王權(quán)，王佳音，朱瀚，左金玉，劉東陽，沈其榮

?

霍氏腸桿菌B4表面活性劑純化鑒定及其應(yīng)用

王權(quán)，王佳音，朱瀚，左金玉，劉東陽，沈其榮

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室/江蘇省有機固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210095）

優(yōu)化霍氏腸桿菌B4產(chǎn)表面活性劑的液體發(fā)酵條件，結(jié)合有機試劑萃取、高效液相色譜技術(shù)分離純化所產(chǎn)表面活性劑，并利用質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)，進一步研究其促進黃瓜吸收葉面肥的效果，為新型肥料的研制提供理論依據(jù)。利用正交試驗優(yōu)化霍氏腸桿菌B4產(chǎn)表面活性劑的發(fā)酵條件，主要包括碳源、氮源、初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、轉(zhuǎn)數(shù)和發(fā)酵時間，不同處理的評價指標為發(fā)酵液的表面張力值，具有最低表面張力的處理為最佳的發(fā)酵條件；利用有機試劑萃取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得表面活性劑的粗提物；利用高效液相色譜技術(shù)，在柱溫50℃、進樣量為20 μL、流速0.5 mL·min-1、檢測波長為210 nm條件下分離純化表面活性劑，并結(jié)合傅里葉紅外光譜技術(shù)分析其所含的不同官能團；在流速10 μL·min-1、毛細管電壓3.88 kV、錐孔電壓為53 V、離子源溫度100℃、脫溶溫度150℃條件下，利用質(zhì)心模式進行全掃描，根據(jù)已有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定所產(chǎn)表面活性劑的結(jié)構(gòu)；通過水培和盆栽試驗，驗證該表面活性劑提高黃瓜吸收葉面肥的效率。正交試驗結(jié)果表明，在添加4%（v/v）甘油、3 g·L-1硝酸鈉、初始pH 6.0、6%接種量、35℃、200 r/min、發(fā)酵96 h的條件下，發(fā)酵液的表面張力下降到44.10 mN·m-1，為最優(yōu)的發(fā)酵優(yōu)化條件。在該優(yōu)化條件下，生物表面活性劑的粗產(chǎn)物產(chǎn)量高達12.14 g·L-1，粗產(chǎn)物可使純水的表面張力值最低降到34.14 mN·m-1。液相分離結(jié)果表明，經(jīng)有機試劑萃取粗提的生物表面活性劑在1.62—2.33 min處有典型的特征峰，說明該組分為生物表面活性劑粗提物中的主要成分。傅里葉紅外光譜分析結(jié)果表明，純化的生物表面活性劑中含有-CH2、-CO和C-O等官能團，判斷其為含碳鏈的生物表面活性劑。液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果表明，m/z 701.54處為[M+Na]+，m/z 723.74處為[M-H+2Na]+，將該生物表面活性劑鑒定為鼠李糖脂，其結(jié)構(gòu)式為Rha-Rha-C10-C12。黃瓜水培結(jié)果表明，與只噴清水（CK）和只噴氨基酸（AA）的處理相比，添加生物表面活性劑的氨基酸葉面肥處理（AAB）的株高分別增加了79.59%和32.90%，鮮重分別增加了43.03%和23.98%。盆栽試驗結(jié)果表明，與CK和AA處理相比，AAB處理的植株葉綠素含量分別提高了11.72%和10.69 %。利用正交試驗獲得了霍氏腸桿菌B4產(chǎn)生物表面活性劑最佳液體發(fā)酵條件，在該條件下生物表面活性劑產(chǎn)量達到2.07 g·L-1，并將其主要成分鑒定為鼠李糖脂（Rha-Rha-C10-C12），該物質(zhì)可顯著提高黃瓜對葉面肥的吸收效率，具有很好的應(yīng)用前景。

霍氏腸桿菌；生物表面活性劑；優(yōu)化；葉面肥

0 引言

【研究意義】生物表面活性劑是微生物代謝產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)各異且具有表面活性的物質(zhì)，根據(jù)其生化特性和分子量等參數(shù)，通?？梢苑譃樘侵⒘字椭舅?、脂肽或脂蛋白、高分子表面活性劑和顆粒表面活性劑等幾大類[1]。表面活性劑都具有改變界面狀態(tài)的作用，在溶劑中加入很少量時，能夠顯著降低固、液、氣界面間的界面張力，從而產(chǎn)生潤濕或者反潤濕、乳化或者破乳、分散或者凝集、起泡或者消泡、以及增溶等一系列作用[2]。由于日益嚴重的環(huán)境問題，人們將更多的目光投向了生物表面活性劑。因為生物表面活性劑毒性低、易降解，且在強酸、強堿，濃鹽，極限溫度下仍具有表面活性[3-4]。更重要的是其高效性，具有低臨界膠束濃度，卻能表現(xiàn)出很高的表面活性[4]。因此生物表面活性劑在石油、采礦、食品、化妝品、造紙、紡織、涂料、節(jié)能技術(shù)、洗滌保潔、精細化工生產(chǎn)以及陶瓷工業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用?！厩叭搜芯窟M展】大量的研究表明，生物表面活性劑結(jié)構(gòu)上是一個兩性分子，通常含有一個親水基團和一個疏水基團，疏水部分有很多飽和或不飽和的碳鏈，親水部分則是多變的，包括單糖、低糖、多糖、短肽、磷酸基等[3,5]。獲得高純度生物表面活性劑是研究其特性的必要前提。SHANMUGASUNDARAM等[6]采用了HPLC的方法從SBK-47菌株中純化出了一種新型的生物表面活性劑，并結(jié)合MALDI-TOF和核磁共振的方法將其鑒定為Pointifatin。TOMASZ等[7]從北極的斯瓦爾巴德島群島分離獲得了一株產(chǎn)生物表面活性劑的惡臭假單胞菌BD2，采用乙酸乙酯萃取法提取了所產(chǎn)生物表面活性劑并結(jié)合UPLC–MS方法將其鑒定為鼠李糖脂。INèS等[8]利用枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的表面活性劑來處理被石油污染的土壤并取得了很好的修復(fù)效果，而JULIANA等[9]從圓球形假絲酵母分離純化到了一種生物表面活性劑，將其應(yīng)用于重金屬污染土壤的修復(fù)并取得了較好的效果?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于生物表面活性劑的純化與鑒定的報道比較多，但大多數(shù)都來源于芽孢桿菌屬及假單胞菌屬，而關(guān)于霍氏腸桿菌生產(chǎn)生物表面活性劑還鮮有報道；另一方面，關(guān)于生物表面活性劑的應(yīng)用，主要集中在石油污染土壤的修復(fù)、重金屬污染土壤修復(fù)以及水污染處理等領(lǐng)域，而關(guān)于生物表面活性劑在促進植物吸收葉面肥方面的研究還鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過正交試驗優(yōu)化霍氏腸桿菌B4產(chǎn)生物表面活性劑的條件，提高生物表面活性劑的產(chǎn)量，結(jié)合萃取和液相色譜技術(shù)獲得了純度較高的生物表面活性劑，利用傅里葉紅外掃描和HPLC-MS技術(shù)，鑒定出了該生物表面活性劑結(jié)構(gòu)。獲得霍氏腸桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)表面活性的最優(yōu)條件并研究其基本的理化特性，純化和鑒定出生物表面活性劑主要成分，評估其對作物吸收葉面肥的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 所用菌株B4由江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室從大慶油田被石油污染的土壤中篩選獲得，并鑒定為霍氏腸桿菌（），菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上的保存號為KF015738.1。

1.1.2 培養(yǎng)基 試驗所用培養(yǎng)基均在1.05 kg·cm-2、滅菌20 min后使用，培養(yǎng)基如下。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1。原始發(fā)酵培養(yǎng)基：NaNO34.0 g·L-1，CaCl2·H2O 0.1 g·L-1，Na2HPO4·2H2O 3.0 g·L-1，KH2PO43.0 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1；酵母提取物 2.0 g·L-1，甘油3%（v/v），每升發(fā)酵培養(yǎng)基含2 mL微量元素溶液；其中微量元素溶液配方：NaMoO4·2H2O 0.05 g·L-1，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.08 g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.75 g·L-1，CoCl2·6H2O 0.08 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g·L-1，CuSO4·5H2O 0.075 g·L-1，MnSO4·H2O 0.75 g·L-1，H3BO30.15 g·L-1[9]。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 用250 mL的三角瓶裝20%的液體LB培養(yǎng)基。將接好種的三角瓶放入搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，轉(zhuǎn)數(shù)170 r/min，培養(yǎng)24 h左右。

1.2.2 表面活性劑的發(fā)酵時間優(yōu)化及正交優(yōu)化試驗

（1）發(fā)酵時間的優(yōu)化 用250 mL的三角瓶盛裝50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種5%（v/v）種子液，分別發(fā)酵24、48、72、96、120和144 h，每個處理設(shè)3次重復(fù)，35℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。取樣測定發(fā)酵液的pH、OD600。培養(yǎng)結(jié)束后，取適量發(fā)酵液于50 mL離心管中，10 000×、4℃條件下離心15 min，取上清液測定表面張力值（表面張力值的測定采用鉑金板法，在23℃室溫下測量），將離心下來的菌體放入105℃的烘箱烘干24 h至恒重后，每個處理3次重復(fù)，測量時取其平均值。

（2）正交優(yōu)化試驗 采用五因素四水平L16（45）進行正交試驗，選擇碳源、氮源、初始pH、發(fā)酵溫度和接種量作為5個因素，選擇2%、3%、4%、5%（v/v）的甘油作為碳源的4個水平，選擇2 g、3 g、4 g、5 g NaNO3作為氮源的4個水平，選擇6.0、6.5、7.0、7.5作為pH值的4個水平，選擇31℃、35℃、39℃、43℃作為溫度的4個水平，選擇1%、2%、4%、6%（v/v）作為接種量的4個水平。將發(fā)酵液的表面張力值作為參考量，每個處理3次重復(fù)并取其平均值。

1.2.3 生物表面活性劑基本性質(zhì)測定 取上清液1 000 mL，分裝于稱好重量的8個組培瓶中，放置在-80℃冰箱預(yù)凍4—5 h后，轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥儀中，凍干后稱重。繪制表面張力值隨粗生物表面活性劑濃度的關(guān)系圖，得到所產(chǎn)生物表面活性劑臨界約束濃度下的表面張力值[11]。

1.2.4 生物表面活性劑的提純及特性研究 萃?。簠⒄誈HOJAVAND等[12]的方法，將上清液用1 mol·L-1的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，再用與發(fā)酵液等體積的氯仿和甲醇2﹕1（v/v）混合溶劑萃取，再用發(fā)酵液1/2體積的混合溶劑萃取。將兩次的萃取液混合用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下進行濃縮，得到棕色黏稠固體后將其刮下。

排油圈大小測定按MORIKAWA等[13]的方法作適當?shù)恼{(diào)整：往柴油中滴入幾滴尼羅紅染色劑并混合均勻。將0.1 g的提純物溶于入50 mL（含 0.01 g碳酸鈉的超純水作為檢測液），在直徑15 cm的玻璃平皿中加入40 mL去離子水，加入10 μL柴油使其完全平鋪在水面開后，再在中央滴加1 μL生物表面活性劑，并在紫外成像儀下拍照。

1.2.5 傅里葉紅外光譜分析 將萃取獲得的粗表面活性劑，利用傅里葉變換紅外光譜儀NEXUS870（美國NICOLET）分析其中含有的功能團，掃描的分辨率為4 cm-1，掃描波段設(shè)置為400—4 000 cm-1。

1.2.6 液相分離 液相色譜分離純化生物表面活性劑按照LIN等[14]的方法進行并做適當?shù)恼{(diào)整。采用高效液相色譜法（Agilent 1260）進行分離提純，試驗所用色譜柱為Agilent C18（9.4 mm×150 mm，5 μm）。將萃取過的生物表面活性劑溶于色譜純甲醇（天津光復(fù)化學(xué)試劑公司）流動相A為色譜純乙腈，流動相B為0.1%乙酸水溶液，流動相A梯度增加，40 min內(nèi)從50%上升到100%，流速0.5 mL·min-1，柱溫50℃，進樣量為20 μL，檢測波長為210 nm。

分離過程中收集2—4 min分離出來的洗脫液，進行富集。

1.2.7 液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）生物表面活性劑采用HABA等[15]的方法進行HPLC-MS分析，并稍作修改。將粗生物表面活性劑和液相分離樣品采用液質(zhì)聯(lián)用儀（美國 Thermo Scientific, Q-Exactive），液相部分條件同上，色譜柱流出組份進入質(zhì)譜儀的流速為10 μL·min-1。毛細管電壓3.88 kV，錐孔電壓為53 V，離子源溫度100℃，脫溶溫度150℃。全掃描是在質(zhì)心模式下，采樣周期時間為1 s和掃描時間為0.1 s，m/z范圍110—1 000。

1.2.8 高效葉面肥的配制 本研究采用的葉面肥由江陰市聯(lián)業(yè)生物科技有限公司提供，是商品葉面肥的半成品（未添加表面活性劑），是由病死家禽及屠宰場下腳料酸水解而制成的氨基酸葉面肥。

將氨基酸水解液稀釋成500倍后，再利用KOH調(diào)pH至7左右，一部分氨基酸溶液加入提純的生物表面活性劑，進一步研究生物表面活性劑提高植物葉片吸收氨基酸水溶肥的效果。

1.2.9 黃瓜試驗

（1）水培試驗 標準濃度霍格蘭培養(yǎng)液：四水硝酸鈣945 mg·L-1，硝酸鉀506 mg·L-1，硝酸銨80 mg·L-1，磷酸二氫鉀136 mg·L-1，七水硫酸鎂493 mg·L-1，鐵鹽溶液2.5 mL，微量元素5 mL，pH=6.0。其中，鐵鹽溶液：七水硫酸亞鐵2.78 g，乙二胺四乙酸二鈉3.73 g，蒸餾水500 mL，pH=5.5；微量元素液：碘化鉀0.83 mg·L-1，硼酸6.2 mg·L-1，硫酸錳22.3 mg·L-1，硫酸鋅8.6 mg·L-1，鉬酸鈉0.25 mg·L-1，硫酸銅0.025 mg·L-1，氯化鈷0.025 mg·L-1。

黃瓜水培試驗于2016年8—9月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院人工氣候室進行，選用黃瓜品種為津優(yōu)1號。將種子用去離子水浸泡3—4 h，浸泡完之后用2%的過氧化氫浸泡3—4 min消毒，并放在網(wǎng)格上使其部分淹沒水中放到光照室育苗，發(fā)芽后長到兩葉一心進行移苗。用1/4的濃度的標準霍格蘭配方作為基礎(chǔ)液，兩周后換成1/2濃度的霍格蘭營養(yǎng)液，采用1 L的白色塑料容器。等黃瓜苗長出兩片真葉后，挑選長勢相同的黃瓜進行處理，作CK（噴灑清水）、AA（噴施稀釋500倍的氨基酸水解液）、AAB（在AA的基礎(chǔ)上加上1.0 g·L-1的生物表面活性劑）3個處理，每個處理作5次重復(fù)，每片葉子均反面噴3下，正面噴一下（預(yù)計0.75 mL量），每一周換一次霍格蘭營養(yǎng)液，2016年8月16移苗，9月20號收獲。測量不同處理植株的株高、葉片數(shù)、鮮重和干重，鮮重直接用吸水紙擦干根上的液體稱量，干重則將植株放入信封，并在105℃條件下烘至恒重，稱量植株重量。

（2）盆栽試驗 黃瓜盆栽試驗于2016年9—10月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院溫室進行，土壤取自江蘇省江陰市聯(lián)業(yè)農(nóng)場的水稻土。土壤pH、有機碳、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、總氮、速效磷、速效鉀含量均采用常規(guī)方法測定[12]。種子前期處理同水培試驗，利用營養(yǎng)土和蛭石混合作為育苗基質(zhì)，長出兩葉一心后移苗。

使用4 kg規(guī)格的塑料盆，每盆裝4 kg（±10 g）供試土樣，每盆添加1.75 g硫酸鉀、4.00 g過磷酸鈣、1.28 g尿素作為基肥（為體現(xiàn)處理差異，供試土壤選盡量貧瘠的）。噴肥處理同水培試驗，2016年9月6日第一次噴施，處理同1.2.6.1的葉面肥處理過程，2016年10月14日收獲。分別測量株高、葉綠素兩個參數(shù)。葉綠素測量采用SPAD-502葉綠素儀測量第一片新長成葉，選取葉片上5個點（去除偏差較大的點），取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003、SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，并利用Excel 2003作圖，≤0.05時為顯著相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 表面活性劑生產(chǎn)條件優(yōu)化

分別選取了pH、發(fā)酵液OD600、上清液表面張力值、菌體的干重4個參數(shù)，來確定菌株最佳的發(fā)酵時間，結(jié)果如表1所示。其中pH在前6天變化都不大，第6天以后pH開始呈下降趨勢。發(fā)酵上清液的表面張力值在第4天先降至一個最低的值，隨后逐漸上升。OD600在前5天不斷上升，隨后逐漸下降；菌體干物重與OD600變化呈正相關(guān)關(guān)系。菌體的干重和OD600數(shù)值都反映了菌體數(shù)量，前2天B4的干重和OD600都快速增加，3 d后OD600數(shù)值增長速率小于干物重。上清液的表面張力值最低出現(xiàn)在第4天，說明在此發(fā)酵時間所產(chǎn)的表面活性劑最多，所以最終選擇4天為發(fā)酵時間。

通過正交試驗優(yōu)化了B4產(chǎn)表面活性劑的條件（因素水平如表2），正交試驗結(jié)果如表3所示。在所有組合試驗中，組合A2B1C2D3E4中的上清液表面張力值降到最低，進一步說明在4%甘油、3 g·L-1NaNO3、初始pH6.0、6%接種量和35℃條件下，B4所產(chǎn)的生物表面活性劑最多。鑒于RD>RA>RC>RE>RB，說明碳源的量對表面活性劑的產(chǎn)量影響最大，而pH都選在了中性范圍左右所以影響不是很大。溫度的K2

表1 E. hormaechei B4產(chǎn)表面活性劑的天數(shù)優(yōu)化

表2 L16（45）正交試驗因素水平表

2.2 生物表面活性產(chǎn)量及其基本性質(zhì)

在最優(yōu)條件下，1 L發(fā)酵液中粗生物表面活性劑產(chǎn)量可高達12.14 g，表面張力隨粗生物表面活性劑濃度的關(guān)系如圖1所示。在標準測量條件下，純水的表面張力值為72.25 mN·m-1，粗生物表面活性劑的溶度在達到50 g·L-1時候溶液時達到了最小表面張力值，即生物表面活性劑濃度高于了其臨界約束濃度，得到最低表面張力為34.14 mN·m-1，在粗生物表面活性劑濃度為10 mg·L-1時表面張力值就降到47 mN·m-1，充分說明了此表面活性劑的高效性，具有很好的應(yīng)用前景。

為了進一步研究菌株生成的生物表面活性劑的特性，利用有機試劑萃取法萃取上清液中的生物表面活性劑，萃取結(jié)果表明，1 L上清液經(jīng)過萃取后可獲得2.07 g純度較高的生物表面活性劑，而且固體比較黏稠。排油圈大小可進一步表明該表面活性劑產(chǎn)物具有很好的表面活性，可以形成顯著的排油圈。結(jié)果表明，1 μL提純的生物表面活性劑可以獲得直徑8 cm的排油圈，結(jié)果如圖2所示，說明提純的生物表面活性劑具有很強的表面活性。

2.3 液相分離結(jié)果

液相分離圖譜如圖3所示，從液相分離結(jié)果可以得出，經(jīng)過有機試劑萃取過后獲得的生物表面活性劑的純度可觀，出峰時間為1.62—2.33 min，說明這一部分為提純后的生物表面活性劑的主要成分。根據(jù)液相色譜分離結(jié)果，利用儀器的回收系統(tǒng)回收1.62—2.33 min的液體，用于后續(xù)的分析。

表3 E. hormaechei B4產(chǎn)生物表面活性劑正交試驗結(jié)果

圖1 粗生物表面活性劑濃度與其溶液表面張力的關(guān)系

圖2 生物表面活性劑排油圈試驗

圖3 生物表面活性劑液相分離圖

2.4 紅外掃描結(jié)果分析

利用傅里葉紅外光譜法分析了提純的生物表面活性劑，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在波數(shù)1 770 cm-1處有C=C鍵的伸縮吸收帶，這說明在該表面活性劑中含有不飽和碳碳雙鍵；在2 941 cm-1附近顯著為CH2和CH3基中C-H鍵的伸縮振動吸收帶；1 045—1 100 cm-1的伸縮振動明顯表示有C-O-C的存在，說明該表面活性劑中存在糖苷鍵；在3 410.8 cm-1處的典型特征峰，說明該化合物中存在大量的不飽和氫；在1 384.6 cm-1處的伸縮振動則表明該表面活性劑中有二甲基的存在。這些都與HEYD[17]等用紅外掃描研究鼠李糖脂性質(zhì)的結(jié)果相一致。

圖4 萃取后粗表面活性劑紅外掃描圖

2.5 液質(zhì)聯(lián)用鑒定結(jié)果

B4粗生物表面活性劑的總離子色譜如圖5所示，結(jié)果表明在7—9 min時間段有較多的雜峰，這些雜峰可能是一些蛋白質(zhì)、核酸、類脂寡糖等。有機試劑萃取后用高效液相色譜分離的物質(zhì)在7.58 min處出峰，故將7.58 min的出峰物質(zhì)進行質(zhì)譜分析，分析結(jié)果如圖6所示，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)的特征峰，推測m/z 701.54為[M+Na]+，而m/z 723.74為[M-H+2Na]+，根據(jù)文獻[18-19]報道的結(jié)果，推測該位置結(jié)構(gòu)式為Rha-Rha-C10-C12。在總離子流圖中其他沒有分離檢測出的物質(zhì)可能是Rha-Rha-C10-C12的一些同系物，有待進一步研究。

圖5 粗生物表面活性劑LCMS總離子流圖

圖6 純化的生物表面活性劑質(zhì)譜圖

2.6 黃瓜促生試驗結(jié)果

2.6.1 水培試驗 黃瓜水培試驗結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明AAB處理的株高為（129±2.74）cm，而AA處只有（97.10±8.51）cm，CK則更矮小，只有（71.87±2.80）cm，AAB處理比CK處理增長了79.59%，比AA處理增長了32.90%；葉片數(shù)也要很大程度的增長，AAB處理的平均葉片數(shù)達到了（19.0±1.15）cm，比CK和AA處理分別增長了39.24%和18.74%。在整個植株的質(zhì)量方面AAB處理也有很大增長，AAB植株的平均鮮重為52.94 g，AA和CK分別只有42.70 g和37.01 g，AAB與AA和CK相比，分別增長23.98%和43.03%；干重與鮮重很吻合，AAB、AA和CK的平均干重分別為4.73、3.65和3.31 g，AAB比AA和CK分別增長了29.80%和42.86%。生物表面活性劑的加入使得黃瓜的生物量有顯著的增加，只噴施氨基酸水溶肥的AA處理長勢明顯不如添加了生物表面活性劑的AAB處理（圖8）。

圖7 黃瓜水培結(jié)果

圖8 水培黃瓜生物量

2.6.2 盆栽試驗 利用盆栽試驗進一步驗證B4所產(chǎn)生物表面活性劑的對黃瓜葉片吸收葉面肥的效果，所用土壤的基本性質(zhì)如表4所示。結(jié)果表明，供試土壤的有機質(zhì)含量比較高，而總氮和速效磷和速效鉀的含量并不是很高，該土壤比較適合于葉面肥施用效果的研究。

盆栽試驗中，分別測定了不同處理中黃瓜的株高、葉綠素含量，結(jié)果如圖9所示。AAB處理的平均株高為（164.97±0.09）cm，AA與CK處理沒有明顯差異，AAB卻顯著高于這兩個處理，與AA和CK相比分別增加了26.93%和25.52%。關(guān)于葉綠素含量的差異，AAB處理也有類似的趨勢，AAB處理的比AA和CK處理的葉綠素含量分別增加了10.69%和11.72%。盆栽試驗結(jié)果表明，B4合成的生物表面活性劑對黃瓜葉片吸收氨基酸葉面肥有顯著的促進作用。

表4 供試土壤的基本性質(zhì)

圖9 盆栽試驗結(jié)果

3 討論

生物表面活性劑種類繁多，能夠分泌生物表面活性劑的微生物也多種多樣，主要包括假單胞菌[7]、芽孢桿菌[8]、乳酸菌[20]等，但是不同微生物所產(chǎn)生物表面活性劑的量及其特性差異明顯。目前，關(guān)于生物表面活性劑在食品和農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用的報道比較多，GEORGE等[21]將海洋放線菌中分離得到的糖脂類生物表面活性劑應(yīng)用到食品加工上時發(fā)現(xiàn)，該糖脂不僅可以改善面包的風(fēng)味，而且對大多數(shù)的細菌都具有拮抗作用；SIDDHARTHA等[22]利用從銅綠假單胞菌SS14純化出來的鼠李糖脂來防治玉米的穗腐病取得了比較理想的效果，而思斯等[23]從酶學(xué)角度研究了生物表面活性劑對提高纖維素高效降解的機制。然而關(guān)于生物表面活性劑在促進植物吸收葉面肥效率及其機制的研究還鮮有報道，而關(guān)于霍氏腸桿菌（）產(chǎn)生物表面活性劑的優(yōu)化及其產(chǎn)物的純化鑒定更是報道甚少，所以本研究關(guān)于霍氏腸桿菌B4生物表面活性劑的純化鑒定及其應(yīng)用的研究是非常有意義的，將為新型肥料的研制提供堅實的理論基礎(chǔ)。

為了使霍氏腸桿菌B4產(chǎn)足夠的生物表面活性劑，必須優(yōu)化菌株產(chǎn)生物表面活性劑的條件，主要包括碳源、氮源及各種培養(yǎng)條件，而C/N是限制菌株產(chǎn)生生物面活性劑的主要因素。生物表面活性劑的產(chǎn)生往往開始于氮源快消耗殆盡的時期[24]，當?shù)春谋M時生物體內(nèi)氮依賴型的酶促反應(yīng)就無法進行，而碳源依舊充足，就會產(chǎn)生很多碳鏈較長的烴類，從而成為生物表明活性劑的疏水端[25]。在產(chǎn)量與性質(zhì)方面，B4菌株所產(chǎn)的生物表面活性劑可使純水的表面張力值從72.25 mN·m-1降低到34.14 mN·m-1，說明該生物表面活性劑降低水表面張力的效果比較好。到目前為止，最有效的生物表面活性劑在0.005%濃度可以將純水的表面張力值降低到27 mN·m-1 [26]，B4產(chǎn)的生物表面活性劑和它比起來差距不大，因此該生物表面活性劑具有很好應(yīng)用潛能。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，B4發(fā)酵產(chǎn)生的直接粗生物表面活性劑高達12.14 g·L-1，有機萃取后可以得到2.07 g·L-1較純的生物表面活性劑。Ereira等[27]用相同的方法萃取了枯草芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物，只獲得了1.76 g·L-1的脂肽類表面活性劑，相比之下B4有更強的產(chǎn)表面活性劑能力。在10 mg·L-1濃度條件下，霍氏腸桿菌B4分泌的生物表面活性劑可使純水的表面張力值降低到47 mN·m-1左右，進一步說明該生物表面活性劑在低濃度下就具有良好的表面活性，所拍攝的排油圈結(jié)果更加直觀的體現(xiàn)了所產(chǎn)生物表面表活性劑的強大功能。

微生物所產(chǎn)生物表面活性劑的表面比較多，主要槐糖脂、鼠李糖脂、海藻糖脂、脂肽和脂蛋白等，在具體研究前，必須對菌株所產(chǎn)的生物表面活性劑進行純化與鑒定。本研究結(jié)合FTIR和HPLC-MS技術(shù)，分離純化了霍氏腸桿菌B4分泌的生物表面活性劑，F(xiàn)TIR檢測結(jié)果表明，該純化的生物表面活性劑含有含有-CH2、-CO和C-O等官能團，與鼠李糖脂（Rha- Rha-C10-C12）所含的官能團比較吻合。而HPLC-MS分析結(jié)果表明，荷質(zhì)比為701.54的碎片，與已有文獻報道的鼠李糖脂（Rha-Rha-C10-C12）比較吻合，最終確定霍氏腸桿菌B4所產(chǎn)的表面活性劑為鼠李糖脂。該鑒定結(jié)果，將為該生物表明活性劑的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究采用了水培和盆栽試驗來驗證霍氏腸桿菌B4所產(chǎn)表面活性劑的提高黃瓜葉片吸收養(yǎng)分的效率。葉面肥噴施液在作物葉面的潤濕是養(yǎng)分進入葉片內(nèi)部的前提[28]，而覆有蠟質(zhì)層的葉面具有低能表面的特征，使葉面肥噴施液無法在葉面潤濕，不利于作物葉片對養(yǎng)分的吸收，表面活性劑則可以降低葉面肥的表面張力，降低了噴施液與蠟質(zhì)層之間的界面張力，從而增加葉面肥在葉面的潤濕作用。本研究中，黃瓜水培結(jié)果顯示添加了生物表面活性劑的比沒有添加的鮮重增加了23.98%，干重增加了29.80%。盆栽試驗中添加了生物表面活性劑的植株比沒有添加的葉綠素含量增加了10.69%，進一步說明生物表面活性劑的添加促進了植物對氨基酸葉面肥氮的吸收?？傊珺4 所產(chǎn)的生物表面活性劑對黃瓜吸收葉面肥的促進是顯而易見的，這與浙江大學(xué)Liu等[29]研究得出鼠李糖脂可以提高氨基酸葉面肥吸收效率的結(jié)果是一致。在盆栽試驗中噴施氨基酸葉面肥的長勢和噴清水的無明顯差異?？赡茉蚴撬帱S瓜蒸騰量大，氣孔張開程度大更易吸收葉面肥。再者是盆栽期間蚜蟲危害比較嚴重，有研究表明部分生物表面活性劑有殺滅蚜蟲的功能[30]，噴施了生物表面活性劑的葉面肥可能起到驅(qū)趕蚜蟲和促進吸收的雙重功效，使得該處理長勢要遠遠高于其他兩個處理，這有待進一步驗證，今后也要對粗的生物表面活性劑進一步的提純，并進行相關(guān)的結(jié)構(gòu)鑒定工作。

近年來，環(huán)境污染及食品安全問題都受到社會的廣為關(guān)注，在綠色食品的生產(chǎn)中，考慮到化工生產(chǎn)表面活性劑殘留，以及其對環(huán)境產(chǎn)生的危害，高效、可降解、無毒害的生物表面活性劑必然會受到廣泛推崇。所以，本研究的應(yīng)用前景比較廣闊。

4 結(jié)論

霍氏腸桿菌B4在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，生物表面活性產(chǎn)量較高。該菌所產(chǎn)的表面活性劑主要成分為鼠李糖脂類物質(zhì)，具有很好的表面活力，低濃度情況下能有效降低水的表面張力?；羰夏c桿菌B4所產(chǎn)生物表面活性劑能很好地促進黃瓜對氨基酸葉面肥的吸收，噴施了添加B4菌株所產(chǎn)生物表面活性劑的氨基酸葉面肥的黃瓜植株生物量有明顯增長。

[1] ARIMA K, KAKINUMA A, TAMURA G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.1968, 31(3): 488-494.

[2] ROSENBERG E, RON E Z. High- and low-molecular-mass microbial surfactants.1999, 52(2): 154-162.

[3] LANG S. Biological amphiphiles (microbial biosurfactants).2002, 7(1/2):12-20.

[4] Van HAMME J D, SINGH A, WARD O P. Physiological aspects: Part 1 in a series of papers devoted to surfactants in microbiology and biotechnology.2006, 24(6): 604-620.

[5] NITSCHKE M, COSTA S G V A O, CONTIERO J. Rhamnolipid surfactants: an update on the general aspects of these remarkable biomolecules.2005, 21:1593-1600.

[6] BALAN S S, KUMAR C G, JAYALAKSHMI S. Pontifactin, a new lipopeptide biosurfactant produced by a marine, strain SBK-47: Purification, characterization and its biological evaluation.2016, 51(12): 2198-2207.

[7] JANEK T, ?UKASZEWICZ M, KRASOWSKA A. Identification and characterization of biosurfactants produced by the Arctic bacteriumBD2.s, 2013, 110: 379-386.

[8] MNIF I, SAHNOUN R, ELLOUZ-CHAABOUNI S, GHRIBI D. Application of bacterial biosurfactants for enhanced removal and biodegradation of diesel oil in soil using a newly isolated consortium., 2017, 109: 72-81.

[9] LUNA J M, RUFINO R D, SARUBBO L A. Biosurfactant fromUCP0995 exhibiting heavy metal remediation properties.2016, 102: 558-566.

[10] 錢欣平. 生物表面活性劑的合成及其促進有機物降解的研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2002.

QIAN X P. Study on the synthesis of biological surfactants and the promotion of organic degradation[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2002. (in Chinese)

[11] ZHANG Y, MILLER R M. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by arhamnolipid surfactant (biosurfactant).1992, 58(10): 3276-3282.

[12] GHOJAVAND H, VAHABZADEH F, MEHRANIAN M,RADMEHR M, SHAHRAKI K A, ZOLFAGHARIAN F, EMADI M A, ROAYAEI E. Isolation of thermotolerant, halotolerant, facultative biosurfactant- producing bacteria., 2008, 80(6): 1073-1085.

[13] MORIKAWA M, HIRATA Y, IMANAKA T. A study on the structure–function relationship of lipopeptide biosurfactants.2000, 1488(3): 211-218.

[14] LIN S C, CHEN Y C, LIN Y M. General approach for the development of high-performance liquid chromatography methods for biosurfactant analysis and purification.1998, 825(2): 149-159.

[15] HABA E, PINAZO A, JAUREGUI O, ESPUNY M J, INFANTE M R, MANRESA A. Physicochemical characterization and antimicrobial properties of rhamnolipids produced by47T2 NCBIM 40044.2003, 81(3): 316-322.

[16] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000.

BAO S D.. Beijing: China Agricultural Press, 2000. (in Chinese)

[17] HEYD M, KOHNERT A, TAN T H, NUSSER M, KIRSCHH?FER F, BRENNER-WEISS G, BERENSMEIER S. Development and trends of biosurfactant analysis and purification using rhamnolipids as an example.2008, 391(5): 1579-1590.

[18] BENINCASA M, ABALOS A, OLIVEIRA I, MANRESA A. Chemical structure, surface properties and biological activities of the biosurfactant produced byLBI from soapstock.2004, 85(1): 1-8.

[19] NIE M, YIN X, REN C, WANG Y, XU F, SHEN Q R. Novel rhamnolipid biosurfactants produced by a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacterium, strain NY3.2010, 28(5): 635-643.

[20] VECINO X, RODRíGUEZ-LóPEZ L, GUDI?A E J, CRUZ J M, MOLDES A B, RODRIGUES L R. Vineyard pruning waste as an alternative carbon source to produce novel biosurfactants by.y, 2017. DOI: 10.1016/j.jiec.2017.06.014

[21] DE JESUS CORTES-SANCHEZ A, HERNáNDEZ-SáNCHEZ H, JARAMILLO-FLORES M E. Biological activity of glycolipids produced by microorganisms: new trends and possible therapeutic alternatives.2013, 168(1): 22-32.

[22] BORAH S N, GOSWAMI D, SARMA H K, CAMEOTRA S S, DEKA S. Rhamnolipid biosurfactant against Fusarium verticillioides to control stalk and ear rot disease of maize.2016, 7:1505.

[23] 思斯, 王明月, 劉紹雄, 吳海波, 王金華, 王婷婷, 田榮榮, 陳碩凱, 熊智. 高效纖維素降解細菌的分離鑒定及酶學(xué)特性. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(3): 305-308.

SI S, WANG M Y, LIU S X, WU H B, WANG J H, WANG T T, TIAN R R, CHEN S K, XIONG Z. Isolation of the efficient lignocelluloses degrading microbes and study on its enzymatic characteristics.2013, 41(3): 305-308. (in Chinese)

[24] PEYPOUX F, BONMATIN J M, LABBE H,GRANGEMARD I., DAS B C, PTAK M, WALLACH J, MICHEL G. [Ala4] surfactant, a novel isoform fromstudied by mass and NMR spectroscopies.1994, 224(1): 89.

[25] BANAT I M, MAKKAR R S, CAMEOTRA S S. Potential commercial applications of microbial surfactants.2000, 53(5): 495-508.

[26] VOLLENBROICH D, OZEL M, VATER J, KAMP R M, PAULI G. Mechanism of inactivation of enveloped viruses by the biosurfactant surfaction from.1997, 25(3): 289-297.

[27] PEREIRA J F B, GUDI?A E J, COSTA R, TEIXEIRA J A, COUTINHO J A, RODRIGUES L R. Optimization and characterization of biosurfactant production byisolates towards microbial enhanced oil recovery applications.2013, 111(9): 259-268.

[28] 肖艷, 唐永康, 曹一平, 王敬國. 表面活性劑在葉面肥中的應(yīng)用與進展. 磷肥與復(fù)肥, 2003, 18(4):11-12.

XIAO Y, TANG Y K, CAO Y P, WANG J G. Application of surfactants fertilizer for foliage dressing and its progress.2003, 18(4):11-12. (in Chinese)

[29] LIU H, SHAO B, LONG X, YAO Y, MENG Q. Foliar penetration enhanced by biosurfactant rhamnolipid., 2016, 145: 548.

[30] 孫星星, 王凱, 李紅陽, 高波, 顧慧玲, 張俊喜, 周加春, 朱富強. 新型生物農(nóng)藥鼠李糖脂及其復(fù)配劑對甘藍蚜蟲的防治效果. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 57(12): 2071-2073.

SUN X X, WANG K, LI H Y, GAO B, GU H L, ZHANG J X, ZHOU J C, ZHU F Q. Control effect of new bio-pesticide rhamnolipid and its compound agent on aphids in cabbage., 2016, 57(12): 2071-2073. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 李云霞）

Purification and Identification of the Biosurfactant Produced byB4 and Its Application

WANG Quan, WANG JiaYin, ZHU Han, ZHUO JinYu, LIU DongYang, SHEN QiRong

(Jiangsu Key Laboratory for Organic Solid Waste Utilization, Nanjing Agricultural University/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing 210095)

The objective of this study is to optimize the biosurfacants produced byB4, to purify the biosurfacants through organic reagent extraction and high performance liquid chromatography, to identify the biosurfacants by HPLC-MS, and to evaluate the efficiency of improving foliar fertilizer absorption, which will provide theoretical basis for the development of new fertilizers.The optimization of biosurfacants production byB4 was carried out by orthogonal experiment, and the major parameters were used in this study, including the carbon resources, nitrogen resources, initial pH, temperature, inoculum amount, revolutions, and incubation time. The evaluation index of different treatments was the surface tension value of the fermented liquid, and the treatment with the lowest surface tension was the optimum experimental group. The crude biosurfacants were extracted by extracted by organic regents and then concentrated by using vacuum rotary evaporation apparatus with water bath at 60 centigrade. Different functional groups contained in the purified biosurfacants were analyzed by Fourier infrared spectrum, which could provide favorable information for analyzing the structure. The purification of the biosurfacants was performed by liquid chromatography methods, and the HPLC conditions are: column temperature of 110oC, sample size with 20 μL, flow rate of 0.5 mL·min-1. The identification of the purified biosurfacants was carried out by HPLC-MS, and the condition was as following: flow rate of 10 μL·min-1, the velocity of capillary voltage of 3.88 kV, cone voltage of 53V, ionization temperature of 100oC, dissolution temperature of 150oC, under the condition of using full scan mode in the center of mass, and the full scan under centroid model was used to collect the mass spectrometry data, and the biosurfactant structure was identified based on existing mass spectrometric data. In the end, the purified biosurfactant was used to evaluate the efficiency of improving foliar fertilizer absorption by cucumber through hydroponic culture and pot experiments.The results indicated that the optimum condition for biosurfactant production is listed as follow: 4% (v/v) glycerol, 3 g·L-1sodium nitrate, initial pH 6.0, inoculum of 6%, 35oC, 200 rpm and 96 h, under which the surface tension value of the fermented liquid decreases to 44.10 mN·m-1and the production of the crude biosurfacants was 12.14 g·L-1. Meanwhile, the crude biosurfacants extracts could decrease the surface tension value of pure water to 44.10 mN·m-1, and this condition is considered as the optimum fermentation condition. The liquid phase separation results indicate that the crude biosurfacants extracted by organic reagent have typical characteristic peaks at 1.62-2.33 min, which also showed that it is the main component in the crude extract of the biosurfactant, and it also could decrease the surface tension value to 47.00 mN·m-1at the concentration of 0.10 g·L-1. The FRIR analysis results indicate that the purified biosurfacants contain various functional groups including -CH2、-CO and C-O, and it is considered as biosurfacants with carbon chains. The HPLC-MS analysis results show that m/z 701.54 is [M+Na]+, and m/z 723.74 was [M-H+2Na]+, and the biosurfactant is identified as rhamnolipid, and its structure is Rha-Rha-C10-C12. By comparing to the CK (Water) and AA (Amino acids) treatments, the plant height in AAB (Amino acids and biosurfacants) increased by 79.59% and 32.9% and fresh weight increased by 43.03% and 23.98%, respectively. The chlorophyll contents in AAB increase by 11.72% and 10.69%, respectively, by comparing to the CK and AA, in the pot experiment.In brief, the condition for the biosurfacants production secreted byis optimized, under which the production of the crude biosurfacants is 12.14 g·L-1, and the main component of the biosurfacants produced byis identified as rhamnolipid (Rha-Rha-C10-C12), which can enhance foliar penetration and will have a good application prospect.

; biosurfactants; optimization; foliar fertilizer

2017-04-05；

國家“973”計劃（2015CB150506）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20150059）

接受日期：2017-07-12

聯(lián)系方式：王權(quán)，357138733@qq.com。通信作者劉東陽，Tel：025-84396853；E-mail：liudongyang@njau.edu.cn