胡蕊艷 王曉桐 李 潔 孟令鍇

高效液相色譜法測(cè)定金絲桃屬兩種藥用植物中金絲桃苷的含量※

胡蕊艷1王曉桐1李 潔2孟令鍇3

目的建立測(cè)定兩種金絲桃屬藥用植物烏腺金絲桃、長(zhǎng)柱金絲桃中金絲桃苷的高效液相色譜分析方法。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為ZorbaxSB-C18柱，流動(dòng)相為甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70），流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 358 nm，柱溫 30 ℃。結(jié)果金絲桃苷在 0.0062～0.0622 mg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.9991）；平均回收率為96.41%，RSD=1.27%。結(jié)論該法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性及重復(fù)性好，可用于對(duì)長(zhǎng)柱金絲桃和烏腺金絲桃中金絲桃苷的含量測(cè)定。

長(zhǎng)柱金絲桃；烏腺金絲桃；金絲桃苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

金絲桃屬（Hypericum.L.）植物全世界約有400余種，我國(guó)有55種，8亞種。黑龍江省分布的金絲桃屬植物有兩種，分別為烏腺金絲桃（H.attenuatumChoisy.）和長(zhǎng)柱金絲桃（Hypericum.ascyron L.）。近年來(lái)，研究表明該屬植物的一些種類含有黃酮類、雙蒽酮衍生物等化合物，具有抗病毒、抗抑郁的活性[1-2]，其含有的金絲桃素對(duì)禽流感病毒（H9亞型）有抑制作用，目前已得到醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注[3]。該屬植物含有的黃酮醇、黃烷醇類化合物，尤其金絲桃苷也是該屬植物的主要活性成分之一。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)黑龍江省野生金絲桃屬長(zhǎng)柱金絲桃、烏腺金絲桃藥材中金絲桃苷成分進(jìn)行含量測(cè)定并比較分析，為合理開發(fā)黑龍江省金絲桃屬藥用資源提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀（Agilent1100）；超聲波清洗器（TCQ-250）；紫外-可見分光光度計(jì)（UV7501）；電子天平（BP211D）。

1.2 試藥金絲桃苷對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111521-200305）；乙腈、甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為自制雙蒸水，其余實(shí)驗(yàn)試劑為分析純。烏腺金絲桃、長(zhǎng)柱金絲桃采收于2016年4—10月，采收地及采收期見表 1，經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院吳兆華教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)最大吸收波長(zhǎng)的選擇取實(shí)驗(yàn)用金絲桃苷對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，實(shí)驗(yàn)表明對(duì)照品溶液在358 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，分離效果良好，干擾少，因此，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為358 nm。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品的采收地及采收期

2.2 流動(dòng)相的選擇試用多種溶劑系統(tǒng)，最終確定以甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70）為流動(dòng)相時(shí)金絲桃苷分離效果好，保留時(shí)間適宜。

2.3 色譜條件色譜柱：Zorbax SB-C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相：甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70），流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為363 nm，柱溫：30 ℃。在此條件下，金絲桃苷能與其他成分很好分開，金絲桃苷的保留時(shí)間為5.5 min。色譜圖見1-3。

圖1 對(duì)照品高效液相色譜圖(1為金絲桃苷)

圖2 烏腺金絲桃樣品高效液相色譜圖(1為金絲桃苷)

圖3 長(zhǎng)柱金絲桃樣品高效液相色譜圖(1為金絲桃苷)

2.4 實(shí)驗(yàn)藥材中金絲桃苷的提取方法選擇取烏腺金絲桃花期藥材4份，每份約0.5 g。分別采用甲醇、乙醇兩種溶劑，采用超聲提取法進(jìn)行試驗(yàn)比較，確定提取方法。結(jié)果見表2。

表2 提取方法對(duì)比結(jié)果

2.5 金絲桃苷的HPLC測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取金絲桃苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解于10 ml容量瓶中，制成0.0622 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取上述儲(chǔ)備液1.0、2.5、5.0、6.0、7.5、10.0 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋，進(jìn)樣，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=228 38x+66.812，r=0.9991，表明金絲桃苷在0.0062～0.0622 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 方法學(xué)考察

2.5.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液10 μl，進(jìn)樣6次，金絲桃苷峰面積RSD=0.54%。結(jié)果見表3。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取對(duì)照品溶液（0.0497 mg/ml）10 μl，分別于0、1、2、4、8 h各進(jìn)樣1次，測(cè)得金絲桃苷峰面積值RSD=0.94%，表明對(duì)照品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表4。

2.5.3.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同時(shí)期烏腺金絲桃樣品平行5份（0.4970 g、0.4959 g、0.4975 g、0.4911 g、0.4991 g），照樣品測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果藥材含量分別為0.8491%、0.8457%、0.8501%、0.8910%、0.8540%。RSD=2.18%。結(jié)果見表5。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取烏腺金絲桃藥材（含量已測(cè)知），分別精密加入金絲桃苷對(duì)照品溶液，按照2.5.4項(xiàng)下樣品制備與測(cè)定方法，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn) 6組。得到金絲桃苷回收率為 96.41%，RSD=1.27%。結(jié)果見表6。

表6 金絲桃苷回收率測(cè)定結(jié)果

2.5.4 藥材含量測(cè)定取藥材0.5 g，置于量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min后，放冷，稀釋至刻度，搖均，過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μl，注入色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算含量。測(cè)定結(jié)果見表7。

表7 不同產(chǎn)地、不同采收期藥材中的金絲桃苷含量(n=6)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)樣品分別在甲醇、乙醇中分別超聲提取30 min、60 min，含量測(cè)定結(jié)果表明，甲醇超聲提取60 min時(shí)金絲桃苷含量最高，與其他提取條件下金絲桃苷含量相差不大，金絲桃苷可在30 min內(nèi)較好地溶解，且發(fā)現(xiàn)甲醇為溶劑的供試品溶液峰形較好，重現(xiàn)性高，故實(shí)驗(yàn)采用甲醇為提取溶劑，超聲30 min提?。稽S酮苷類成分在高效液相測(cè)定時(shí)易拖尾，流動(dòng)相加入酸時(shí)可抑制拖尾[4]。曾選用流動(dòng)相為甲醇:0.025 mol/L磷酸（70:30）、甲醇:0.025 mol/L磷酸（50:50）、甲醇:0.025 mol/L磷酸（40:60），峰形對(duì)稱性不好，峰較寬，分離度低，而后經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入一定量的乙腈后，有了改善峰形，提高了分離度，最終確定流動(dòng)相為甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70），經(jīng)多次、多批樣品的測(cè)定，系統(tǒng)具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行了長(zhǎng)柱金絲桃的實(shí)驗(yàn)方法考察，因其方法與烏腺金絲桃一致，故只在文中表述了一種，在此條件下可以提取完全，對(duì)其他共存成分無(wú)影響。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)柱金絲桃中金絲桃苷含量最高的時(shí)期為花期[5]，因而選取花期為特征性指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同采收地的長(zhǎng)柱金絲桃、烏腺金絲桃樣品中金絲桃苷的含量測(cè)定結(jié)果表明：伊春地區(qū)烏腺金絲桃樣品中金絲桃苷的含量高于牡丹江地區(qū)、高于佳木斯地區(qū)。伊春地區(qū)長(zhǎng)柱金絲桃樣品中金絲桃苷的含量高于佳木斯地區(qū)。由此可以初步推斷，野生金絲桃屬植物生長(zhǎng)環(huán)境的不同，其金絲桃苷的含量存在一定的差異。因此，在人工栽培金絲桃屬植物時(shí)應(yīng)考慮其生長(zhǎng)環(huán)境如溫度、土壤等因素，選擇適合的栽培區(qū)域。同時(shí)，通過(guò)對(duì)不同采收時(shí)期的烏腺金絲桃樣品中金絲桃苷含量測(cè)定，表明花期烏腺金絲桃樣品中金絲桃苷的含量高于花前期、高于果期、高于幼苗期，由此可以建議烏腺金絲桃的最佳采收期為花期。

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10.12010/j.issn.1673-5846.2017.11.008

1牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2013級(jí)，黑龍江牡丹江 157011

2牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院血液科，黑龍江牡丹江 157011

3牡丹江醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)與生藥學(xué)教研室，黑龍江牡丹江 157011

黑龍江省黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201610229052）；牡丹江醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研項(xiàng)目（編號(hào)：201641）

作者簡(jiǎn)歷：胡蕊艷（1994-），本科學(xué)歷。E-mail：1442874067@qq.com

孟令鍇（1980-），碩士學(xué)位，講師。主要研究方向?yàn)樯庤b定及品質(zhì)評(píng)價(jià)。E-mail：mlk720@163.com