guān)系，也提示PDGFA基因序列比較保守，在不同物種中行使的功能可能相似。鹿茸角生長速度驚人，鹿茸頂端組織細(xì)胞生長速度比癌細(xì)胞生長速度還要快，因此克隆梅花鹿PDGFA基因?qū)τ谔剿髀谷咨L的奧秘和豐富鹿茸研究的分子生物學(xué)信息有著重要意義。

[1] 殷亮，張一.血小板衍生生長因子與肝臟疾病的研究進(jìn)展[J].江西醫(yī)藥,2010,45(8):837-838.

[2] 楊默,束玲玲,崔韻.PDGF/PDGFR對血小板生成的調(diào)節(jié)作用[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2011,19(5):1097-1101.

[3] 黃也.PDGFRα在人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用和機(jī)制研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué),2015.

[4] SIMMS D, CHOMCZYNSKI P. TRIzol: A new reagent for optimal single-step isolation of RNA[J]. Focus,1993,15(4):99-102.

[5] 周曉光,任魯風(fēng),李運(yùn)濤,等.下一代測序技術(shù):技術(shù)回顧與展望[J].中國科學(xué):生命科學(xué),2010,40(1):23-37.

[6] BENDTSEN J D, NIELSEN H, VON HEIJNE G, et al. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology,2004,340(4):783-795.

[7] HOFMANN K, STOFFEL W. TMbase-A database of membrane spanning protein segments[M]. Biol Chem Hoppe-Seyler,1993,374(1):1-3.

[8] ARNOLD K, BORDOLI L, KOPP J, et al. The swiss-model workspace: A web-based environment for protein structure homology modeling[J]. Bioinformatics,2005,22(2):195-201.

[9] SCHWEDE T, KOPP J, GUEX N, et al. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server[J]. Nucleic Acids Research,2003,31(13):3381-3385.

[10] 蔡娟.基于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及聚類算法的蛋自質(zhì)功能預(yù)測方法研究[D].長沙：中南大學(xué),2012.

[11] 王鏡巖,朱圣庚,徐長法.生物化學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2002:229.

[12] GALLINI R, LINDBLOM P, BONDJERS C, et al. PDGF-A and PDGF-B induces cardiac fibrosis in transgenic mice[J]. Exp Cell Res,2016,349(2):282-290.

[13] ANDRAE J, GALLINI R, BETSHOLTZ C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine[J]. Genes Dev,2008,22(10):1276-1312.

[14] WESTER M D, WASTESON A, LINDSTROM A. Targetitg malignant glioma cells in virto using plateleo-derired growth factor AA-based conjugates[J]. Journal of drug targeting，2009，17(4):268-277.

CloningandSequenceAnalysisofthePDGFAGenecDNAinSikaDeerAntlerTissue//

Liang Yuntao, Lu Binshan, Zhang Qiang, Gao Yueyu, Xia Yanling

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//

Sika Deer;PDGFAgene; Cloning; Sequence analysis; Evolutionary analysis

1)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572014CA01)；中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(20110491124)。

梁運(yùn)濤，男，1990年2月生，東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，碩士研究生。E-mail：liangyt1991@163.com。

夏彥玲，東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，副教授。E-mail：xiayanling1974@163.com。

2017年6月1日。

責(zé)任編輯：程 紅。

S825.2

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(11)：89-93.

To explore the structure and function ofPDGFAgene, we used the reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) to clone the cDNA sequence of thePDGFAgene from sika deer (Cervusnipponhortulorum). We further analyzed the sequence using different bioinformatics software. The open reading fragment size of thePDGFAgene was 591 bp, encoding 196 amino acids. The relative molecular weight ofPDGFAprotein was about 22 kD and the theoretical isoelectric point (pI) was 8.53.PDGFAprotein was hydrophilic and had a signal peptide. From secondary structure analysis,PDGFAprotein included 47.45% random curl, 39.29% alpha-helix and 13.27% extension chain. By evolutionary analysis,PDGFAprotein sequences shared the homologies withOdocoileusvirginianustexanus,Bostaurus,Caprahircus,Susscrofa,Ceratotheriumsimum,Musmusculus,Alligatormississippiensis,Gallusgallus,Picoidespubescenswere 98%, 97%, 96%, 94%, 93%, 89%, 81%, 79% and 78%, respectively.