閆曉茹，師濤，潘洋洋，景炅婕，程俐芬，曹寧賢，喬利英，劉文忠

?

MiR-433-3p靶向調(diào)節(jié)綿羊表達(dá)

閆曉茹1，師濤1，潘洋洋1，景炅婕1，程俐芬2，曹寧賢2，喬利英1，劉文忠1

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2山西省畜禽繁育工作站，太原 030001）

通過理論預(yù)測與試驗(yàn)驗(yàn)證，旨在揭示miR-433-3p對的調(diào)節(jié)機(jī)制。利用TargetScan、miRanda和DIANA-microT 3個在線軟件，以的序列預(yù)測與有靶標(biāo)關(guān)系的相關(guān)miRNAs。為了驗(yàn)證理論上的預(yù)測結(jié)果，用設(shè)計好的3′-UTR的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段并進(jìn)行割膠回收和純化，并將Pmir-GLO與目的片段同時使用I和I兩個限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，再用T4連接酶連接雙酶切之后的目的片段和Pmir-GLO，成功構(gòu)建3′-UTR的雙熒光素酶報告載體。從公司購買miR-433-3p的過表達(dá)載體mimics和陰性對照載體NC，設(shè)置miR-433-3p過表達(dá)、陰性對照、空白對照3個組，分別將2組載體和雙熒光素酶報告載體利用lipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染至miR-433-3p過表達(dá)、陰性對照組的HEK-293T細(xì)胞中，空白對照組中的HEK-293T細(xì)胞正常培養(yǎng)，之后分別檢測3組細(xì)胞中的熒光活性，得到螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參計算螢火蟲熒光素酶的相對活性。便于了解miR-433-3p和在綿羊前體脂肪細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，對采取的綿羊尾部前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)。用過表達(dá)miR-433-3p的方法探索miR-433-3p在綿羊前體脂肪細(xì)胞中對的調(diào)控，提取過表達(dá)miR-433-3p前后細(xì)胞的總RNA和總蛋白，利用RT-qPCR檢測過表達(dá)miR-433-3p前后的miR-433-3p和mRNA的表達(dá)量、以及利用Western blotting技術(shù)檢測BCKDHB在過表達(dá)前后的蛋白水平。為了解綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中和miR-433-3p表達(dá)量的變化，用RT-qPCR檢測前體脂肪細(xì)胞分化過程中和miR-433-3p的時序表達(dá)。為增加結(jié)果的可信度，還對分化過程中不同時段的細(xì)胞進(jìn)行了照片采集和油紅O染色。miR-433-3p在3′-UTR的第8—28個堿基處存在理論上的結(jié)合位點(diǎn)。通過比較過表達(dá)組，陰性對照組，對照組的相對熒光活性發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-433-3p后，3′-UTR重組雙熒光載體的相對熒光活性降低（<0.01），說明miR-433-3p可以與3′-UTR特異性結(jié)合，驗(yàn)證了預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在綿羊前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)miR-433-3p后，通過比較過表達(dá)組和陰性對照組的mRNA和蛋白的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組mRNA和蛋白的相對表達(dá)量低于陰性對照組（<0.05），說明miR-433-3p在綿羊前體脂肪細(xì)胞中對有負(fù)調(diào)控作用。在誘導(dǎo)綿羊前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的過程中，從采集到的圖片和油紅O染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)此過程中脂滴聚積得越來越多，油紅O染色驗(yàn)證了脂滴的聚集。另外，在分化過程中檢測到miR-433-3p和mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果充分說明miR-433-3p通過與3′-UTR的結(jié)合負(fù)調(diào)節(jié)該基因及其編碼蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究調(diào)節(jié)綿羊脂肪代謝的分子機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

miR-433-3p；；綿羊；前體脂肪細(xì)胞；細(xì)胞分化

0 引言

【研究意義】支鏈酮酸脫氫酶β（branched chain keto acid dehydrogenase β,）是支鏈氨基酸轉(zhuǎn)化為支鏈脂肪酸的重要催化劑，是脂肪組織代謝中的重要調(diào)控因子[1]。MicroRNAs（miRNAs）是一類由19—22個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，通過自身種子序列與靶基因特定位點(diǎn)的堿基配對，造成mRNA的降解，或者抑制mRNA的翻譯[2]。很多生物信息學(xué)軟件可根據(jù)靶基因序列預(yù)測理論上有結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs[3]。筆者前期試驗(yàn)通過在線軟件預(yù)測得到miR-433-3p與的靶標(biāo)關(guān)系，然而目前關(guān)于miR-433-3p的研究多是關(guān)于癌癥的發(fā)生和發(fā)展[4]。本研究旨在探討miR-433-3p與的靶標(biāo)關(guān)系及其對綿羊前體脂肪細(xì)胞分化的影響?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)miRNAs調(diào)控脂肪代謝的研究已有報道。例如，miR-103可加速甘油三酯的積聚，miR-107在肥胖大鼠中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)脂肪生成[5]；miR-758表達(dá)下調(diào)，可導(dǎo)致（ATP binding cassette subfamily A member 1）基因表達(dá)量降低，減少膽固醇的聚集[6]；miR-302a參與肝臟脂肪酸代謝[7]；miR-27a/b促進(jìn)脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase， LPL）的表達(dá)[8]；過表達(dá)miR-122會導(dǎo)致膽固醇和脂肪酸代謝的紊亂[9]。MiR-143通過下調(diào)（mitogen-activated protein kinase 5）基因抑制前體脂肪細(xì)胞的分化[10]。MiR-1、miR-206和miR-133在白色脂肪組織和棕色脂肪組織間也存在差異表達(dá)[11]。這些研究表明miRNAs在調(diào)控脂肪代謝中發(fā)揮重要功能。參與支鏈氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橹ф溨舅岬倪^程和丙酸代謝反應(yīng)，并在通路分析過程中發(fā)現(xiàn)基因參與脂肪代謝[12]。筆者前期的研究初步發(fā)現(xiàn)，miR-433-3p與綿羊的3′-UTR有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。所以推測，在綿羊脂肪細(xì)胞中miR-433-3p可以調(diào)控的表達(dá)。然而，miR-433-3p對脂肪代謝相關(guān)基因的調(diào)控研究未見報道。已有的報道表明，miR-433-3p可負(fù)向調(diào)控腫瘤相關(guān)基因參與癌癥的發(fā)生[13]，或作用于（nonsense mediated mRNA decay factor）的3′ UTR參與非線粒體衍生物（no mitochondrial derivative, NMD）通路[14]，或通過結(jié)合（runt related transcription factor 2）mRNA抑制由（bone morphogenetic protein 2）誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化等[15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對在支鏈氨基酸代謝通路中的作用已經(jīng)明確，但miR-433-3p對的靶向作用尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在研究綿羊前體脂肪細(xì)胞中miR-433-3p對的調(diào)控。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-433-3p與綿羊的靶標(biāo)關(guān)系，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗(yàn)證靶標(biāo)關(guān)系。將miR-433-3p過表達(dá)合成物（Mimics）轉(zhuǎn)染到綿羊前體脂肪細(xì)胞中。檢測mRNA和蛋白的表達(dá)量。對綿羊前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，對分化過程中脂滴的積累進(jìn)行鑒定，并分析miR-433-3p和表達(dá)量的變化。由此，可解析miR-433-3p調(diào)控的表達(dá)機(jī)制，并為進(jìn)一步研究miR-433-3p在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 生物試劑 引物、miRNA Mimics、miRNA NC（negative control）購自上海生工有限公司；DMEM/F12購自Hyclone；胎牛血清購自四季青公司；快速瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒、pUC-T質(zhì)粒、PAGE制膠試劑、ECL發(fā)光液購自北京康為世紀(jì)有限公司；Trizol購自Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；50×TAE、LB固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司；哺乳動物全蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自江蘇凱基生物公司；限制性內(nèi)切酶I及I、RT-PCR Kit購自Takara公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；用于Western blotting的抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)樣品的采集 采集約4月齡綿羊的尾部脂肪組織用于試驗(yàn)研究。采集過程為：用無菌的剪刀、鑷子剪下大小適中的尾部脂肪組織塊（太谷縣羊肉加工屠宰廠），在裝有含1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的無菌PBS的培養(yǎng)皿中沖洗，浸泡于15 mL離心管中。置于冰盒暫存，1 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。本研究所有試驗(yàn)均于2016年6月到2017年3月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室完成，其中測序工作由華大基因生物科技有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靶標(biāo)關(guān)系預(yù)測 用TargetScan、miRanda和DIANA-microT3個軟件對進(jìn)行miRNAs的預(yù)測。挑選miRSVR score（miR support vector regression score）在0.7及其以上的miRNAs，便于進(jìn)一步篩選并保證結(jié)果的可靠性。并使用Bioinformatics & Evolutionary Genomics在線軟件制作韋恩圖得到3個軟件預(yù)測的交集miRNAs。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank公布的綿羊序列，利用Primer 5.0設(shè)計3′-UTR和CDS（coding sequence）引物。根據(jù)miRNABase公布的miR-433-3p的成熟序列，設(shè)計miR-433-3p的引物。內(nèi)參引物采用公布的和U6引物序列。所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

F：上游引物；R：下游引物 F: Forward; R: Reverse

1.2.3 目的片段擴(kuò)增與克隆 根據(jù)設(shè)計的引物，對3′-UTR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。體系為7.6 μL的2×Taq master mix，6 μL的ddH2O，上下游引物各0.6 μL，1 μL的cDNA。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。紫外照射下找出與設(shè)計的PCR產(chǎn)物相同長度的目的片段，割膠回收并純化目的片段。

將純化的目的DNA過夜連接至pUC-T質(zhì)粒中。連接體系為：1 μL的pUC-T質(zhì)粒，4 μL的目的片段和5 μL的2×Solution Buffer。連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，并涂至LB固體培養(yǎng)基（提前吸收完全藍(lán)白斑篩選的和IPTG）進(jìn)行菌落的過夜培養(yǎng)。待出現(xiàn)藍(lán)白斑后，進(jìn)行白斑的篩選，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中搖菌。之后進(jìn)行保菌，并送公司測序。

1.2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建及雙酶切鑒定 將上述連有目的片段并測序正確的克隆載體pUC-T和Pmir-GLO（雙熒光素酶報告基因載體）重組，構(gòu)建雙熒光素酶報告載體，以3 μL的Pmir-GLO、5 μL 的DNA片段（已連接pUC-T）、1 μL 的T4連接酶和1 μL的T4 Buffer為連接體系。過夜連接后進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化后，均勻涂至LB固體培養(yǎng)基（完全吸收氨芐）進(jìn)行菌落的過夜培養(yǎng)。待出現(xiàn)白斑后，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中搖菌。進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證陽性單克隆載體，并送公司測序。

對構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系為：10×QuickCut Buffer 5 μL，DNA插入片段1 μg，QuickCutI及I各1 μL。輕輕混勻后瞬時離心，并在37°C下保溫2 h。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) 以含20%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/F12為培養(yǎng)基，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)綿羊前體脂肪細(xì)胞。并以10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/High glucose的培養(yǎng)基將HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.6 共轉(zhuǎn)染驗(yàn)證靶標(biāo)關(guān)系 用LipofectmineTM3000轉(zhuǎn)染試劑分3組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：過表達(dá)組（Mimics組），轉(zhuǎn)染目的片段的重組質(zhì)粒和miR-433-3p mimics；陰性對照組（NC組），轉(zhuǎn)染目的片段的重組質(zhì)粒和NC；空白對照組（Blank組），僅轉(zhuǎn)染含目的片段的重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染用量參照LipofectmineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書。轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測細(xì)胞的熒光活性。

1.2.7 單轉(zhuǎn)染后基因和蛋白的表達(dá) 用LipofectmineTM3000轉(zhuǎn)染試劑分2組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即過表達(dá)組（Mimics組）和陰性對照組（NC組）。轉(zhuǎn)染36 h后，Trizol裂解細(xì)胞提取總RNA，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)染48 h后，使用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白。

一步法反轉(zhuǎn)錄的cDNA用于miR-433-3p的RT-qPCR定量分析。兩步法反轉(zhuǎn)錄的cDNA用于的定量分析，反應(yīng)體系參照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。對miR-433-3p及進(jìn)行RT-qPCR定量分析，反應(yīng)體系參照Takara RT-qPCR試劑盒說明書。

BCKDHB蛋白量用Western blotting檢測。使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，冰上轉(zhuǎn)膜1 h，脫脂奶粉封閉1 h。PBST稀釋3 000倍的一抗（兔源）過夜孵育，PBST稀釋1 000倍的二抗（驢抗兔）孵育1 h。用PBST清洗2—3遍后對硝酸纖維素膜（NC膜）上的蛋白條帶進(jìn)行ECL曝光顯影。

1.2.8 綿羊前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 用完全培養(yǎng)基DMEM/F12（10%胎牛血清，1%雙抗）培養(yǎng)綿羊前體脂肪細(xì)胞2 d。待細(xì)胞融合度達(dá)80%—90%以后，更換為分化培養(yǎng)基（89% DMEM F12，10%胎牛血清，1%雙抗，250mmol·L-1IBMX，500mM DEX，8mmol·L-1胰島素），為試驗(yàn)周期的第0、2天后改用維持培養(yǎng)基（89% DMEM/F12，10%胎牛血清，1%雙抗，10mmol·L-1胰島素）繼續(xù)培養(yǎng)4 d。

1.2.9 油紅O染色 0.5 g油紅O干粉溶于少量異丙醇中，定容至100 mL，過濾后與ddH2O以3:2的比例混合最大轉(zhuǎn)速離心5 min除去沉淀，制成油紅O工作液。分化2，4，6 d的細(xì)胞每孔加入10%甲醛溶液，過夜固定。用60%異丙醇浸泡細(xì)胞5 min后，加入油紅O工作液染色10 min。最后用ddH2O清洗4次，在倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel整理，使用SPSS19.0軟件對共轉(zhuǎn)染組以Mimics、NC、Blank處理組為變量進(jìn)行方差分析，以Mimics、NC組為變量對單轉(zhuǎn)染組中表達(dá)量進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，對分化過程中和miR-433-3p在0、2、4、6 d的表達(dá)量分別進(jìn)行多重比較的方差分析。使用GraphPad Prism 6.0制作試驗(yàn)結(jié)果中重組質(zhì)粒熒光活性和過表達(dá)miR-433-3p后miR-433-3p、表達(dá)量的直方圖，以及誘導(dǎo)分化過程中miR-433-3p和表達(dá)量的折線圖。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測的靶標(biāo)關(guān)系

基于序列，在miRSVR score為0.7時，用TargetScan、miRanda和DIANA- microT分別預(yù)測到41、4和313個miRNAs。圖1顯示的是這些軟件預(yù)測到的3個共同miRNAs，即miR-433-3p、miR-132-3p和miR-212-3p。3個miRNA與均有較高的A-U互補(bǔ)位點(diǎn)。miR-433-3p與的3′ UTR的第8—28個堿基有結(jié)合位點(diǎn)，miR-132-3p和miR-212-3p在第201—220個堿基有結(jié)合位點(diǎn)，但miR-132-3p本課題組已有研究，且miR-132-3p和miR-212-3p與3′-UTR有相同的結(jié)合位點(diǎn)，有相似堿基序列。所以本試驗(yàn)將miR-433-3p作為研究對象。

圖1 TargrtScan，miRanda和DIANA-microT軟件預(yù)測的與BCKDHB 3￠-UTR結(jié)合的miRNAs

2.2 構(gòu)建的重組質(zhì)粒

以構(gòu)建的含目的片段和Pmir-GLO重組質(zhì)粒菌液為模板，對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到138 bp的目的片段，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR、雙酶切鑒定。同時，公司測序結(jié)果驗(yàn)證了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。

M：DL2000 marker；1：重組雙熒光質(zhì)粒菌液PCR鑒定；2：重組雙熒光質(zhì)粒的雙酶切鑒定；3：正常雙熒光質(zhì)粒電泳

2.3 雙熒光素酶活性

熒光活性檢測結(jié)果表明，過表達(dá)組Pmir-GLO重組質(zhì)粒的熒光活性（2.54±0.26）顯著低于（<0.01）陰性對照組（4.67±0.24）和空白對照組（5.85±0.13），而陰性對照組與空白對照組間的熒光活性無顯著差異。由此說明，miR-433-3p與3′-UTR有靶標(biāo)關(guān)系（圖3）。

NC：陰性對照組；Mimics: 過表達(dá)miR-433-3p；Blank：空白對照組；

2.4 過表達(dá)miR-433-3p后BCKDHB的表達(dá)量

圖4給出的是過表達(dá)組和陰性對照組的miR-433-3p和的表達(dá)量。組內(nèi)比較表明，miR-433-3p表達(dá)量高時，無論是對照組還是過表達(dá)組的表達(dá)量低；反之，的表達(dá)量則高。組間比較表明，過表達(dá)組miR-433-3p的表達(dá)量（4.89±0.32）高于陰性對照組（0.69±0.15）（<0.01），表明成功過表達(dá)了miR-433-3p；而過表達(dá)組的表達(dá)量（0.25±0.02）低于陰性對照組（1.03±0.02）（<0.01），表明過表達(dá)miR-433-3p后，綿羊前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低。這些結(jié)果充分說明miR-433-3p負(fù)調(diào)控的表達(dá)。

2.5 過表達(dá)miR-433-3p后BCKDHB蛋白的表達(dá)量

圖5給出的是轉(zhuǎn)染48 h后收取的細(xì)胞進(jìn)行的Western blotting定量分析?？梢姡^表達(dá)組的BCKDHB蛋白表達(dá)量低于陰性對照組（<0.05）。這一結(jié)果說明，過表達(dá)miR-433-3p下調(diào)mRNA表達(dá)的同時，也下調(diào)了BCKDHB蛋白的表達(dá)。

NC：陰性對照；Mimics：過表達(dá)miR-433-3p

2.6 BCKDHB及miR-433-3p表達(dá)對脂肪細(xì)胞分化的影響

綿羊前體脂肪細(xì)胞分化2 d的細(xì)胞形態(tài)如圖6-A所示，視野中有少量脂滴聚積；圖6-B給出的是分化4 d時的細(xì)胞形態(tài)，視野中脂滴數(shù)量相對于2 d有所增多；當(dāng)分化到6 d時，如圖6-C所示，有大量的脂滴聚積。圖7給出的3張圖分別為綿羊前體脂肪細(xì)胞分化2，4，6 d時的油紅O染色，可以看到隨著細(xì)胞的分化進(jìn)程，染色的脂滴數(shù)越來越多，脂滴形態(tài)也逐漸增大。以上結(jié)果說明綿羊前體脂肪細(xì)胞逐漸分化成成熟的脂肪細(xì)胞。

NC：陰性對照；Mimics：過表達(dá)miR-433-3p；β-actin：內(nèi)參

A：分化2天的前體脂肪細(xì)胞細(xì)胞；B：分化4天的前體脂肪細(xì)胞；C：分化6天的前體脂肪細(xì)胞

A：分化兩天后油紅O染色的前體脂肪細(xì)胞細(xì)胞；B：分化4天后油紅O染色的前體脂肪細(xì)胞；C：分化6天后油紅O染色的前體脂肪細(xì)胞

圖8給出的是綿羊前體脂肪細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化，在0、2、4、6 d和miR-433-3p的表達(dá)量。結(jié)果顯示，綿羊前體脂肪細(xì)胞在胰島素的刺激下開始分化，在0 d（0.88±0.02）—2 d（0.98±0.01）間表達(dá)量逐漸上升。隨著維持分化培養(yǎng)基中胰島素濃度的升高，的表達(dá)量從2—4 d（1.21±0.01）過程中快速上升。之后生成的脂滴積累，從4—6 d（1.31±0.02）緩慢上升，的表達(dá)量趨于平穩(wěn)。miR-433-3p的表達(dá)量在脂肪開始分化0 d（1.29±0.01）—2 d（1.11±0.01）快速下降，到6 d（0.89±0.02）脂肪積累增多時平穩(wěn)下降。這些結(jié)果說明，在綿羊前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，miR-433-3p和基因存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖8 BCKDHB和miR-433-3p在不同分化天數(shù)中的表達(dá)變化

3 討論

經(jīng)預(yù)測的與3′-UTR結(jié)合的miRNAs有3個。其中，miR-132-3p和miR-212-3p的序列分別為：5′-UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG-3′和5′-UAAC AGUCUCCAGUCACG -3′。即這兩個miRNAs有相同的成熟序列，且在種子區(qū)有8個相同的堿基，說明二者為基因簇，并有相似的功能[16]。本課題組已就miR-132-3p對的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了研究，試驗(yàn)還在進(jìn)行中，還未做出結(jié)果。因此，本文研究miR-433-3p對的調(diào)控機(jī)制，miR-132-3p與miR-433-3p是否共同影響B(tài)CKDHB的表達(dá)還需后續(xù)進(jìn)一步的研究。

MiR-433-3p在其他物種中也有重要的調(diào)控作用。MiR-433-3p在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著廣泛的作用很早就有研究報道，并對人類腦膠質(zhì)瘤中miR-433-3p和miR-433-5p的作用做出了探究，發(fā)現(xiàn)miR-433-3p可負(fù)調(diào)控控制膠質(zhì)瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，以此推測miR-433-3p可作為一個潛在的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的標(biāo)識和診斷對象[17-18]。在HeLa細(xì)胞中，miR-433-3p負(fù)向調(diào)控（胸苷酸和酶）對5-氟尿嘧啶的敏感性抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[19]。miR-433- 3p還抑制人肝癌細(xì)胞的遷移和造血干細(xì)胞生長增生引起的骨髓增生性的腫瘤發(fā)生[20-21]。也有報道說明，在鼠中miR-433-3p通過靶向調(diào)控（成骨分化基因）調(diào)控成骨細(xì)胞的分化[22]。本試驗(yàn)主要研究miR-433-3p在綿羊前體脂肪細(xì)胞中對的調(diào)控作用。

基因表達(dá)受復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。關(guān)于miRNA對的表達(dá)調(diào)控研究已有報道。例如，在大鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-277，可抑制的表達(dá)，阻礙支鏈氨基酸的分解，抑制脂肪的生成[23]。本研究中，過表達(dá)miR-433-3p，導(dǎo)致表達(dá)量下降。這些研究說明，的表達(dá)不只受單個miRNA的調(diào)控。此外，表達(dá)還受上游基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶基因是的上游基因，敲除后，可促進(jìn)在小鼠性腺周圍脂肪中的表達(dá)，加速支鏈脂肪酸的生成，導(dǎo)致血液中的支鏈氨基酸濃度比正常濃度低，同時也導(dǎo)致了邊緣脂肪組織中BCKDHB的表達(dá)量上升[24-26]。在BCAA代謝通路中和參與的生化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，通過營養(yǎng)調(diào)控在日糧中添加亮氨酸提高的表達(dá)，從而導(dǎo)致的消耗增加，相對表達(dá)量下降[26-28]。另外，過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。攝入大量的PPARγ配體，可提高的轉(zhuǎn)錄活性，提高其表達(dá)量[29]，與前人研究結(jié)果類似，本研究改變了調(diào)控的因素miR-433-3p，結(jié)果抑制了的表達(dá)。

本研究中，與miR-433-3p在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化中的表達(dá)有一定的相關(guān)性，即前者隨細(xì)胞分化表達(dá)量提高，后者則表達(dá)量降低。在已有的報道中，對3T3-L1前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化0—6 d，表達(dá)量逐漸上升，利用PPARγ配體和羅格列酮（RSG）處理促進(jìn)細(xì)胞分化，顯著提高了的表達(dá)量[24]。這一趨勢與本研究中的表達(dá)趨勢一致，但其未檢測調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)情況。Chavali等報道，miR-433-3p在小鼠前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)量也隨分化時間而下降[29]。這一結(jié)果與本文中的miR-433-3p表達(dá)趨勢一致。說明miR-433-3p通過調(diào)節(jié)靶基因影響脂肪細(xì)胞分化。此外，過表達(dá)miR-433-3p會抑制成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志基因的表達(dá)量[15]，說明miR-433-3p還影響成骨細(xì)胞的分化。

4 結(jié)論

經(jīng)理論預(yù)測，miR-433-3p與的3￠-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)；經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，過表達(dá)miR-433-3p會抑制BCKDHB基因和蛋白的表達(dá)；在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化中，二者存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果充分說明與miR-433-3p間的靶標(biāo)關(guān)系，為進(jìn)一步研究調(diào)節(jié)綿羊脂肪代謝的分子機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

[1] ZIMMERMAN H A, OLSON KC, CHEN G, LYNCH C J. Adipose transplant for inborn errors of branched chain amino acid metabolism in mice., 2013, 109(4): 345-353.

[2] BARTEL D P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions., 2009, 136(2): 215-233.

[3] 吳正常, 殷學(xué)梅, 孫麗, 夏日煒, 霍永久, 吳圣龍, 包文斌. 豬miR-192/-215的組織表達(dá)譜及其關(guān)鍵靶基因的分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(11): 2251-2261.

WU Z C, YIN X M, SUN L, XIA R W, HUO Y J, WU S L, BAO W B. Tissue expression profile and key target genes analysis of pocrcine miR-192 and miR-215., 2015, 48(11): 2251-2261. (in Chinese)

[4] SUN Y, WANG F, WANG L, JIAO Z, FANG J, LI J. MicroRNA-433 regulates apoptosis by targeting PDCD4 in human osteosarcoma cells., 2017, 14(2): 2353-2358.

[5] POLSTER B J, WESTAWAY S K, NGUYEN T M, YOON M Y, HAYFLICK S J. Discordant expression of miR-103/7 and pantothenate kinase host genes in mouse., 2010, 101(2-3): 292-295.

[6] HOZOJI M, MUNEHIRA Y, IKEDA Y, MAKISHIMA M, MATSUO M, KIOKA N, UEDA K. Direct interaction of nuclear liver X receptor-beta with ABCA1 modulates cholesterol efflux., 2008, 283(44): 30057-30063.

[7] HOEKSTRA M, VAN DER SLUIS R J, KUIPER J, VAN BERKEL T J. Nonalcoholic fatty liver disease is associated with an altered hepatocyte microRNA profile in LDL receptor knockout mice., 2012, 23(6): 622-628.

[8] WANG T, LI M, GUAN J, LI P, WANG H, GUO Y, SHUAI S, LI X. MicroRNAs miR-27a and miR-143 regulate porcine adipocyte lipid metabolism., 2011, 12(11): 7950-7959.

[9] PEAR M, WATTS L, BOOTEN S L, GRAHAM M, MCKAY R, SUBRAMANIAM A, PROPP S, LOLLO B A, FREIER S, BENNETT C F, BHANOT S, MONIA B P. MiR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting., 2006, 3(2): 87-98.

[10] NAKANISHI N, NAKAGAWA Y, TOKUSHIGE N, AOKI N, MATSUZAKA T, ISHII K, YAHAGI N, KOBAYASHI K, YATOH S, TAKAHASHI A, SUZUKI H, URAYAMA O, YAMADA N, SHIMANO H. The up-Regulation of microRNA-335 is associated with lipid metabolism in liver and white adipose tissue of genetically obese mice., 2009, 385(4): 492-496.

[11] WALDEN T B, TIMMONS J A, KELLER P, NEDERGAARD J, CANNON B. Distinct expression of muscle-specific microRNAs (myomirs) in brown adipocytes., 2009, 8(2): 44-49.

[12] HERMAN M A, SHE P, PERONI O D, LYNCH C J, KAHN B B.Adipose tissue branched chain amino acid (BCAA) metabolism modulates circulating BCAA levels., 2010, 285(15): 11348-11356.

[13] 羅紅春. 胃癌miRNA表達(dá)譜及胃癌中顯著下調(diào)的miR-9和miR-433的功能研究[D]. 重慶：重慶醫(yī)科大學(xué), 2010.

LUO H C. MiRNAs expression profiling of gastric carcinoma and function of significantly down-regulated miR-9 and miR-433[D]. Chongqing：Chongqing Medical University, 2010.(in Chinese)

[14] 張芳. 調(diào)節(jié)NMD通路中SMG5的miR-433的鑒定及miRNA-NMD作用底物調(diào)控通路的初步研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

ZHANG F. Identification of miR-433 that regulate SNG5 in NMD pathway and preliminary study on miRNA-NMD-substrate regulatory pathway[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University, 2014.(in Chinese)

[15] KIM E J, KANG I H, LEE J W, JANG W G, KOH J T. MiR-433 mediates ERRγ-suppressed osteoblast differentiation via direct targeting to Runx2 mRNA in C3H10T1/2 cells., 2013, 92(10): 562-568.

[16] XIA L, LI D, LIN C, OU S, LI X, PAN S. Comparative study of joint bioinformatics analysis of underlying potential of 'neurimmiR', miR-212-3P/miR-132-3P, being involved in epilepsy and its emerging role in human cancer., 2017: 16541.

[17] VAN MEIR E G, HADJIPANAYIS C G, NORDEN A D, SHU H K, WEN P Y, OLSON J J. Exciting new advances in neuro-oncology: the avenue to a cure for malignant glioma., 2010, 60(3): 166-193.

[18] SUN S, WANG X, XU X, DI H, DU J, XU B, WANG Q, WANG J. MiR-433-3p suppresses cell growth and enhances chemosensitivity by targeting CREB in human glioma., 2017, 8(3): 5057-5068.

[19] GOTANDA K, HIROTA T, MATSUMOTO N, IEIRI I. MicroRNA-433 negatively regulates the expression of thymidylate synthase (TYMS) responsible for 5-fluorouracil sensitivity in HeLa cells., 2013, 13: 369.

[20] YANG Z, TSUCHIYA H, ZHANG Y, HARTNETT M E, WANG L. MicroRNA-433 inhibits liver cancer cell migration by repressing the protein expression and function of cAMP response element-binding protein., 2013, 288(40): 28893-28899.

[21] LIN X, RICE K L, BUZZAI M, HEXNER E, COSTA F F, KILPIVAARA O, MULLALLY A, SOARES M B, EBERT B L, LEVINE R, LICHT J D. miR-433 is aberrantly expressed in myeloproliferative neoplasms and suppresses hematopoietic cell growth and differentiation., 2013, 27(2): 344-352.

[22] TANG X, LIN J, WANG G, LU J. MicroRNA-433-3p promotes osteoblast differentiation through targeting DKK1 expression., 2017, 12(6): e0179860.

[23] ESSLINGER S M, SCHWALB B, HELFER S, MICHALIK K M, WITTE H, MAIER K C, MARTIN D, MICHALKE B, TRESCH A, CRAMER P, F?RSTEMANN K. Drosophila miR-277 controls branched-chain amino acid catabolism and affects lifespan., 2013, 10(6): 1042-1056.

[24] MAGKOS F, BRADLEY D, SCHWEITZER G G, FINCK B N, EAGON J C, ILKAYEVA O, NEWGARD C B, KLEIN S. Effect of Roux-en-Y gastric bypass and laparoscopic adjustable gastric banding on branched-chain amino acid metabolism., 2013, 62(8): 2757-2761.

[25] LIU R, LI H, FAN W, JIN Q, CHAO T, WU Y, HUANG J, HAO L, YANG X. Leucine supplementation differently modulates branched- Chain amino acid catabolism, mitochondrial function and metabolic profiles at the different stage of insulin resistance in rats on high-fat diet., 2013, 62(8): 2757-2761.

[26] PRADA P O, HIRABARA S M, DE SOUZA C T, SCHENKA A A, ZECCHIN H G, VASSALLO J, VELLOSO L A, CARNEIRO E, CARVALHEIRA J B, CURI R, SAAD M J. L-glutamine supplementation induces insulin resistance in adipose tissue and improves insulin signalling in liver and muscle of rats with diet-induced obesity., 2007, 50(9): 1949-1959.

[27] ZHAO X, HAN Q, LIU Y, SUN C, GANG X, WANG G. The relationship between branched-Chain amino acid related metabolomic signature and insulin resistance: A systematic review., 2016, 2794591.

[28] SHE P, REID T M, BRONSON S K, VARY T C, HAJNAL A, LYNCH C J, HUTSON S M. Disruption of BCATm in mice leads to increased energy expenditure associated with the activation of a futile protein turnover cycle., 2007, 6 (3): 181-194.

[29] BOULET M M, CHEVRIER G, GRENIER-LAROUCHE T, PELLETIER M, NADEAU M, SCARPA J, PREHN C, MARETTE A, ADAMSKI J, TCHERNOF A. Alterations of plasma metabolite profiles related to adipose tissue distribution and cardiometabolic risk., 2015, 309 (8): E736-E746.

[30] CHAVALI V, TYAGI S C, MISHRA P K. Differential expression of dicer, miRNAs, and inflammatory markers in diabetic Ins2+/- Akita hearts., 2014, 68(1): 25-35.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Regulation of theGene Expression by miR-433-3p in Ovine Preadipocytes

YAN XiaoRu1, SHI Tao1, PAN YangYang1, JING JiongJie1, CHENG LiFen2, CAO NingXian2,QIAO LiYing1, LIU WenZhong1

(1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Division of Animal and Poultry Breeding, Department of Agriculture of Shanxi Province, Taiyuan 030001)

This study aims to reveal the target relationship between miR-433-3p andby theoretical prediction and experimental verification approaches.The binding site between miR-433-3p andwas predicted by three bioinformatics softwares including TargetScan、miRanda and DIANA-microT based on the sequence of. In order to get the target fragment the primersof3′-UTR were designed for PCR amplification. Double digestion withI andI was performed with vector Pmir-GLO and target fragments, which were then ligated with T4 enzyme to obtain the recombinant dual-luciferase expression plasmid. Two vectors of mimics and NC were commercially available. One experimental (overexpressing miR-433-3p) and two control groups (negative and blank) were set. By using LipofectamineTM3000 reagent the dual-luciferase vector was co-transfected with the commercially obtained vectors into HEK-293T cells of overexpressing-miR-433-3p and negative groups, respectively. And the cells of blank group were cultured normally. Subsequently, their relative luciferase activities were detected, with renilla luciferase activity as the control. Ovine preadipocytes were culturedto study the interacting relationship of miR-433-3p and BCKDHB in the differentiated preadipocytes. MiR-433-3p overexpression was adopted to study its regulating function to BCKDHB by detecting RNA quantity of miR-433-3p and BCKDHB as well as protein quantity of BCKDHB before and after miR-433-3p overexpression in ovine preadipocyte.RT-qPCR was carried out to detect the temporal expression dynamics ofand miR-433-3p in the differentiation process of ovine preadipocytes . In order to increase the reliability of the results, we also carried out photo collection and oil red O staining at different stages during the differentiation of ovine preadipocytes.The results showed that miR-433-3p had a theoretical binding site at the 8~28 bases of3′-UTR. We found miR-433-3p overexpression significantly (<0.01)decreased luciferase activity of the recombinant double fluorescent plasmid by comparing the relative fluorescence activity of the overexpression, the negative and the blank groups, indicating that miR-433-3p could bind to the 3′-UTR, which verified the correctness of our prediction. Overexpressed miR-433-3p inhibited the expressions ofat both mRNA (<0.01) and protein (<0.05) levels in ovine preadipocyte. The expression of miR-433-3p correlated negatively with that ofin the process of ovine preadipocyte differentiation. Cellular photos and the oil red O analysis showed lipid droplets accumulated in the differentiation of ovine preadipocytes.These results indicated that miR-433-3p negatively regulated the expression ofand its coding protein by binding to the 3′-UTR, which provided a scientific basis for further research on the molecular mechanism ofin regulating fat metabolism in sheep.

miR-433-3p;; ovine; preadipocytes; cell differentiation

2017-06-20；

國家自然科學(xué)基金（31372292）、山西優(yōu)勢肉用家畜高效安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目

接受日期：2017-09-29

聯(lián)系方式：閆曉茹，E-mail：gogogoxr@126.com。通信作者劉文忠，Tel：0354-6288337；E-mail：tglwzyc@163.com