劉志波，劉春玲

（1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810001；2.河北省秦皇島市海港醫(yī)院腫瘤科，河北 秦皇島 066000）

E盒結(jié)合鋅指蛋白2對非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的意義及其介導(dǎo)的多藥耐藥機(jī)制

劉志波1，劉春玲2

（1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810001；2.河北省秦皇島市海港醫(yī)院腫瘤科，河北 秦皇島 066000）

目的探討E盒結(jié)合鋅指蛋白2（ZEB2）對非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）預(yù)后的意義及介導(dǎo)的多藥耐藥機(jī)制。方法選取72例NSCLC患者癌組織及癌旁組織，免疫組織化學(xué)染色檢測組織ZEB2的表達(dá)，分析ZEB2表達(dá)與NSCLC患者臨床資料及生存預(yù)后的關(guān)系。按照轉(zhuǎn)染類型將細(xì)胞分為3組：ZEB2-siRNA組、ZEB2-NC組和空白對照組（Mock）。采用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)降低A549細(xì)胞ZEB2表達(dá)，分別采用不同濃度順鉑、紫杉醇處理A549細(xì)胞，CCK-8法檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡率，Western blot檢測細(xì)胞耐藥蛋白P-糖蛋白（P-gp）、肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）表達(dá)。結(jié)果ZEB2蛋白在癌組織陽性表達(dá)率為77.8%（56/72），癌旁組織陽性表達(dá)率為23.6%（17/72），ZEB2蛋白在癌組織陽性表達(dá)率高于癌旁組織（P＜0.01）。腫瘤直徑≥5 cm組ZEB2陽性表達(dá)率高于腫瘤直徑＜5 cm組，Ⅲ、Ⅳ期組ZEB2陽性表達(dá)率高于Ⅰ、Ⅱ組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組ZEB2陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，中低分化組ZEB2陽性表達(dá)率高于高分化組，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ZEB2陽性組總生存率和無病生存期低于陰性組（P＜0.05）。Mock組、ZEB2-NC組和ZEB2-siRNA組細(xì)胞存活率均隨化療藥物濃度增加而降低，其中ZEB2-siRNA組細(xì)胞存活率低于ZEB2-NC組（P=0.000）。經(jīng)Cisplatin、Paclitaxel處理后，與Mock組、ZEB2-NC組比較，ZEB2-siRNA組細(xì)胞凋亡率增加，G0/G1期所占百分率降低，S期所占百分率升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。ZEB2-siRNA組P-gp、LRP蛋白表達(dá)水平低于Mock組和ZEB2-NC組（P=0.000），ZEB2-NC、Mock組P-gp、LRP蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論NSCLC組織ZEB2表達(dá)上調(diào)，抑制ZEB2可以降低耐藥蛋白P-gp、LRP表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)肺癌的多藥耐藥特性。

E盒結(jié)合鋅指蛋白2；非小細(xì)胞肺癌；預(yù)后；多藥耐藥；P-糖蛋白；肺耐藥相關(guān)蛋白

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，據(jù)我國最新的調(diào)查顯示[1]，中國肺癌發(fā)病率居各種惡性腫瘤的首位。非小細(xì)胞肺癌[2]（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常見的分型，在肺癌中所占的比例約為85%。全身化療是NSCLC治療的主要措施，盡管初治NSCLC對多數(shù)化療藥物敏感性較高，但是極易出現(xiàn)耐藥性，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）而導(dǎo)致化療失敗。E盒結(jié)合鋅指蛋白2（zinc finger E-box-binding homeobox 2，ZEB2）屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一[3]，通過與 E- 鈣黏附蛋白（epithelia-cadherin，E-cadherin）啟動子區(qū)E-box結(jié)合，抑制E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生MDR。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是存在于細(xì)胞膜表面的耐藥糖蛋白，P-gp能夠起到類似能量依賴性“藥物泵”作用[4]，將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，減弱藥物對腫瘤細(xì)胞的殺滅作用而誘導(dǎo)耐藥。肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance-related protein，LRP）是存在于細(xì)胞核內(nèi)的一種耐藥蛋白[5]，其將進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的藥物通過小囊泡的形式排出細(xì)胞外，使細(xì)胞核避免受到化療藥物的損傷而產(chǎn)生耐藥。本研究以ZEB2作為研究目標(biāo)，通過耐藥蛋白P-gp、LRP角度探討ZEB2誘導(dǎo)NSCLC多藥耐藥的作用機(jī)制，旨在為逆轉(zhuǎn)MDR治療NSCLC提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月-2016年12月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的72例NSCLC患者作為研究對象。其中，腺癌33例，鱗癌39例；術(shù)中切除癌組織和癌旁組織（距癌組織切緣＞5 cm），立即置于液氮中保存待檢。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者自愿捐獻(xiàn)樣本組織供研究使用，并簽署知情同意書。術(shù)前未進(jìn)行放療、化療等抗癌治療，術(shù)后樣本組織經(jīng)病理檢查確診。

1.2 實驗試劑

肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549（購自美國菌種保藏中心），通用型SP檢測試劑盒（購自北京中杉金橋生物科技公司），鼠抗人ZEB2抗體、鼠抗人P-gp抗體、鼠抗人LRP抗體（購自美國Sigma公司），鼠抗人GAPDH抗體（購自Santa Cruz公司），Trizol試劑（購自美國Invitrogen公司），Prime Script RT reagent Kit（購自TaKaRa公司），ZEB2干擾RNA序列（由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成），ZEB2-siRNA序列：5'-GUAAUGACUAGGGCUAUUA-3'，陰性對照（ZEB2-NC）序列：5'-CGUAUGCGCGUACUCUAAUTT-3'。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（購自美國Invitrogen公司）。DMEM培養(yǎng)基（購自Gibco公司），CCK-8試劑盒、Annexin-Ⅴ FITC凋亡檢測試劑盒、Annexin-Ⅴ PE凋亡檢測試劑盒及碘化丙啶PE（購自碧云天生物技術(shù)研究所）。順鉑（Cisplatin）（購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司），紫杉醇（Paclitaxel）（購自?？谑兄扑幱邢薰荆魇郊?xì)胞儀（購自美國BD公司），PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（購自Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色檢測組織ZEB2表達(dá) 取癌組織和癌旁組織切片，以PBS代替一抗作為陰性對照，按照免疫SP檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，實驗簡述如下：切片常規(guī)脫蠟至水，加熱修復(fù)抗原，再滴加3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物。滴加100μl ZEB2抗體，4℃孵育過夜；第2天用PBS緩沖液沖洗3次，再滴加2滴二抗，室溫繼續(xù)孵育30 min。加入DAB染液后蘇木精復(fù)染，自來水沖洗，脫水透明后中性樹膠封固，顯微鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)上出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒作為陽性染色。隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，陽性結(jié)果判定參考以下標(biāo)準(zhǔn)，染色強(qiáng)度：0分：無染色；1分：淡黃色；2分：黃色或棕黃色；3分：棕褐色。陽性細(xì)胞比例：0分：＜5%，1分：5%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：＞75%。免疫染色評分（immunoreactive score，IRS）以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例綜合判定，兩者相乘，IRS評分0～12分，其中≤4分為陰性，＞4分為陽性。

1.3.2 隨訪 術(shù)后對患者以電話或門診復(fù)查方式規(guī)律隨訪，本研究隨訪截止時間為2017年3月20日。定義無病生存期（disease-free survival，DFS）：從術(shù)后第2天開始至疾病復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或因非小細(xì)胞肺癌死亡的時間；總生存期（overall survival，OS）：從術(shù)后第2天開始至因任何原因引起死亡的時間。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 A549細(xì)胞均接種于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素），在培養(yǎng)箱中37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)。每隔2天更換1次培養(yǎng)基。A549細(xì)胞待融合達(dá)80%～90%時進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將ZEB2-siRNA或ZEB2-NC用150 μl PBS溶解，使之終濃度為20 μmol/L。按照轉(zhuǎn)染類型將細(xì)胞分為3組：ZEB2-siRNA組、ZEB2-NC組和空白對照組（Mock），ZEB2-siRNA組：將 1 μl LipofectamineTM2000與1.5μl ZEB2-siRNA混勻，靜置5min，再加入400 μl細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染后其他檢測操作。ZEB2-NC組加入1.5 μl ZEB2-NC，其余操作同ZEB2-siRNA組。Mock組僅加入1 μl LipofectamineTM2000脂質(zhì)體，其余操作同ZEB2-siRNA組。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測ZEB2 mRNA表達(dá) 取生長旺盛期MRC-5細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞，加入1ml Trizol試劑提取總RNA。取1μl總RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系10μl：dNTP 0.5 μl，RNase inhibitor 1 μl，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μl，1×buffer 3 μl，加入ddH2O 補(bǔ)充至 10 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性 5 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，總計40個循環(huán)。ZEB2正向：5'-CGCATTTCCCCCTGCTACT-3'，反向：5'-TGGTCG TAGCCCAGGAATACTG-3'；GAPDH 正向：5'-GAGT CAACGGATTTGGTCGT-3'，反向：5'-CATGGGTGGA ATCATATTGGA-3'。定量分析結(jié)果以Ct值表示，以GAPDH作為內(nèi)參，2-△△Ct作為目的基因相對表達(dá)量。

1.3.5 CCK-8法檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性將細(xì)胞鋪于96孔板中（5×103個/孔），孵育24 h后，分別加入濃度為25、50、100及200 μg/ml的順鉑和25、50、100 及 200 μg/ml的紫杉醇，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，再向每孔中加入預(yù)先配置好的CCK-8試劑（10 μl/孔），37℃繼續(xù)孵育，于450 nm處檢測吸光度值。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞接種于96孔板中（1×106個/孔），培養(yǎng)24 h后加入抑制率最高濃度的順鉑、紫杉醇。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集貼壁細(xì)胞，加入70%乙醇于-20℃固定12 h，第2天棄去固定液，加入RNA酶反應(yīng)30 min，再加入5 μl PI染液染色30 min，上機(jī)檢測，每次實驗平行操作3次。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞接種于96孔板中（1×106個/孔），培養(yǎng)24 h后加入抑制率最高濃度的順鉑、紫杉醇。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集貼壁細(xì)胞，依次加入400 μl Annexin V和5 μl Annexin V-FITC染液，避光孵育15min，上機(jī)檢測，每次實驗平行操作3次。

1.3.8 Western blot檢測細(xì)胞P-gp、LRP蛋白表達(dá)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加入抑制率最高濃度的順鉑、紫杉醇。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取對數(shù)生長期細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入離心管中，再加入1ml RIPA裂解液置于冰浴上裂解30 min，4℃條件下離心15 min，BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白純度。將20μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂牛奶孵育封閉2 h。分別加入P-gp、LRP抗體，4℃孵育24 h。再滴加二抗37℃孵育2 h。PBS沖洗3次，按照ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒顯影，以β-actin作為內(nèi)參照，分析目的條帶相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。先進(jìn)行正態(tài)性分布和方差齊性檢驗。對符合正態(tài)性分布的計量資料，多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齊時多組間比較用Bonferroni法，方差不齊時用Welch近似F檢驗。計數(shù)資料比較用配對設(shè)計的四格表χ2檢驗。生存分析用Kaplan-Meier法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZEB2蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

ZEB2陽性主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒沉淀為陽性細(xì)胞（見圖1）。ZEB2蛋白在癌組織陽性表達(dá)率為77.8%（56/72），癌旁組織陽性表達(dá)率為23.6%（17/72），ZEB2蛋白在癌組織陽性表達(dá)率高于癌旁組織，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=42.258，P=0.000）。

圖1 ZEB2蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達(dá) （×200）

2.2 ZEB2表達(dá)與NSCLC患者臨床資料及預(yù)后的關(guān)系

ZEB2表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)，腫瘤直徑≥5 cm組ZEB2表達(dá)陽性率高于腫瘤直徑＜5 cm組，Ⅲ、Ⅳ期組ZEB2表達(dá)陽性率高于Ⅰ、Ⅱ組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組ZEB2表達(dá)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，中低分化組ZEB2表達(dá)陽性率高于高分化組，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見附表。72例非小細(xì)胞肺癌患者共有68例獲得完整隨訪，中位隨訪時間53.8個月，其中陰性組隨訪15例，陽性組隨訪53例。生存分析顯示，ZEB2陽性組總生存率和無病生存期低于陰性組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 抑制ZEB2表達(dá)對順鉑、紫杉醇作用后A549細(xì)胞生存率的影響

qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，ZEB2-siRNA組ZEB2 mRNA和蛋白表達(dá)水平低于ZEB2-NC組（P＜0.01），ZEB2-NC和Mock組ZEB2 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3A、B。提示轉(zhuǎn)染ZEB2 siRNA能夠抑制A549細(xì)胞ZEB2的表達(dá)。Mock組、ZEB2-NC組和ZEB2-siRNA組細(xì)胞存活率均隨順鉑、紫杉醇的濃度增加而降低，其中ZEB2-siRNA組細(xì)胞存活率低于ZEB2-NC組（P＜0.01），ZEB2-NC和Mock組細(xì)胞存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3C、D。

2.4 抑制ZEB2表達(dá)對順鉑、紫杉醇作用后A549細(xì)胞凋亡率的影響

經(jīng)順鉑、紫杉醇處理后，ZEB2-siRNA組細(xì)胞凋亡率高于Mock組和ZEB2-NC組（P＜0.01），ZEB2-NC、Mock組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 4A、B。

附表 ZEB2表達(dá)與NSCLC臨床資料的關(guān)系

圖2 ZEB2表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

圖3 不同濃度順鉑、紫杉醇作用后A549細(xì)胞生存率比較

2.5 抑制ZEB2表達(dá)對順鉑、紫杉醇作用后A549細(xì)胞周期分布的影響

經(jīng)順鉑、紫杉醇處理后，與Mock組、ZEB2-NC組比較，ZEB2-siRNA組G0/G1期百分率降低，S期百分率升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），ZEB2-NC和Mock組細(xì)胞周期率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 5。

圖4 順鉑、紫杉醇處理后A549細(xì)胞凋亡率變化

2.6 抑制ZEB2表達(dá)對順鉑、紫杉醇作用后A549細(xì)胞P-gp、LRP蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與Mock組、ZEB2-NC組比較，ZEB2-siRNA組P-gp、LRP蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），ZEB2-NC 和 Mock組 P-gp、LRP蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖5 順鉑、紫杉醇處理后A549細(xì)胞周期變化

圖6 順鉑、紫杉醇處理后A549細(xì)胞周期變化

3 討論

ZEB2是snail家族重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過BMP和TGF-β信號途徑調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。有研究[6]顯示，ZEB2通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）調(diào)控腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。SI等[7]報道稱乳腺癌組織ZEB2呈高表達(dá)，且ZEB2蛋白表達(dá)水平與乳腺癌分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。REN等[8]證實，ZEB2促進(jìn)EMT的發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞之間的黏附作用減弱，進(jìn)而誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究分別對NSCLC組織和癌旁組織ZEB2表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ZEB2蛋白在癌組織陽性率高于癌旁組織，且ZEB2表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，說明ZEB2具有NSCLC診斷和病情評估的潛在價值。有報道[9]稱，ZEB2高表達(dá)能夠抑制周期蛋白（cyclin），促進(jìn)抑癌蛋白磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。XIA等[10]報道稱ZEB2表達(dá)上調(diào)的肝癌患者生存時間明顯高于ZEB2低表達(dá)者，ZEB2對惡性腫瘤的預(yù)后評估具有重要指導(dǎo)作用。本研究對NSCLC患者進(jìn)行長期隨訪，結(jié)果顯示ZEB2陽性組總生存期和無病生存率低于陰性組，提示癌組織ZEB表達(dá)水平可以作為NSCLC預(yù)后的重要評估指標(biāo)。

手術(shù)聯(lián)合全身化療是治療NSCLC的主要手段。目前NSCLC細(xì)胞對多數(shù)化療藥物敏感，然而重復(fù)使用化療藥物極易出現(xiàn)抗藥性，導(dǎo)致發(fā)生MDR現(xiàn)象而使化療失敗，這亦是NSCLC遠(yuǎn)期生存率低的原因之一[11]。MADER等[12]也指出，NSCLC初期對化療藥物敏感，但很快發(fā)生耐藥而導(dǎo)致化療失敗，患者預(yù)后差，且極易復(fù)發(fā)，5年生存率低。腫瘤細(xì)胞MDR現(xiàn)象成為臨床亟待解決的問題。EMT是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生MDR的主要原因，有報道[13]顯示，乳腺癌細(xì)胞ZEB2表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致對5-FU耐藥。王慶海等[14]也認(rèn)為，ZEB2與卵巢癌的順鉑耐藥密切相關(guān)。本研究顯示抑制ZEB2表達(dá)后，順鉑、紫杉醇處理使A549細(xì)胞存活率降低，提示降低ZEB2表達(dá)可能提高A549細(xì)胞對化療藥物的敏感性。GAO等[15]采用CCK-8法分析顯示，轉(zhuǎn)染ZEB2-642的小細(xì)胞肺癌耐藥指數(shù)降低，降低ZEB2表達(dá)可降低小細(xì)胞肺癌的耐藥性。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)順鉑、紫杉醇處理后，ZEB2-siRNA組細(xì)胞凋亡率高于Mock組和ZEB2-NC組，化療藥物誘導(dǎo)凋亡率增加也說明細(xì)胞對化療藥物的耐藥性降低。國外有報道稱[16]，ZEB2調(diào)控的靶基因可能參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，進(jìn)而誘導(dǎo)耐藥。本研究進(jìn)一步對各組細(xì)胞的周期分布進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)順鉑、紫杉醇處理后，ZEB2-siRNA組G0/G1期所占百分率降低，S期所占百分率升高，說明抑制ZEB2表達(dá)促進(jìn)化療藥物對A549細(xì)胞在S期的阻滯，使化療藥物對細(xì)胞的殺傷作用增加，耐藥性降低。

MDR的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，耐藥蛋白的表達(dá)在該過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。P-gp和LRP是兩種重要的耐藥蛋白，P-gp通過將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度降低而誘導(dǎo)耐藥。劉俊等[17]報道，胰腺癌細(xì)胞P-gp高表達(dá)，可以選擇性的將依托泊苷、5-FU、長春新堿等化療藥物泵出細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生MDR。LRP能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的化療藥物重新轉(zhuǎn)運(yùn)至小囊泡內(nèi)排出細(xì)胞外，使細(xì)胞核DNA免受化療藥物的損傷而產(chǎn)生耐藥。梁夢等[18]報道，化療耐藥型卵巢癌患者LRP陽性率高于高于化療敏感型，LRP也是預(yù)測卵巢癌化療敏感的獨(dú)立預(yù)后因素。但是在非小細(xì)胞肺癌中，關(guān)于ZEB2和P-gp、LRP關(guān)系的研究尚未見報道。本研究顯示，經(jīng)過順鉑、紫杉醇處理后，ZEB2-siRNA組P-gp、LRP蛋白表達(dá)水平降低，提示ZEB2可能通過P-gp和LRP蛋白介導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生MDR。但是ZEB2與P-gp、LRP之間并不是孤立事件，很可能通過某種信號通路進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)而誘導(dǎo)耐藥，限于研究的篇幅，本研究暫未探討ZEB2與P-gp、LRP之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這也是筆者后續(xù)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，NSCLC組織ZEB2表達(dá)上調(diào)，抑制ZEB2可以降低耐藥蛋白P-gp、LRP表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)肺癌的多藥耐藥特性。

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（王榮兵 編輯）

Prognostic value of Zinc finger E-box-binding homeobox 2 in non-small cell lung cancer and its role in multidrug resistance

Zhi-bo Liu1,Chun-ling Liu2
(1.Department of Oncology,Affiliated Hospital of Qinghai University,Xining,Qinghai 810001,China;2.Department of Oncology,Qinhuangdao Haigang Hospital,Qinhuangdao,Hebei 066000,China)

ObjectiveTo investigate the prognostic value of Zinc finger E-box-binding homeobox 2(ZEB2)in non-small cell lung cancer (NSCLC)and its role in multidrug resistance.MethodsInin vivostudy,a total of 72 patients diagnosed with NSCLC were included in this study,and tumor tissue and adjacent normal tissue samples of them were collected. Expression of ZEB2 was measured by Immunohistochemical staining.Potential relationship between ZEB2 and clinic survival data was analyzed.Inin vitrostudy,genetic knockdown models of ZEB2 in A549 cells line were established by siRNA.Cells were divided into 3 groups:ZEB siRNA group,sequence control group,and negative control (Mock)group.Drug cytotoxicity was measured by CCK-8 assays after co-incubation with Cisplatin or Paclitaxel.Cell cycle and apoptosis rate was measured by flow cytometry.Expression levels of p-glycoprotein (P-gp)and LRP was determined by Western blot.ResultsZEB2 positive cells in cancer tissue was significantly increased when compared with normal tissue (77.8%vs 23.6%,P=0.000).ZEB2 positive cells in group with tumor diameter larger than 5 cm,Ⅲ～Ⅳ phase,lymphatic metastasis,and poor and middle differentiation were dramatically increased when compared with those in group with tumor diameter＜5 cm,Ⅰ～Ⅱ phase,metastasis-free,and well differentiation (P＜0.05),respectively.Overall survival and cancer-free survival in ZEB2 positive group was significantly lower than those in ZEB2 negative group (P＜0.05).Cellular survival of A549 cell line in Mock group,ZEB2-NC group and ZEB2-siRNA group was significantly decreased with treatment of Cisplatin or Paclitaxel in a dose-dependent manner.Cellular survival of A549 cell line in ZEB2-siRNA group was significantly lower than that of Mock group and ZEB2-NC group (P=0.000).Flow Cytometry data suggested that,after treatment with Cisplatin and Paclitaxel,cell apoptosis and S phase ratio increased while G0/G1phase ratio decreased significantly compared with those in Mock group and ZEB2-NC group (P=0.000).Expression levels of P-gp,LRP in ZEB2-siRNA group were significantly downregulated compared with Mock group and ZEB2-NC group (P=0.000)while no significant difference of P-gp,LRP protein between Mock group and ZEB2-NC group (P＞0.05).ConclusionZEB2 are up-regulated in NSCLC tissue,and inhibition of ZEB2 reverses the P-gp-and LRP-dependent multidrug resistance of NSCLC.

zinc finger e-box-binding homeobox;non-small cell lung cancer;prognosis;multidrug resistance;p-glycoprotein;lung resistance-related protein

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.008

1005-8982（2017）27-0037-08

2017-05-17